食品中蛋白質的消化蒸餾與測定

㈠ 國家標准檢測蛋白質含量測定方法

蛋白質含量測定方法就是檢測元素的含量，像三聚氰胺的問題，就是通過增加N的含量使「蛋白質」含量提高的。

國家標准檢測蛋白質含量的方法叫做凱氏定氮法，食物中的蛋白質在催化加熱條件下分解，導致氨和硫酸結合產生硫酸銨。 鹼蒸餾採用無硫，硼酸吸收，用硫酸或鹽酸標准滴定溶液滴定，根據酸耗計算氮含量，再乘以轉化系數，即蛋白質含量。

具體操作步驟如下：

1.樣品處理

精確稱量0.2-2.0g固體樣品或2-5g半固體樣品或吸收10-20ml液體樣品（約30-40mg氮當量）。將其轉移至乾燥的100毫升或500毫升氮氣固定瓶中，加入0.2克硫酸銅，6克硫酸鉀和20毫升硫酸，輕輕搖動，在瓶口放置一個小漏斗，將瓶子傾斜石棉網上有45度角，有小孔。

加熱小火後，內容物碳化，泡沫完全停止，加強火力，保持瓶內液體稍微沸騰，直至液體呈藍綠色澄清透明，然後繼續加熱0.5小時。取出並冷卻，小心加入20毫升水，冷卻，移入100毫升容量瓶中，用少量水洗凈氮氣瓶，洗凈液放入容量瓶中，然後用水沖洗至刻度，混勻備用。

取相同量的硫酸銅，硫酸鉀和濃硫酸作為試劑進行空白試驗。然而，這種方法很危險，很難在實驗室中證明。大多數實驗室都有一個消化器，可以一次處理16個以上的樣品和一個可以自行設定溫度的呼吸機。它更安全，更可操作。

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除了凱氏定氮法以外，標準的測量方法還有：

• 分光光度法

食品中的蛋白質在催化加熱條件下被分解，分解產生的氨與硫酸結合生成硫酸銨，在pH4.8的乙酸鈉-乙酸緩沖溶液中與乙醯丙酮和甲醛反應生成黃色的3,5-二乙醯-2,6-二甲基-1,4-二氫化吡啶化合物。在波長400nm 下測定吸光度值，與標准系列比較定量,結果乘以換算系數，即為蛋白質含量。

• 燃燒法

樣品在900~1200℃下燃燒。在燃燒過程中，產生混合氣體。 諸如碳，硫和鹽的干擾氣體被吸收管吸收，氮氧化物被還原成氮。 形成的氮氣流由熱導檢測器（TCD）檢測。

㈡ 食品中蛋白質含量的測定

食品中蛋白質的測定如下：

蛋白質的檢測原理是基於食品中蛋白質含量與食品中氮含量的比例關系換算的。如乳中蛋白質與氮含量的比值為6.38，大豆中蛋白質與氮含量的比值為5.71，普通食品中蛋白質與氮含量的比值為6.25。因此是通過測定食品中氮含量後再根據換算系數得到食品中蛋白質含量。

2、杜馬斯定氮法：樣品在高純氧中充分燃燒的過程中，將氮元素轉化為氮氣或氮氧化物，再經過高溫銅的還原，使所有的氮轉化為N2，然後利用熱導檢測器檢測N2的含量來推算樣品中氮含量。因此杜馬斯定氮法也稱為杜馬斯伍散燃燒法或燃燒定氮法。

㈢ 測蛋白質的含量

食品中蛋白質含量測定（凱氏定氮法）
（5009．5-2003食品中蛋白質含量測定）
一、目的與要求
1、學習凱氏定氮法測定蛋白質的原理。
2、掌握凱氏定氮法的操作技術，包括樣品的消化處理、蒸餾、滴定及蛋白質含量計算等。
二、實驗原理
蛋白質是含氮的化合物。食品與濃硫酸和催化劑共同加熱消化，使蛋白質分解，產生的氨與硫酸結合生成硫酸銨，留在消化液中，然後加鹼蒸餾使氨游離，用硼酸吸收後，再用鹽酸標准溶液滴定，根據酸的消耗量來乘以蛋白質換算系數，即得蛋白質含量。
因為食品中除蛋白質外，還含有其它含氮物質，所以此蛋白質稱為粗蛋白。
三、儀器與試劑
（一）試劑
1、硫酸銅（CuSO4•5H20）
2、硫酸鉀
3、硫酸（密度為1.8419g/L）
4、硼酸溶液（20g/L）
5、氫氧化鈉溶液（400g/L）
6、0.01mol/L鹽酸標准滴定溶液。
7、混合指示試劑：0.1%甲基紅乙溶液液1份，與0.1%溴甲酚綠乙醇溶液5份臨用時混合。
8、黃豆粉。
（二）儀器
微量定氮蒸餾裝置：如圖3- 所示。

