wb封閉用的牛奶用蒸餾水配

⑴ 做好westernblot需要注意各種細節，轉給需要的你！

做好Western需要注意各種細節。工欲善其事，必先利其器，首先還是從蛋白提取開始談起。

1.收樣前3min先配製細胞裂解液（現配現用），RIPA:蛋白酶抑制劑:磷酸酶抑制劑=99:1:1。6孔板收集蛋白每孔需200ul，計算用量。以收集六孔蛋白為例，按比例加入RIPA 1200ul，蛋白酶抑制劑12ul，磷酸酶抑制劑12ul，混勻後置於冰上。（我使用的試劑RIPA裂解液（中），蛋白酶抑制劑混合物（100×），蛋白磷酸酶抑制劑混合物（100×）均購自***公司）
2.棄掉舊的培養基，PBS洗三遍。
3.每孔加入200ul剛配好的裂解液，立即置於冰上，在搖床上裂解30min。

（全程在冰上操作）
1.將動物組織（腦、肺等）取出後分裝成三份或老散更多（一份WB，一份qPCR，一份備用），取出後立即存於-80℃。（註：取完一塊組織後立即凍存於-80℃，反復凍存樣品對待測蛋白有影響，最好用新鮮樣品實驗）
2.配製細胞裂解液（現配現用），組織:RIPA=1mg:10ul，可根據實際情況調整。RIPA:蛋白酶抑制劑:磷酸酶抑制劑=99:1:1。配好後置於冰上。
3.將其中一份組織剪下約90mg於有鋼珠的震盪勻漿器中勻漿。此勻漿器的蓋子或芯通常置於-20℃，使用時取出，操作應快捷，勻漿1min基本可保持溫度。
4.將勻漿加入90ul現配的裂解液中，冰上搖床裂解30min。

我採用的是***公司的BCA蛋白定量試劑盒測定提取蛋白濃度，和說明書protocol差別不大，稍有不同，如下：
1.稀釋BSA標准品以製作標准曲線：取7支EP管，每管加30ul生理鹽水，第一管加30ulBSA，混勻後再取30ul至第二管，依次倍比稀釋，最後一管不加為空白（即本底值）。則8個標准品的濃度分別為2ug/ul、1ug/ul、0.5ug/ul、0.25ug/ul、0.125ug/ul、0.0625ug/ul、0.03125ug/ul、0。

可提前配製：

戴好口罩和歷中手套，選用1.0mm玻板，用試管刷和洗潔精仔細刷洗玻板，清水沖洗干凈。卡槽對齊卡好後置於軟橡膠墊片上，夾緊，向板中加滿蒸餾水試板子是否漏液。觀察幾分鍾後若不漏液，將板子中水倒出，倒扣晾乾。

1.配製8ml 10%分離膠，依次向小燒杯中加入蒸餾水3.04ml，30%丙烯醯胺2.7ml，1.5M•pH8.8 2.0ml，10%SDS 80ul，10%AP 80ul，TEMED 3.2ul。加入TEMED混勻後立即灌膠，用1ml槍頭沿著玻板上沿從左至右輕輕將膠打入，以免膠濃度不均勻，避免氣泡產生。加完後換200ml槍頭從左至右更加小心加入蒸餾水水封，以免沖散剛灌的分離膠。靜置，當水和膠之間出現一條水平的折線時，即已凝固。
2.待分離膠凝固後，將水封的蒸餾水倒出，可將濾紙條放於玻板角吸水加快殘留水流出，倒置。配製4ml 5%分離膠，依次向小燒杯中加入蒸餾水2.7ml，30%丙烯醯胺670ml，0.5M•pH8.8 500ul，10%SDS 40ul，10%AP 40ul，TEMED 4ul。加入TEMED混勻後立即灌膠，同上用1ml槍頭從左至右輕輕加入濃縮膠，加滿後沖洗10孔梳子，水平輕輕插入濃縮膠中靜置待其凝固。可將剩餘的濃縮膠沿著梳子加入玻板中以完全密封。
3.此時，可將之前分裝好的煮過的加入loading buffer的蛋白樣品、預染的蛋白maker 和一小支loading buffer 置於4℃融化。
Little Trick
1.AP和TEMED均為神經毒性、致癌物質，使用時需小心。
2.灌膠時視線與膠面水平，注意操作，避免膠濺入眼睛中。
3.常溫下半小時膠可凝固，若天氣寒冷或需加快凝固，可將其置於37℃孵箱中，15min左右即可凝固。
4.若第二天早上立即跑膠，這樣就不耽誤午飯時間，可頭天晚上先把膠配好，凝固後取下玻板，連夾子、梳子一同放入蒸餾水中，4℃過夜保存。

