凱氏定氮法蒸餾前的順序

㈠ 凱氏定氮儀使用方法和步驟

使用凱氏定氮儀的步驟分為消化、蒸餾和吸收三部分：

1. 消化階段: 准備6個標號的凱氏燒瓶，分別加入蛋白溶液、接觸劑、硫酸、過氧化氫。1-3號燒瓶加入樣品，4-6號作為空白對照，用蒸餾水代替樣品。燒瓶連接抽氣裝置，先微火加熱至燒瓶內物質炭化變黑，泡沫消失後加大火力，保持微沸，期間需轉動燒瓶以保證完全消化。消化過程中需用抽水泵排除SO2氣體，整個過程應在通風櫥中進行。

2. 蒸餾和吸收階段: 儀器安裝前需清洗干凈，使用時需進行蒸氣洗滌。在蒸餾裝置中，加蒸餾水、硫酸保持酸性、沸石防爆沸，加蒸餾水使水封。蒸煮5分鍾後移開煤氣燈，沖洗並檢查不漏氣。無機氮標准樣品蒸餾吸收需先練習，如用硫酸銨標准液進行重復實驗，顏色變化指示蒸餾結束。

3. 未知樣品和空白的蒸餾吸收: 消化好的樣品或空白對照液加入熱蒸餾水稀釋，洗滌並倒入反應室，按標准硫酸銨的操作進行蒸餾。注意消化液可能需要稀釋以防止結晶堵塞。

4. 滴定階段: 蒸餾完畢後，用0.0100mol/L的標准鹽酸溶液滴定，觀察顏色變化以確定滴定終點。空白對照液顏色變化不明顯時，可不進行滴定，記錄每次滴定的用量。

㈡ 蛋白質的測定方法

測定蛋白質含量的方法有凱氏定氮法、雙縮脲法、考馬斯亮藍法等。

2、雙縮脲法：是一種用於鑒定蛋白質的分析方法。雙縮脲試劑呈藍色，是一種鹼性含銅測試溶液，它由幾滴1%硫酸銅，1%氫氧化鉀和燃握敬酒石酸鉀鈉製成。

3、考馬斯亮藍法：基本原理是基於蛋白質可以與考馬斯亮藍G-250定量結合。

㈢ 有誰知道凱氏定氮的具體步驟，注意事項，！！

1、消化:精密稱取大豆樣品1.0g左右，放入乾燥的250 ml消化管中，加入0.4g CuSO4 7g K2SO4 10ml H2SO4先200'C炭化，待泡沫停止後提高溫度到450'C，加熱至液體沸騰，待瓶內液體呈藍綠色透明後，再繼續加熱0.5h。

冷卻後加入20ml水，移入100ml容量瓶中，用少量水洗滌消化管2~3次，洗液合並於容量瓶中定容。

2、蒸餾:連接凱氏定氮裝置，於水蒸氣發生瓶內裝水至2/3處，加甲基紅指示劑數滴及數ml硫酸，保持水呈酸性。加入數粒玻璃珠以防暴沸，調節火力加熱煮沸水蒸氣發生瓶內的水。

3、向吸收瓶內加入20g/L硼酸溶液20ml及混合指示劑2滴，並使冷凝管下端插入液面以下，吸取10ml樣品消化稀釋液由進樣口進入反應室，並以10ml水洗滌進樣口使其流入反應室內，將400g/L NaOH溶液10ml倒入進樣口，立即夾緊螺旋夾，並加入少量蒸餾水，密封進樣口。

當蒸汽通入反應室時，准確計時，反應產生的氨氣通過冷凝管進入吸收瓶，蒸餾5min，移動吸收瓶，使冷凝管下端離開液面，再蒸餾Imin，然後用少量水沖洗冷凝管下端外部，取下吸收瓶。

停止加熱，使反應室內的液體進入汽水分離器，打開進樣口的螺旋夾，將汽水分離器的液體放出。再向反應室內加入蒸餾水，夾緊螺旋夾，再次進行加熱至水蒸汽放出，停止加熱，使反應室內的水進入汽水分離器，進行洗滌。

