蒸餾水煮沸法抗原修復

Ⅰ 求免疫組化冰凍切片熒光染色具體流程

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石蠟切片免疫組化染色步驟

石蠟切片免疫組化染色步驟
1、載玻片的處理： 抗原修復過程中，由於高溫、高壓、輻射等諸多因素的影響，極易造成脫片。為保證試驗的正常進行，可選用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等幾種試劑，對已清洗的載玻片進行處理。具體方法如下：
1.1 APES：現用現配。將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的APES中，停留20~30秒鍾，取出稍停片刻，再入純丙酮溶液或蒸餾水中涮去未結合的APES，置通風櫥中晾乾即可。用此載玻片撈片時應注意組織要一步到位，並盡量減少氣泡的存在，以免影響染色結果。
1.2 HistogripTM：將洗凈的玻片放入以1:50比例丙酮稀釋的Histogrip液中，停留1~2分鍾，然後用雙蒸水快速清洗三次，室溫乾燥或60oC烤箱烘烤一小時，裝盒備用。
1.3 Poly-L-Lysine：將洗凈、乾燥的載玻片放入以1:10比例去離子水稀釋的多聚賴氨酸溶液中，浸泡5分鍾，60oC烤箱烘烤一小時或室溫過夜乾燥。裝盒備用。試驗中使用的器具均為非玻璃製品。 2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶：一般使用濃度為0.05%~0.1%，消化時間為37℃、10~40分鍾，主要用於細胞內抗原的顯示。
2.2 胃蛋白酶：一般使用濃度為0.4%，消化時間為37℃、30~180分鍾，主要用於細胞間質抗原的顯示，如：Laminin（層粘蛋白），Collagen IV（IV型膠原）等。
g/ml的saponin溶液，消化時間為室溫孵育30分鍾。 2.3 皂素（Saponin）：一般使用濃度為2~10 3、抗原熱修復： 可根據實驗室的具體條件，選用微波爐抗原修復、高壓鍋抗原修復或水浴高溫抗原修復。抗原熱修復可選用各種緩沖液，如TBS、PBS、重金屬鹽溶液等，但實驗證明，以0.01M枸櫞酸鹽緩沖液（pH6.0）效果最好。請選用我公司提供的ZLI-9064 枸櫞酸鹽緩沖液（粉劑）配製，取該粉劑一包溶於1000ml的蒸餾水中，混勻，其pH值在6.0 0.1，如因蒸餾水本身造成的pH值偏差，請自行調整。
3.1 石蠟切片微波爐抗原修復操作方法：切片脫蠟至水後，3％H2O2處理10分鍾，蒸餾水洗2分鍾×3。將切片放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，置微波爐內加熱使容器內液體溫度保持在92℃~98℃之間並持續10~15分鍾（注意：無論是使用醫用或家用微波爐，請根據具體機型酌情設置條件，務必滿足以上步驟中對溫度和時間的要求）。取出容器，室溫冷卻10~20分鍾（注意：不可將切片從緩沖液中取出冷卻，以便使蛋白能夠恢復原有的空間構型）。PBS洗，下接免疫組化染色步驟。
3.2 石蠟切片高壓抗原修復操作方法：切片脫蠟至水。將1500ml~3000ml的枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）注入不銹鋼壓力鍋中加熱至沸騰。切片置於金屬架上，放入鍋內，使切片位於液面以下，蓋鍋壓閥。當壓力鍋開始慢慢噴氣時（約加熱5~6分鍾後），計時1~2分鍾，然後將壓力鍋端離熱源，冷水沖至室溫後，取下氣閥，打開鍋蓋，取出切片，蒸餾水洗後，PBS洗2分鍾×3，下接免疫組化染色步驟。
3.3 石蠟切片電爐煮沸抗原修復操作方法：切片脫蠟至水後，放入盛有枸櫞酸鹽緩沖液（工作液）的容器中，並將此容器置於盛有一定數量自來水的大器皿中，電爐上加熱煮沸，從小容器的溫度到達92℃~98℃起開始計時15~20分鍾，然後端離電爐，室溫冷卻20~30分鍾，蒸餾水沖洗，PBS洗，下接免疫組化染色步驟。 4、免疫組化染色步驟： （以美國ZYMED公司SP試劑盒為例）
石蠟切片脫蠟至水。
3%H2O2室溫孵育5~10分鍾，以消除內源性過氧化物酶的活性。
蒸餾水沖洗，PBS浸泡5分鍾，(如需採用抗原修復，可在此步後進行)。
5~10％正常山羊血清（PBS稀釋）封閉，室溫孵育10分鍾。傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小時或4℃過夜。
PBS沖洗，5分鍾×3次。
滴加適當比例稀釋的生物素標記二抗（1%BSA-PBS稀釋），37℃孵育10~30分鍾；或滴加第二代生物素標記二抗工作液，37℃或室溫孵育10~30分鍾。
PBS沖洗，5分鍾×3次。
滴加適當比例稀釋的辣根酶標記鏈霉卵白素（PBS稀釋），37℃孵育10~30分鍾；或第二代辣根酶標記鏈霉卵白素工作液，37℃或室溫孵育10~30分鍾。
PBS沖洗，5分鍾×3次。
顯色劑顯色（DAB或AEC）。
自來水充分沖洗，復染，封片。
冰凍切片免疫組化染色步驟
m，室溫放置30分鍾後，入4℃丙酮固定10分鍾，PBS洗，5分鍾×3。用3％過氧化氫孵育5~10分鍾，消除內源性過氧化物酶的活性。PBS洗，5分鍾×2。冰凍切片4~8