1.將玻板卡緊電泳槽中，先在內槽加滿已配好的1×電轉液，十幾分鍾後觀察是否漏液，若漏液重新調整玻板，再次卡緊，直至不漏液為止。否則，可能膠還沒跑完，電轉液就漏完了。
2.輕輕拔去梳子，第一孔侍爛氏加入5ul預染的蛋白maker ，2~7孔依次加入20ul待測蛋白樣品，第8孔加入10ul提前融化的loading buffer。上樣時輕輕加入，注意不要將樣品加入其他孔，或加樣過快導致樣品溢出。
3.插好正負極，注意檢查正負極不能插反。調節電壓至80V（濃縮膠），跑0.5h後；將電壓調至100V（分離膠），約1.5h後，maker分離明顯，在膠底部出現一條藍色的buffer條帶，此時電泳完畢。使用完在實驗儀器使用本上做好登記。
注意：避免藍色條帶跑出分離膠，這樣有可能目的蛋白也已經跑出，所以在分離膠底部出現一條整齊水平的藍色條帶時，即停止電泳。
Little Trick
1.電泳時插好正負極後，從電泳槽底會有小氣泡上升，氣泡的數目和上升速率與電壓大小呈正比。若小氣泡和往常不太一樣，觀察幾分鍾後還是如此，則需檢查是否加錯了電泳液，或者電泳液配製有誤。
2.一般濃縮膠80V 0.5h，分離膠100~120V 1~1.5h，具體跑膠電壓和時間與目的蛋白大小、實驗儀器和實驗室環境都有關，需多次探索最佳條件。若目的蛋白較小，則盡量縮短跑膠時間，並及時觀察maker位置，避免目的蛋白跑出。我分別實驗了濃縮膠80V 0.5h，80V 1h，分離膠120V 1.5h，120V 1h，100V 1.5h，100V 1h，110V 1.5h，110V 1h，結果顯示在本實驗室實驗儀器下，我的目的蛋白及內參在濃縮膠80V 0.5h，分離膠100V 1.5h條件下，分離效果最好。在此條件下，我做了幾次重復實驗，結果均一致。因此，總結出本實驗室此目的蛋白的最佳電泳條件。
3.電泳的好壞直接影響到目的蛋白的顯影情況，尤其時磷酸化目的蛋白的二聚體，若電泳條件優化，結果可清晰顯出蛋白表達情況。所以探索最佳電泳條件是決定勝負關鍵一步。
4.電泳快結束時即可准備轉膜所需的濾紙和PVDF膜，浸泡在電轉液中。建議在第一次WB後分別剪好不同大小的硬紙片，標好面積和孔數（即樣品數），存好以後隨時使用。
5.WB中夾取PVDF膜最好使用平頭鑷子，並夾住膜左上角，可最大程度減小對膜上蛋白的損害。

電泳結束後，取出玻璃板，稍微沖洗，洗凈電泳槽，放好。輕輕撬開玻璃板，根據maker位置和目的蛋白分子量大小在玻璃板上切膠，為了防止切歪，可在玻璃板下墊上上述剪好的同切膠大小一致的硬紙片。一般一塊膠需切下目的蛋白和內參兩小塊膠，將切下的膠分別浸泡在電轉液中。