圖3- 微量凱氏定氮裝置
1、電爐； 2、水蒸氣發生器（2L平底燒瓶）；3、螺旋夾a；
4、小漏斗及棒狀玻璃塞（樣品入口處）；5、反應室；6、反應室外層；
7、橡皮管及螺旋夾b；8、冷凝管；9、蒸餾液接收瓶。
四、實驗步驟
1、樣品消化
稱取黃豆粉約0.3g（±0.001g），移入乾燥的100mL凱氏燒瓶中，加入0.2g硫酸銅和6g硫酸鉀，稍搖勻後瓶口放一小漏斗，加入20mL濃硫酸，將瓶以450角斜支於有小孔的石棉網上，使用萬用電爐，在通風櫥中加熱消化，開始時用低溫加熱，待內容物全部炭化，泡沫停止後，再升高溫度保持微沸，消化至液體呈藍綠色澄清透明後，繼續加熱0.5h，取下放冷，小心加20mL水，放冷後，無損地轉移到100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混勻備用，即為消化液。
試劑空白實驗：取與樣品消化相同的硫酸銅、硫酸鉀、濃硫酸，按以上同樣方法進行消化，冷卻，加水定容至100mL，得試劑空白消化液。
2、定氮裝置的檢查與洗滌
檢查微量定氮裝置是否裝好。在蒸氣發生瓶內裝水約三分之二，加甲基紅指示劑數滴及數毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入數粒玻璃珠（或沸石）以防止暴沸。
測定前定氮裝置如下法洗滌2~3次：從樣品進口入加水適量（約占反應管三分之一體積）通入蒸汽煮沸，產生的蒸汽沖洗冷凝管，數分鍾後關閉夾子a，使反應管中的廢液倒吸流到反應室外層，打開夾子b由橡皮管排出，如此數次，即可使用。
3、鹼化蒸餾
量取硼酸試劑20mL於三角瓶中，加入混合指示劑2~3滴，並使冷凝管的下端插入硼酸液面下，在螺旋夾a關閉，螺旋夾b開啟的狀態下，准確吸取10.0mL樣品消化液，由小漏斗流入反應室，並以10mL蒸餾水洗滌進樣口流入反應室，棒狀玻塞塞緊。使10mL氫氧化鈉溶液倒入小玻杯，提起玻塞使其緩緩流入反應室，用少量水沖洗立即將玻塞蓋堅，並加水於小玻杯以防漏氣，開啟螺旋夾a，關閉首歷螺旋夾b，開始蒸餾。通入蒸汽蒸騰10min後，移動接收瓶，液櫻芹盯面離開凝管下端，再蒸餾2min。然後用少量水沖洗冷凝管下端外部，取下三角瓶，准備滴定。
同時吸取10.0mL試劑空白消化液按上法蒸餾操作。
4、樣品滴定
以0.01mol/L鹽酸標准溶液滴定至灰色為終點。
5、數據記錄
項 目 第一次 第二次 第三次
樣品消化液（mL）
滴定消耗鹽酸標准溶液（mL）
消耗鹽酸標准溶液平均值（mL）
五、結果計算

式中 X——樣品蛋白質含量（g/100g）；
V1——樣品滴定消耗鹽酸標准溶液體積（mL）；
V2——空白滴定消耗鹽酸標准溶液體積（mL）；
c——鹽酸標准滴定溶液濃度（mol/L）；
0.0140 ——1.0mL鹽酸 標准滴定溶液相當的氮的質量（g）；
m——樣品的質量（g）；
F——氮換算為蛋白質的系數，一般食物為6.25；乳製品為6.38；麵粉為5.70；
高梁為6.24；花生為5.46；米為5.95；大豆及其製品為5.71；肉與肉製品為
6.25；大麥、小米、燕麥、裸麥為5.83；芝麻、向日葵5.30。
計算結果保留三位有效數字。
六、注意事項及說明
1、本法也適用於半固體試樣以及液體樣品檢測。半固體試樣一般取樣范脊和圍為2.00g~5.00g；液體樣品取樣10.0mL~25.0mL（約相當氮30mg~40mg）。若檢測液體樣品，結果以g/100mL表示。
2、消化時，若樣品含糖高或含脂及較多時，注意控制加熱溫度，以免大量泡沫噴出凱氏燒瓶，造成樣品損失。可加入少量辛醇或液體石蠟，或硅消泡劑減少泡沫產生。
3、消化時應注意旋轉凱氏燒瓶，將附在瓶壁上的碳粒沖下，對樣品徹底消化。若樣品不易消化至澄清透明，可將凱氏燒瓶中溶液冷卻，加入數滴過氧化氫後，再繼續加熱消化至完全。
4、硼酸吸收液的溫度不應超過40℃，否則氨吸收減弱，造成檢測結果偏低。可把接收瓶置於冷水浴中。
5、在重復性條件下獲得兩次獨立測定結果的絕對差值不得超過算術平均值的10%
七、思考題
1、預習凱氏定氮法測定蛋白質的原理及操作。
2、蒸餾時為什麼要加入氫氧化鈉溶液？加入量對測定結果有何影響？
3、在蒸汽發生瓶水中、加甲基紅指示劑數滴及數毫升硫酸的作用是什麼？若在蒸餾過程中才發現蒸汽發生瓶中的水變為黃色，馬上補加硫酸行嗎？
4、實驗操作過程中，影響測定準確性的因素有哪些？