免疫組化非特異性染色的消除方法
一、非特異性染色的主要因素
組織的非特異性染色的機理很復雜，其產生的原因主要可分為以下幾點：
（1）一部分熒光素未與蛋白質結合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去
。
（2）抗體以外的血清蛋白與熒光素結合形成熒光素脲蛋白，可與組織成分結合。
（3）除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原（如Forssman氏抗原），可與組織中特異性抗原以外之之相應抗體結合。
（4）從組織中難於提純抗原性物質，所以制備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體，以致容易混淆。
（5）抗體分子上標記的熒光素分子太多，這種過量標記的抗體分子帶過多的陰離子，可吸附於正常組織上而呈現非特異性染色。
（6）熒光素不純，標本固定不當等。 二、消除非特異性染色的方法
消除熒光抗體非特異性染色的方法應根據產生的原因採取適當的方法，常用的方法有以下幾種：
（一）動物臟器粉末吸收法
常用肝粉（豬、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠腦粉和雞胚粉等。每毫升熒光抗體中加入肝粉50～100mg,在離心管中充分混勻，在室溫中振動2h，4℃中過夜，再攪拌10min，高速離心（3000～15000r/min）30min，1～2次後，即可使用其上清液。吸收一般應在臨用前進行，吸收後之熒光抗體保存冰箱中勿超過2周。染色應作吸收前後之比較，吸收時可先用緩沖鹽水將組織乾粉浸濕，離心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入熒光抗體進行吸收，以免消耗過多的抗體。
肝粉或新鮮細胞吸收是一種非特異性的消除方法，對熒光抗體的熒光色素和蛋白都有吸附作用。如檢查組織中的病毒抗原時，也可用相同的組織乾粉或勻漿沉澱物吸收之。
用臟器肝粉吸收對熒光抗體損失較多，如果根據Hiramotos氏等的方法將組織的20%生理鹽水勻漿液，用生理鹽水洗2～3次，12000r/min
10min離心沉澱，用其沉澱物吸收其熒光抗體即能完全達到目的，京極方久氏認為這樣吸收對熒光抗體幾乎沒有損失，他們常用此法，效果甚佳，吸收後放置一周左右，用時有必要再吸收一次。
【肝粉的製法】
（1）將若干只小白鼠或大白鼠放血殺死，取出肝臟，用生理鹽水洗2～3次，除去血液，剝掉表面的結締組織的脂肪。
（2）剪碎，用生理鹽水反復洗滌至無血色止，然後再加生理鹽水少許，用組織搗碎機或勻漿器作成勻漿。
（3）將肝勻漿裝入離心管內（1/3左右），交換地用2～3倍量生理鹽水和丙酮反復洗滌各三次，至上清無血色止，每次完畢先用2000r/min離心沉澱15 min後，再除去上清液。
（4）最後用丙酮洗滌肝漿，再用布氏漏斗過濾，或離心沉澱，將沉澱物平鋪在潔凈的玻璃板上，37℃烤乾（過夜）。
（5）在乳缽中充分研磨，用120目銅篩篩選過後，分裝，密封，低溫乾燥保存。
2006-12-22 13:24 wifgw
二）透析法
熒光素如FITC分子可以通過半透膜，而蛋白質大分子不能透過，可將未與蛋白結合的熒光素透析除去。
（1）將標記完畢的熒光蛋白液裝入一透析袋或玻璃紙袋內，液面稍留空隙，緊扎。
（2）浸入0.02mol/pH
7.1～7.4的PBS中（懸於大於標記物體積約50～100倍的PBS內），在4℃中透析，每日更換3～4次PBS，約5～7天，透析液中無熒即可（在熒光光源照射下）。
（三）葡聚糖凝膠G-50柱層析法
除游離熒光素可用2×46cm柱層析法，詳細方法參閱第二章。加入熒光抗體15～18ml（按床體積的5%～10%加樣），使其緩慢滲入柱內，待即將全部入柱時，加入PBS少許，關閉下口，停留30～40min ，使游離熒光充分進入細篩孔中，然後再接通洗脫瓶開始滴入洗脫液。加入洗脫液一定量後，熒光抗體即向下移行，逐漸與存留於上端的游離熒光素之間拉開明顯的界線，隨著大量洗脫液的不斷加入，二者分離距離越來越大，熒光抗體最先流出，分前、中、後三部分收集，測F/P比值，合格者合並，濃縮，分裝。洗脫液用20%磺基水楊酸測定蛋白（發生沉澱反應），繼續洗脫，游離熒光素則相繼被洗脫下來，至洗脫液中無蛋白和熒光素後，此層析柱即可再用。