1.根據每一塊切膠的大小剪6張同樣大小的濾紙和一張PVDF膜，浸泡於電轉液中，可以提前准備好的硬紙片為模板剪。PVDF膜先經甲醇活化20s後浸泡於電轉液中。
2.在電轉儀上製作「三明治」結構轉移膜，最下面放三層濾紙，然後依次放PVDF膜，膠，三層濾紙，用玻璃棒輕輕趕走氣泡（注意上下三層濾紙之間不能接觸，否則易造成短路）。蓋上蓋子，根據膜的總面積調整電流，電轉2h。
3.在電轉的同時，可以配製以下液體，事先根據膜的數量計算好所需體積：
以一塊膜為例，封閉5ml+稀釋一抗4ml+稀釋二抗4ml，需要13ml，則配製15ml。
5% BSA溶液(w/v)：配製15ml 5% BSA溶液(w/v)，稱取0.75g BSA晶體，溶於15mlTBST中，漩渦振盪器混勻，現用現配，4℃保存（若目的蛋白為磷酸化蛋白時配製）。
5%牛奶(w/v)：配製15ml 5%牛奶(w/v)，稱取0.75g脫脂奶粉，溶於15ml TBST中，漩渦振盪器混勻，現用現配，4℃保存。
1×TBST洗液：使用時將100×TBST用雙蒸水稀釋至1×，常溫保存。
Little Trick
1.關於電轉膜，有些使用NC膜。我沒有嘗試過NC膜，但隔壁實驗室使用NC膜多次WB結果仍不理想，換用PVDF膜後有所改善。因此建議還是使用PVDF膜，可購買Millipore的PVDF膜，一卷有些貴，但是可以夠一個實驗室用好幾年哪。最好不要在經銷商購買分裝的的PVDF膜，另一實驗室一同學想著價格便宜也就只做幾次，就從試劑公司只買了100cm2的膜，結果這價格虛高不說，而且膜還是假的，直到做完實驗了才發現，蛋白樣品也浪費了。所以建議還是購買Millipore公司原裝的PVDF膜。
2.關於電轉方式，有些採用濕轉，有些採用半干轉，兩種方式均可。個人覺得半干轉方便簡捷些。

1.電轉結束後，根據maker位置和目的蛋白及內參大小剪膜。可在標有maker的一邊左上角剪一個小角，以清楚哪一條帶是1號樣品。
2.分別用已配好的5% BSA和5%牛奶封閉目的蛋白和內參，室溫搖床上孵育2h。根據盒子大小，加入封閉液的量需沒過膜。

1.配製p-STAT1一抗（ 公司），1:500稀釋，加入上述配製的5% BSA 4ml，再加入8ul p-STAT1一抗，混勻，現配現用。
配製actin一抗（ 公司），1:2000稀釋，加入上述配製的5%牛奶4ml，再加入2ul actin一抗，混勻，現配現用。
2.將PVDF膜從封閉液中取出，可用平頭鑷子小心放入塑料手套的手指中，加入一抗，封口，使膜完全浸泡在一抗中，放入冰箱，4℃過夜。我一般用封口膜做成小盒，置於大玻璃平皿中，放入PVDF膜，用槍從上到下向膜上加一抗，完全浸沒，之後和PCR上樣儀一同固定在搖床上，4℃孵育過夜。

次日，回收一抗，做好標記，-20℃保存，可再使用3~4次。將膜放入1×TBST中，搖床上清洗三次，每次10min。

1.配製具有種屬特異性的HRP標記的二抗（抗鼠或抗兔），1:2000稀釋，加入上述配製的5%牛奶4ml，再加入2ul 二抗，混勻，現配現用。
2.TBST洗完膜後，加入二抗，室溫搖床上孵育2h。

1.二抗孵育完後，回收，-20℃保存。1×TBST搖床上洗膜三次，每次10min。
2.一條目的蛋白即一張膜需要100ul發光液A和100ul發光液B，根據膜數計算用量，提前4℃混合好發光液A和B。
3.到暗室中加混合好的發光液，在膠片左上角剪一小角（和PVDF膜一致），曝光膠片，可分別不同時長曝光，如15s，30s，1min，5min等，然後在顯影液和定影液中顯影，放入自來水中。出暗室後，將膠片掛起晾乾。
也可用Bio-rad凝膠成像系統照相，選擇不同的曝光時間成像。
Little Trick1.需通過不同曝光時間探索某蛋白最佳曝光時間，多次重復實驗即可採用此曝光時長。我最開始也是在暗室中顯影，後來用Bio-rad凝膠成像系統照相，對比結果發現後者的結果更加清晰明顯，背景也更加干凈，之後就一直用成像儀曝光照相了。
2.夾取膠片可用普通鑷子，但也只夾膠片左上角，避免損害膠片上曝光的蛋白條帶。
3.膠片左上角maker一側一定要剪一小角或做其它標記，才可在顯影後明顯對應各個樣品。
4.若暗室曝光，可能內參蛋白發光液剛加上就出現很亮的條帶，這時最長曝光15s已經足夠。

若顯影效果不好，可將膜重生，再次顯影，省去了配膠、電泳和電轉等步驟。
1.加4ml蛋白印跡膜再生液，室溫搖床30min。

⑵ wb洗膜配置

wb洗膜配置1X轉膜緩沖液採用甘氨酸2.9g、Tris 5.8g、SDS 0.37g、濃鹽酸1.8 ml 、蒸餾水至800ml、加甲醇200ml定容至1000ml。
10X 轉膜緩沖液的配置是甘氨薯掘酸151.1g、Tris 30.3g、蒸餾水至1000ml
溶解後室溫保存，用時並罩稀釋10倍，並加入甲醇至20%。通常取80ml母液，加560ml蒸餾水，最後加160ml甲醇，配製絕手鬧成800ml即可。（先加甲醇易產生沉澱）。