若用以除去熒光抗體中的游離熒光素和硫酸銨等鹽類，可先在過柱前透析一夜，否則，NH4+太濃，在蛋白未完全洗脫時即出現NH4+，因而影響提純與回收蛋白，一般待洗脫液出現蛋白時，即進行收集，之後出現SO4++（用1%BaCl2檢查發生白色沉澱）。最後是NH4+，（用納氏試劑檢查呈黃棕色沉澱），待洗脫液無SO4++及NH4+後可再用。
如僅用小量熒光抗體，可用1×20cm的柱層析柱，取2g Sephadex G-50裝柱，即可過濾2～3.5ml熒光抗體。
（四）DEAE纖維素柱層析法
標記過多或過少熒光素的抗體分子可用DEAE-纖維素柱層析法除去。方法如下： DEAE-纖維素柱的裝柱，洗脫、再生方法等與提純IgG方法相同。裝柱所需DEAE-纖維素量以乾重每克交換20～50mg標記蛋白量為宜
。常用梯度洗脫法如下：
（1）層析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡，標記物上柱後，先用0.01mol/L、pH7.2PB洗脫，洗出無色或淡綠色液體，洗脫液量（根據床體積大小每梯度乘3），然後依下列各種離子強度洗脫液，
分別洗脫和收集：
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/L NaCl）……洗脫部分1。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/L NaCl）……洗脫部分2。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/L NaCl）……洗脫部分3。
將此三部分收集液（每管5ml）分別測定其F/P比值，0.05mol/L NaCl pH7.2PB洗脫液280nm光密度高峰管合並，濃縮保存備用。因這部分非特異性染色熒光最少，是比較好的熒光抗體。其他兩部分可以廢棄。
（2）柱上吸附的過度標記蛋白可繼續增加NaCl的濃度至
2.0mol/L洗脫完。
經過DEAE-纖維素層析後的標記抗體，其抗體量一般約損失50%，因此有些要求不太高的抗體，如抗細菌熒光抗體，不一定要這樣處理，可用染色效價測定的稀釋法除去非特異性染色。
（五）熒光抗體稀釋法
先測定熒光抗體特異性染色與非特異性染色的效價，若二者效價相差較大，則可將熒光抗體稀釋至一臨界濃度，使特異性染色呈陽性，而使非特異性染色保持陰性，稀釋方法和染色效價測定方法相同。
（六）純化抗原法
用各種方法提純單一成分的抗原是產生單價特異性抗體的最主要條件。近代免疫化學技術（免疫吸收法）和柱層析法等提供了很大的可能性，可參考有關專著。
（七）純化抗體法---免疫吸收法
例如抗IgA血清的純化方法---免疫吸收法。如分泌型IgA（ SIgA）抗原純度不高，所制的抗血清常與IgG呈交叉反應，為此需要吸收，常採用純化的人IgG戊二醛聚合物加以吸收純化。方法如下：
1．人IgG聚合物的制備 在5ml含40mg/ml人IgG的0.1mol/L pH7.0磷酸緩沖溶液中，加入2.5%戊二醛溶液1ml，邊加邊攪，5min即出現混濁，逐現大塊膠塊，放置30min後，用研缽將凝膠磨細，繼用1.0mol/L pH7.0磷酸緩沖溶液反復洗滌3次，末次加蒸餾水至20ml，即為人IgG聚合物懸液。
2．免疫吸收法 將待吸收的抗SIgG血清加入待量IgG聚合物懸液，置室溫攪拌60min,離心沉澱，上清液即稀釋1倍的純化抗SIgA血清。如用IgG聚合物作少量分次吸收，其效果更好。
（八）伊文氏藍（Evans blue）襯染法
用0.01%伊文氏藍的0.01mol/L pH7.2PBS稀釋熒光抗體，可將背景細胞和組織染色，呈紅色熒光，與特異性黃綠色熒光形成鮮明的對比，減少了非特異性熒光，宜作常規應用。伊文氏藍一般先配成1%溶液，保存於4℃，用前再稀釋至0.01%用以
和然釋熒光抗體。
此外，還可以用胰酶消化組織切片或用10%牛血清蛋白封閉法等消除非特異性染色，提高特異性染色。

Ⅱ 蒸餾水可以燒開喝嗎它對身體有什麼好處

蒸餾水可以煮沸飲用，但不建議長期飲用。蒸餾水是經過多層處理的水，以去除水中的微生物、細菌和礦物質。它經常被用於制備葯物和化學實驗。蒸餾水是純水，但許多水經過反復處理，可能產生對人體有害的成分。所以蒸餾水可以煮沸後飲用，但不宜長期飲用，以免影響身體。長期飲用蒸餾水，會導致人體內無機鹽的流失，同時也失去了從水中獲取人體所需微量元素的機會，可以喝工業蒸餾水，對身體還是有害的。蒸餾水是將飲用水經過高溫煮沸後，從上層水蒸氣中凝結出來的水。

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Ⅲ 求助HE染色和免疫組化

• HE染色是應用最廣泛的組織病理學常規染色技術。
  一染色程序
  1．石蠟切片HE染色（常規HE染色）
  （1）二甲苯Ⅰ 5～10min
  （2）二甲苯Ⅱ 5～10min
  （3）無水乙醇Ⅰ 1～3min
  （4）無水乙醇Ⅱ 1～3min
  （5）95%乙醇Ⅰ 1～3min
  （6）95%乙醇Ⅱ 1～3min
  （7）80%乙醇 1min
  （8）蒸餾水 1min
  （9）蘇木素液染色 5～10min
  （10）流水洗去蘇木素液 1min
  （11）1%鹽酸-乙醇 1～3s
  （12）稍水洗 1～2s
  （13）返藍（用溫水或1%氨水等） 5～10s
  （14）流水沖洗 1～2min
  （15）蒸餾水洗 1～2min
  （16）0.5%伊紅液染色 1～3min
  （17）蒸餾水稍洗 1～2s
  （18）80%乙醇 1～2s
  （19）95%乙醇Ⅰ 2～3min
  （20）95%乙醇Ⅱ 2～3min
  （21）無水乙醇Ⅰ &, nbsp; 3～5min
  （22）無水乙醇Ⅱ 3～5min
  （23）石炭酸-二甲苯 3～5min
  （24）二甲苯Ⅰ 3～5min
  （25）二甲苯Ⅱ 3～5min
  （26）二甲苯Ⅲ 3～5min
  （27）中性樹膠封固
  註：①（12）和（13）項可省去，但（14）的沖水時間需延長至10～15min（細胞核顯示更清晰）。
  ②（23）項可用無水乙醇代替；北方地區可省略。
  2．冰凍切片HE染色
  （1）冰凍切片固定 10～30s
  （2）稍水洗 1～2s
  （3）蘇木素液染色（60℃） 30～60s
  （4）流水洗去蘇木素液 5～10s
  （5）1%鹽酸-乙醇 &n, bsp; &nbs, p; &nb, sp; 1～3s
  （6）稍水洗 1～2min
  （7）返藍（用溫水或1%氨水等） 5～10s
  （8）流水沖洗 15～30s
  （9）0.5%伊紅液染色 1～2min
  （10）蒸餾水稍洗 1～2min
  （11）80%乙醇 1～2min
  （12）95%乙醇 1～2min
  （13）無水乙醇Ⅰ 1～2min
  （14）無水乙醇Ⅱ 1～2min
  （15）石炭酸-二甲苯 2～3min
  （16）二甲苯Ⅰ 2～3min
  （17）二甲苯Ⅱ 2～3min
  （18）中性樹膠封固
  註：①（7）和（8）項可省去，但（9）的沖水時間需延長至10～15min（細胞核顯示更清晰）。
  ②（15）項可用無水乙醇代替；北方地區可省略。
  二染色結果：細胞核呈藍色，細胞漿、肌纖維、膠原纖維和紅細胞呈不同程度的紅色。鈣鹽和細菌可呈藍色或紫藍色。
  三染色注意事項
  1．切片染色前，應徹底脫蠟。
  2．用含有升汞液體固定的組織，其切片染色前應先脫去汞鹽：
  （1）石蠟切片脫蠟至水洗
  （2）Lugol液 20min
  （3）流水沖洗 5min
  （4）95%乙醇 10min
  （5）水洗 1min
  （6）5%次亞硫酸鈉水溶液 5min
  （7）流水沖洗 5min
  （8）顯微鏡觀察除汞滿意後，轉入HE染色
  3．脫除福爾馬林色素（必要時）：
  （1）石蠟切片脫蠟至水洗
  （2）1%NaOH(1ml)與80%乙醇（99ml）混合液 10min
  （3）流水沖洗 5min
  （4）轉入HE染色
  4．嚴格執行HE染色流程，用顯微鏡控制細胞核的蘇木素染色質量。HE染片應著色鮮艷，紅、藍分明，對比清晰。
  5．載玻片自二甲苯中取出後，應立即用潔凈、光亮的蓋玻片和稠度適宜的中性樹膠濕封載玻片。封蓋處內無氣泡，外無溢膠。封片時必須進行操作人員和局部環境的二甲苯污染防護。不應將組織切片烤乾或風干後再行封片。
  6．必須在載玻片的一端牢貼標簽。標簽上應印有病理科所在的醫院名稱。標簽上應清楚顯示有關的病理號及其亞號；標簽上的病理號應准確無誤，無塗改。
  7．製片完成後，技術人員應對切片與其相應的病理學檢查記錄單或取材工作記錄單認真進行核對；確認無誤後，將制備好的切片連同相關的活檢申請單/活檢記錄單以及取材工作單等一並移交給有關的病理醫師；交接雙方經核對無誤後，辦理移交簽字手續。
  8．石蠟切片-HE染色的優良率（甲、乙級切片所佔的比率）應≥85%。石蠟切片-HE染色質量的基本標准列於附表。
  9．製片工作一般應在取材後2個工作日內完成（不含進行脫鈣、脫脂等需要特殊處理的標本）。
  10．製片過程出現意外情況時，技術室人員應及時向病理醫師和科主任報告，設法予以補救。
  