⑶ southern blot 牛奶封閉液如何配置

Southern Blot 為什麼要配牛奶封閉液啊？是最後孵育的一部要加抗體嗎？
如果是封閉抗體的話，一般就配5%的脫脂奶粉，5%多半指的是個g/100ml。也就是5g奶粉，100ml水的比例，完全溶解即可。如果擔心牛奶裡面有小顆粒沒有溶解，可以用0.22um的膜過濾一下，防止有顆粒在膜上形成斑點的背景。

⑷ wb脫脂牛奶怎麼配

wb脫脂牛奶怎麼配，方法如下：
可以採用物理中的離心法，將新鮮牛奶煮沸後，放入冰箱中冷卻，等待一段時間後便可取出，取出後便發如陪現牛奶表面有一層膜，使用勺子或者吸管將上層膜取出便可製成脫脂兄橡戚牛奶，但這並沒有完全將牛奶中的脂肪取出，若想完全取出則需要重復以上步驟三到四次才可製成，這種方法只適用於家用，脂肪的含量羨陵達到最低，並不是意義上的完全脫脂。

⑸ 封閉劑的使用方法

1．配比
封閉劑:蒸餾水或（純凈的自來水）=1:5-20
PH值：=6.5～7.5
2．建議開槽溫度：常溫～60℃，工件浸泡1～3分鍾，並輕微振動，取出常溫晾乾、甩干或烘乾均可。
3．本產品為濃縮液，可根據用戶產品特性配製不同濃度的工作液。 濃 度 處理後工件表面狀態 耐鹽霧（中性）能力 5% 干膜 18-28小時不長銹 10% 幾乎沒有油感 24-50小時不長銹 20% 輕微油感 50-124．5小時不長銹 產品簡介
封閉劑是由有機緩蝕劑、表面活性劑、水溶性高分子聚合物等材料組成，具有良好的分散性、成膜性和封閉能力，金屬浸塗後經固化成膜，膜層平整豐滿、透明光亮、耐磨耐蝕，從而有效地隔絕環境中的浸蝕性介質對金屬零件的腐蝕。本品不含有毒有害物質，絕對環保。
封閉劑：封閉作業的主要內容是封閉劑的選擇和施工方法。
性能特點
●常溫自干，使用方便快捷。
●膜層緻密、均勻、穩定、光亮、吸附力強，耐久。
●膜層的耐蝕性好，鹽霧性好，耐磨性也好。
●為水基型產品，無毒、無燃燒和爆炸危險，安全環保，經濟實用。
技術指標
1、外觀 無色至淡黃色透明液體
5、工藝流程
①．徹底去除基材表面的油污、灰塵和銹蝕。
②．原液浸泡3-5分鍾或噴塗、刷塗。
③．用烘箱60-80℃乾燥15-30分鍾或常溫自干4-8小時。
注意事項
1、使用前要徹底清除基材表面的油污、灰塵和銹蝕。
2、若不慎濺入眼睛，即用清水或生理鹽水沖凈；禁止食用。
包裝及貯藏
25kg/桶、50kg/桶的包裝。密封存放，若存放二年後試塗，若漆膜質量合格，仍可使用。

⑹ 如何配置封閉用液

1、封閉液的選用要求

1）常用封閉液為脫脂牛奶（光明或伊利等）、牛血清白蛋白（BSA）、無蛋白封閉液等

2) 封閉液濃度：封閉襪納時一般用5%脫脂牛奶，也可用1-5%BSA或1%無蛋白封閉液；配製虛好塵二抗稀釋液一般為差禪1-5%脫脂牛奶，全部用PBS稀釋

3) 封閉時間：室溫1-2h、4度過夜或37度半小時

4) 封閉液pH：一般5%脫脂牛奶pH大約為6.0-6.5左右，而1%脫脂牛奶可能6.5-7，好像RD公司的WB-Protocol中要求封閉液和稀釋抗體的封閉液需要調pH至7.4；但是大多數抗體不調pH也可以做出來