  附表 常規石蠟包埋-HE染色切片質量的基本標准
  優 質 標 准 滿 分 質 量 缺 陷 減 分
  ⒈組織切面完整， ①組織稍不完整：減1～3分②不完整：減4～10分
  內鏡咬檢、穿刺標本切面數 10 ③未達到規定面數：減5分
  
  ⒉切片薄(3～5μm)，厚薄均勻 10 ①切片厚(細胞重疊)，影響診斷：減6～10分
  ②厚薄不均勻：減3～5分
  
  ⒊切片無刀痕、裂隙、顫痕 10 ①有刀痕、裂隙、顫痕，尚不影響診斷：減2分
  ②有刀痕、裂隙、顫痕，影響診斷：減5分
  
  ⒋切片平坦，無皺褶、折疊 10 ①有皺褶或折疊，尚不影響診斷：各減2分
  ②有皺褶折或折疊，影響診斷：各減5分
  
  ⒌切片無污染 10 有污染：減10分
  
  ⒍無氣泡（切片與載玻片間/ 10 ①有氣泡：減3分
  蓋片與切片、載玻片間）， ②膠液外溢：減3分
  蓋片周圍無膠液外溢
  
  ⒎透明度好 10 ①透明度差：減1～3分
  ②組織結構模糊：減5～7分
  
  ⒏細胞核與細胞漿染色對比清晰 10 ①細胞核著色灰淡或過藍：減5分
  ②紅(細胞漿)與藍(細胞核)對比不清晰：減5分
  
  ⒐切片無鬆散，裱貼位置適當 10 ①切片鬆散：減5分
  ②切片裱貼位置不當：減5分
  
  ⒑切片整潔， ①切片不整潔：減3分
  標簽端正粘牢，編號清晰 10 ②標簽粘貼不牢：減3分
  ③編號不清晰：減4分
  合 計 100
  切片質量分級標准： ①甲級片： ≥90分 （優）
  ②乙級片：75～89分（良）
  ③丙級片：60～74分（基本合格）
  ④丁級片： ≤59分 （不合格）
  
  四HE染色試劑的配製
  1．蘇木素染液
  （1）Harri蘇木素染液
  蘇木素 1g
  無水乙醇 10ml
  硫酸鋁鉀 20g
  蒸餾水 200ml
  氧化汞 0.5g
  冰醋酸 8ml
  先用無水乙醇溶解蘇木素，用蒸餾水加熱溶解硫酸鋁鉀；然後將該兩液合並煮沸，加入氧化汞，繼續加熱和攪拌溶液至深紫色，隨即用冰水冷卻，恢復至室溫後過濾備用。使用前加入冰醋酸並混勻、過濾。
  （2）Gill改良蘇木素液
  蘇木素 2g
  無水乙醇 250ml
  硫酸鋁鉀 17g
  蒸餾水 750ml
  碘酸鈉 0.2g
  冰醋酸 20ml
  先用無水乙醇溶解蘇木素，用蒸餾水溶解硫酸鋁鉀；然後將該兩液混合，再依次加入碘酸鈉和冰醋酸。使用前過濾。
  （3）Mayer改良蘇木素液
  A液：蘇木素 2g
  無水乙醇 40ml
  B液：硫酸鋁鉀 100g
  蒸餾水 600ml
  將蘇木素溶於無水乙醇中（A液）；稍加熱，使硫酸鋁鉀溶於蒸餾水中（B液）。將A液與B液混合後煮沸2min，再用蒸餾水補足至600 ml，加入400mg碘化鈉充分混勻。染液呈紫紅色。
  2. 鹽酸－乙醇分化液
  濃鹽酸 1 ml
  70%乙醇 99 ml
  3．伊紅液
  （1）0.25～0.5%伊紅Y水溶液
  伊紅Y 0.25～0.5 g
  蒸餾水 100 ml
  冰醋酸 1滴
  （2）0.5%伊紅Y-氯化鈣水溶液
  伊紅Y 0.5 g
  蒸餾水 100 ml
  無水氯化鈣 0.5 g
  （3）0.25～0.5%伊紅Y-乙醇溶液。
  伊紅Y 0.25~0.5 g
  80%乙醇 100 ml
  4．石炭酸-二甲苯混合液
  石炭酸 1份
  二甲苯 3份
  
  石蠟組織切片的HE染色
  
  1．取材組織塊，經固定後，常規石蠟包埋，4μm切片。
  
  2．切片常規用二甲苯脫蠟，經各級乙醇至水洗：二甲苯（I）5min→二甲苯（Ⅱ）5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸餾水洗2min。
  
  3．蘇木素染色5min，自來水沖洗。
  
  4．鹽酸乙醇分化30s（提插數下）。
  
  5．自來水浸泡15min或溫水（約50℃）5min。
  
  6．置伊紅液2min。
  
  7．常規脫水，透明，封片：95％乙醇（I）min→95％乙醇（Ⅱ）1min→100％乙醇（I）1min→100％乙醇（Ⅱ）1min→二甲苯石碳酸（3：1）1min→二甲苯（I）1min→二甲苯（Ⅱ）1min→中性樹脂封固。
  
  免疫組化操作規程
  
  （一）、儀器設備
  1）18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或醫用微波爐；
  2）水浴鍋
  （二）、試劑
  1）PBS緩沖液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。
  2）0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液（CB，pH6.0，1000ml）：檸檬酸三鈉 3g，檸檬酸 0.4g。
  3）0.5mol/L EDTA緩沖液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH調至pH8.0,加水至1000ml。
  4）1mol/L的TBS緩沖液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris鹼，用1N的HCl調至pH8.0,加水至1000ml。
  5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配製。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配製。
  6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配製。
  7）封裱劑：
  a、甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.0～9.5）等量混合；
  b、油和TBS(或PBS)配製。
  8）TBS/PBS pH9.0～9.5，適用於熒光顯微鏡標本；pH7.0～7.4適合於光學顯微鏡標本。
  （三）、操作流程
  1、脫蠟和水化
  脫蠟前，應將組織晶元在室溫中放置60分鍾或60℃恆溫箱中烘烤20分鍾。
  1）組織晶元置於二甲苯中浸泡10分鍾，更換二甲苯後再浸泡10分鍾；
  2）無水乙醇中浸泡5分鍾；
  3）95%乙醇中浸泡5分鍾；
  4）70%乙醇中浸泡5分鍾；
  2、抗原修復
  用於福爾馬林固定的石蠟包埋組織晶元。
  1）抗原熱修復
  （1）高壓熱修復 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，但不進行鎖定。將玻片置於金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5分鍾，然後將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10分鍾後，去除熱源，置入涼水中，當小閥門沉下去後打開蓋子。本方法適用於較難檢測或核抗原的抗原修復。
  （2）煮沸熱修復 電爐或者水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至95℃左右，放入組織晶元加熱10~15分鍾。
  （3）微波熱修復 在微波爐里加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至沸騰後將組織晶元放入，斷電，間隔5~10分鍾，反復1-2次。適用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。
  2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預熱至37℃，切片也預熱至37℃，消化時間約為5~30分鍾；胃蛋白酶消化37℃時間為30分鍾。適用於被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。
  3、免疫組織化學染色
  SP法
  1）脫蠟、水化；
  2）PBS洗2～3次各5分鍾；
  3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鍾；
  4）PBS洗2～3次各5分鍾；
  5）抗原修復；
  6）PBS洗2～3次各5分鍾；
  7）滴加正常山羊血清封閉液,室溫20分鍾。甩去多餘液體。
  8）滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1小時或者4℃過夜或者37℃1小時。
  9）4℃過夜後需在37℃復溫45分鍾。
  10）PBS洗3次各5分鍾；
  11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室溫靜置，或37℃1小時；
  12）II抗中可加入0.05%的tween-20。
  13）PBS洗3次各5分鍾；
  14）DAB顯色5～10分鍾，在顯微鏡下掌握染色程度；
  15）PBS或自來水沖洗10分鍾；
  16）蘇木精復染2分鍾，鹽酸酒精分化；
  17）自來水沖洗10～15分鍾；
  18）脫水、透明、封片、鏡檢。
  SABC法
  1)脫蠟、水化。
  2)PBS洗兩次各5分鍾。
  3)用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉5～10分鍾，蒸餾水洗3次。
  4)抗原修復。
  5)PBS洗5分鍾。
  6)滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鍾。甩去多餘液體。
  7)滴加Ⅰ抗,室溫1小時或者4℃過夜或者37℃1小時（4℃過夜後在37℃復溫45分鍾）。
  8)PBS洗三次每次2分鍾。
  9)滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分鍾。
  10)PBC洗3次每次2分鍾。
  11)滴加試劑SABC，20℃～37℃20分鍾。
  12)PBS洗4次每次5分鍾。
  13)DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。
  14)蒸餾水洗。蘇木素復染2分鍾、鹽酸酒精分化。
  15)脫水、透明、封片、鏡檢。
  