5) 個人經驗：5%脫脂牛奶封閉效果最佳，但有時也可能封閉過度，可以與BSA或無蛋白封閉液輪流更換

⑺ 求封閉液中1%的BSA是怎麼配製

取1g BSA，加蒸餾水，定容到100ml就行了。

最常用的封閉劑是0.05%-0.5%的BSA，封閉是否必要，取決於ELISA的模式及具體的實驗條件。並非所有的ELISA 固相均需封閉，封閉不當反而會使陰性本底增高。

一般說來，雙抗體夾心法，只要酶標記物是高活性的，操作時洗滌徹底，不經封閉也可得到滿意的結果。

特別是用單抗腹水直接包被，因其中大量非抗體蛋白在包被時同樣也吸附在固相表面，業已起到了類似封閉劑的作用。但在間接法測定中，封閉一般是不可少的。

(7)wb封閉用的牛奶用蒸餾水配擴展閱讀：

判斷封閉條件，要考慮在此條件下是否能達到試驗要求，即棋盤滴定要滿足：陽性樣品OD=0.8、陰性樣品OD<=0.1，而不是看你待測樣品OD變化趨勢;

過低封閉濃度勢必造成本底過高，但過高又會使靈敏度降低，因此只要選擇能夠滿足你試驗要求的最低BSA濃度就可以了。

另外提醒，洗滌一定要徹底，很重要的。

包被後封閉前一般要洗滌一遍，以便於洗掉結合不牢固的包被物，防止在實驗中影響實驗結果;封閉後一定不要洗滌，封閉的目的就是要靠蛋白填補未被包被物佔領的空間，另外封閉液一般也具有保護作用。

如果不是用biotin-avidin系統的話，用5%脫脂奶粉做封閉液就可以了，廉價，效果也很好。

封閉液一般是用5%的BSA或者是用5%的脫脂奶粉，溶劑一般使用TBST。做實驗的時候，我一直強調這樣的一個原理，那就是在了解原理的基礎之上，我們完全可以不拘泥於書本，進行創造。就拿這個封閉液來講，要是單純的一種封閉效果仍然不好的話，我們完全可以兩種合用，我就試過1%的BSA和5%的脫脂奶粉合用進行封閉的事例。所以，搞科學研究是需要我們進行再創造的。

D、BSA交聯抗原注射到兔子體內得到一抗，我們Elisa的二抗用的是羊抗兔HRP標記的二抗。請問，在封閉時，用什麼樣的封閉液比較好呢?是無蛋白封閉液，還是羊的免疫前血清?

⑻ wb的牛奶能用水配嘛

牛奶可以加水稀釋喝，但是一般不建議這么做，牛奶裡面含有蛋白質、鈣等營養成激物腔分，加水後會導致蛋白質稀釋含量降低，若螞兆是覺得牛奶太過濃郁影響口感，可以在喝完之後喝些清水將味道沖散。牛奶是最古老的天明衫然乳製品之一，營養豐富，被稱為「白色血液」。

⑼ 封閉液為什麼用TBST而不是雙蒸水溶解牛奶

封閉液為什麼用TBST而不是雙蒸水溶解牛奶
潤滑脂是將稠化劑分散於液體潤滑劑中所組成的一種穩定的固體或半固體產品,其中可以加入旨在改善潤滑脂某種特性的添加劑及填料。潤滑脂在常溫下可附著於垂直表面不流失,並能在敞開或密封不良的摩擦部位工作,具有其它潤滑劑所不可替代的持點。因此,在汽車和工程機械上的許多部位都使用潤滑脂作為潤滑材料。

⑽ western牛奶封閉液怎麼配

推薦用TBST進行稀釋獲得5%的牛奶封閉液（5g/100mL）。

拓展：

一、牛血清白蛋白(BSA)，又稱第五組分，是牛血清中的一種白蛋白，包含583個氨基酸殘基，分子量為66.430 kDa，等電點為4.7。牛血清白蛋白在生化實驗中有廣泛的應用，例如在western blot中作為Blocking agent;在酶切反應緩沖液中加入BSA，通過提高溶液中蛋白質的濃度，對酶起保護作用。防止酶的分解和非特異性吸附，能減輕有些酶的變性，能減輕有些不利環境因素如加熱，表面張力及化學因素引起的變性。

二、用途說明

1、 在酶切反應緩沖液中加入BSA，通過提高溶液中蛋白質的濃度，對酶起保護作用。防止酶的分解和非特異性吸附，能減輕有些酶的變性，減輕不利環境因素如加熱，表面張力及化學因素引起的變性的。

2 、ELISA中也常常用到，比如封閉液，樣本稀釋液，酶結合物稀釋液都可以用BSA。

3、生化研究，遺傳工程和葯物研究。