  PAS染色法
  
  操作步驟
  
  1. 固定液:用Carnoy液或75%酒精 Carnoy固定液: 純酒精 60 ml 冰醋酸 10ml 氯仿 30ml
  
  2. 染色液
  
  1) 過碘酸酒清夜配法:
  
  過碘酸(HIO .2H O) 0.4g 95% 酒精 35ml M/5醋酸鈉(2.72g+蒸餾水100ml) 5ml蒸餾水10ml
  
  保存於冰箱內,用棕色瓶,可用兩周.
  
  2) Schiff氏液:
  
  0.5克鹼性品紅加入100毫升蒸餾水中,時時搖動三角瓶5分鍾,使之充分溶解.冷卻至50℃後過濾,加入10毫升1N鹽酸.冷卻至25℃,加入0.5-1克偏重硫酸鈉,在室溫中至少靜置24小時,然後密封冰箱保存.
  
  3) Schiff氏酒精液配置 Schiff氏液 11.5ml 1N HCI 0.5ml 純酒精 23ml
  
  4) 亞硫酸水
  
  1%偏重亞硫酸鈉 10ml 1N HCI 10ml 蒸餾水 180ml的樹膠溶解。
  
  Schiff（希弗）試劑
  在100 mL熱水裡溶解0.2 g品紅鹽酸鹽（也有叫鹼性品紅或鹽基品紅），放置冷卻後，加入2g亞硫酸氫鈉和2 mL濃鹽酸，再用蒸餾水稀釋到200 mL。
  或先配製10 mL二氧化硫的飽和水溶液，冷卻後加人0．2g品紅鹽酸鹽，溶解後放置數小時使溶液變成無色或淡黃色，用蒸餾水稀釋至200 mL。
  此外，也可以將0.5 g品紅的鹽酸鹽溶於100 mL熱水中，冷卻後用二氧化硫氣體飽和至粉紅色消失，加人0.5 g活性炭，振盪過濾，再用蒸餾水稀釋至500 mL。本試劑所用的品紅是para-rossaniline（或稱para-fuchsin,又稱假紅）。此物與另一類似物rossaniline（或稱fuchsin,稱洋紅）不同。
  品紅溶液原是桃紅色，被二氧化硫飽和後變成無色的Schiff試劑。
  Schiff試劑應密封貯存於暗冷處，倘若受熱見光或露置空氣中過久，試劑中的二氧化硫易失，結果又顯桃紅色，遇此情況，應再通入二氧化硫，使顏色消失後使用。但應指出，試劑中過量的二氧化硫愈少，反應就愈靈敏。

• 
  

Ⅳ 免疫組化 如何復染（免疫組化，蘇木精，鹽酸，石

（一）、儀器設備

1）18cm不銹鋼高壓鍋或電爐或醫用微波爐；2）水浴鍋

（二）、試劑

1）PBS緩沖液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L.

2）0.01mol/L檸檬酸鹽緩沖液（CB，pH6.0，1000ml）：檸檬酸三鈉 3g，檸檬酸 0.4g.

3）0.5mol/L EDTA緩沖液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH調至pH8.0，加水至1000ml.

4）1mol/L的TBS緩沖液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris鹼，用1N的HCl調至pH8.0，加水至1000ml.

5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2（pH7.8） 配製。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配製。

6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配製。

7）封裱劑：

a、甘油和0.5mmol/L碳酸鹽緩沖液（pH9.0～9.5）等量混合；

b、油和TBS（或PBS）配製。

8）TBS/PBS pH9.0～9.5，適用於熒光顯微鏡標本；pH7.0～7.4適合於光學顯微鏡標本。

（三）、操作流程

1、脫蠟和水化

脫蠟前，應將組織晶元在室溫中放置60分鍾或60℃恆溫箱中烘烤20分鍾。

1）組織晶元置於二甲苯中浸泡10分鍾，更換二甲苯後再浸泡10分鍾；

2）無水乙醇中浸泡5分鍾；

3）95%乙醇中浸泡5分鍾；

4）70%乙醇中浸泡5分鍾；

2、抗原修復

用於福爾馬林固定的石蠟包埋組織晶元。

1）抗原熱修復

（1）高壓熱修復 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）。蓋上不銹鋼高壓鍋的蓋子，但不進行鎖定。將玻片置於金屬染色架上，緩慢加壓，使玻片在緩沖液中浸泡5分鍾，然後將蓋子鎖定，小閥門將會升起來。10分鍾後，去除熱源，置入涼水中，當小閥門沉下去後打開蓋子。本方法適用於較難檢測或核抗原的抗原修復。

（2）煮沸熱修復 電爐或者水浴鍋加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至95℃左右，放入組織晶元加熱10~15分鍾。

（3）微波熱修復 在微波爐里加熱0.01M枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH6.0）至沸騰後將組織晶元放入，斷電，間隔5~10分鍾，反復1-2次。適用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。

2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前預熱至37℃，切片也預熱至37℃，消化時間約為5~30分鍾；胃蛋白酶消化37℃時間為30分鍾。適用於被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。

3、免疫組織化學染色

SP法

1）脫蠟、水化；

2）PBS洗2～3次各5分鍾；

3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室溫靜置10分鍾；

4）PBS洗2～3次各5分鍾； 5）抗原修復；

6）PBS洗2～3次各5分鍾；

7）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鍾。甩去多餘液體。

8）滴加Ⅰ抗50μl，室溫靜置1小時或者4℃過夜或者37℃1小時。

9）4℃過夜後需在37℃復溫45分鍾。

10）PBS洗3次各5分鍾；

11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室溫靜置，或37℃1小時；

12）II抗中可加入0.05%的tween-20.

13）PBS洗3次各5分鍾；

14）DAB顯色5～10分鍾，在顯微鏡下掌握染色程度；

15）PBS或自來水沖洗10分鍾；

16）蘇木精復染2分鍾，鹽酸酒精分化；

17）自來水沖洗10～15分鍾；

18）脫水、透明、封片、鏡檢。

SABC法

1）脫蠟、水化。

2）PBS洗兩次各5分鍾。

3）用蒸餾水或PBS配置新鮮的3%H2O2，室溫封閉5～10分鍾，蒸餾水洗3次。

4）抗原修復。

5）PBS洗5分鍾。

6）滴加正常山羊血清封閉液，室溫20分鍾。甩去多餘液體。

7）滴加Ⅰ抗，室溫1小時或者4℃過夜或者37℃1小時（4℃過夜後在37℃復溫45分鍾）。

8）PBS洗三次每次2分鍾。

9）滴加生物素化二抗，20℃～37℃20分鍾。

10）PBC洗3次每次2分鍾。

11）滴加試劑SABC，20℃～37℃20分鍾。

12）PBS洗4次每次5分鍾。

13）DAB顯色：DAB顯色試劑盒或者自配顯色劑顯色（鏡下掌握顯色程度）。

14）蒸餾水洗。蘇木素復染2分鍾、鹽酸酒精分化。

15）脫水、透明、封片、鏡檢。

Ⅳ 關於微波爐抗原修復

①該試劑也應注意有多種不同的含水分子量。
②該貯存液久放後可出現結晶。每次使用前，先取出回至室溫，搖晃其結晶溶解，也可用微波爐促其快速溶解，然後再用。
0.01M PBS工作液的配製：
取一2000ml的容量瓶一個，裝入已稱好的NaCt18g，加入少量蒸餾水讓其徹底溶解，再加入 Ⅰ液13ml，Ⅱ液87ml，加蒸餾水湊足2000ml，即可使用，即可使用該溶液在室溫下可保存3-4周，但以新配為佳。
PBS工作液配製完畢後，都要測其PH值，如果偏酸，可用氫氧化鈉來調試，如果偏鹼可用HCl調試，測試有如下n種方法：
①PH測試筆測試，這是一種簡便、易行、結果較為准確的測試方法。當配製完PBS後，取一小杯，倒入配好的PBS，插入測試筆，打開開關，小屏幕上將可出現測出的PH結果。PH如果7.6不足，小量的可用0.2M Na2HPO4調校，大量的可用氫氧化鈉調校。PH如果高於7.6，小量的用0.2M NaH2PO4調校，大量的可用HCL來調校。
②用試紙來測試：PH試紙有兩種，一種為廣泛PH試紙，范圍在1-14，另一種是精密試紙有各種各樣的范圍。但是，作為沖洗切片用的PBS，其精確度不需要十分精確，如配PH7.6時，測試時在PH7.5或7.7，都可使用。試紙測試PH值，停靠其反應的顏色來確定，十分簡便，一般的試劑都可用它來測試。
③儀器測試：對於要求較高，需較准確的PH值，須彩用儀器測試。
1. Tris緩沖溶液(Tris buffer solution,TBS)
①1N HCL ，濃HCL(雙重1.19)8.3ml，先取50ml蒸餾水，加入HCL再加水到100ml。
②0.5M Tris-HCL緩沖液(PH7.6)
取Tris(羥甲基氨基甲烷)6.57g，加入少許的蒸餾水攪拌，直至溶解，再加入1N HCL42ml，然後用蒸餾水湊足100ml，於4℃冰箱保存。
臨用時，將上述溶液10稀釋倍，即為0.05M工作液。