4、滴定:用0.025mol/L硫酸標准溶液滴定吸收液至灰色。

5、計算:X= 2cVX 14X5.71/m

X為樣品中蛋白質的含量，%；c為硫酸標准溶液的濃度，molL；V為樣品消化液消耗硫酸標准溶液的體積，ml；m為樣品的質量，g。

注意事項

(1) 樣品應是均勻的。固體樣品應預先研細混勻，液體樣品應振搖或攪拌均勻。

(2) 樣品放入定氮瓶內時，不要沾附頸上。萬-沾附可用少量水沖下，以免被檢樣消化不完全，結果偏低。

(3) 消化時如不容易呈透明溶液，可將定氮瓶放冷後，慢慢加入30%過氧化氫(H2O2)2-3ml，促使氧化。

(4) 在整個消化過程中，不要用強火。保持和緩的沸騰，使火力集中在凱氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白質在無硫酸存在的情況下，使氮有損失。

(5)如硫酸缺少， 過多的硫酸鉀會引起氨的損失，這樣會形成硫酸氫鉀，而不與氨作用。因此，當硫酸過多的被消耗或樣品中脂肪含量過高時，要增加硫酸的量。

(6)加入硫酸鉀的作用為增加溶液的沸點，硫酸銅為催化劑，硫酸銅在蒸餾時作鹼性反應的指示劑。

(7)混合指示劑在鹼性溶液中呈綠色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈紅色。如果沒有溴甲酚綠，可單獨使用0.1%甲基紅乙醇溶液。

(8) 氨是否完全蒸餾出來，可用PH試紙試餾出液是否為鹼性。

(3)凱氏定氮法蒸餾前的順序擴展閱讀：

凱氏定氮法原理

凱氏定氮法首先將含氮有機物與濃硫酸共熱，經一系列的分解、碳化和氧化還原反應等復雜過程，最後有機氮轉變為無機氮硫酸銨，這一過程 稱為有機物的消化。

為了加速和完全有機物質的分解，縮短消化時間，在消化時通常加入硫酸鉀、硫酸銅、氧化汞、過氧化氫等試劑，加入硫酸鉀可以提高消化液的沸點而加快有機物分解，除硫酸鉀外，也可以加入硫酸鈉、氯化鉀等鹽類類提高沸點，但效果不如硫酸鉀。

硫酸銅起催化劑的作用。凱氏定氮法中可用的催化劑種類很多，除硫酸銅外，還有氧化汞、汞、硒粉、鉬酸鈉等，但考慮到效果、價格及環境污染等多種因素，應用最廣泛的是硫酸銅。

㈣ 凱氏定氮法測定食品中蛋白質的操作要點及注意事項、常見問題解答匯總！

蛋白質作為生物體細胞組織的重要構成成分，在食物中起著至關重要的作用。它們是人體氮的主要來源，具有不可替代的重要性。蛋白質區別於其他有機化合物的一個重要標志是其含氮量。在檢測食品中的蛋白質時，通常先測定食品中的總氮量，然後乘以蛋白質換算系數，以此得出蛋白質含量。凱氏定氮法，由Kieldahl於1883年首次提出，至今仍是標准檢測方法。

凱氏定氮法的原理是：在樣品中加入濃硫酸和催化劑，使其充分混合並加熱消化，使樣中的碳和氫被氧化為二氧化碳和水，而有機氮轉化為硫酸銨。通過鹼化蒸餾使氨游離，使用硼酸吸收後，以硫酸或鹽酸標准滴定溶液滴定，根據酸的消耗量乘以換算系數，即可得出蛋白質的含量。

樣品消化過程中，濃硫酸的作用是脫水性和氧化性，使有機物中的碳、氫氧化為二氧化碳和水，並使蛋白質分解為氨，氨隨後與硫酸結合生成硫酸銨。為了提高消化效率，通常會加入硫酸鉀和硫酸銅作為催化劑。硫酸鉀能提高溶液的沸點，而硫酸銅則作為催化劑，且能指示消化終點，當有機物完全消化後，溶液會呈現清澈的藍綠色。

蒸餾過程中，消化液中的硫酸銨在鹼性環境下轉化成氨。為了防止水蒸氣發生器中的氨氣逸出，需要保持水的酸性。消化液中的氨通過硼酸溶液吸收，硼酸吸收氨的作用微弱酸性，不影響後續滴定時指示劑的變色反應。

滴定步驟中，待吸收完全後，使用硫酸或鹽酸標准溶液進行酸鹼滴定。滴定液的濃度直接影響結果准確性，必須按照要求進行配製和標定。滴定終點時，指示劑呈灰色。

在進行凱氏定氮法時，需注意以下幾點：所用試劑溶液應用無氨蒸餾水配製；取樣應具有代表性，取樣前需充分混勻；樣品稱量放入凱氏燒瓶時，切勿使樣品粘附在瓶頸部；消化過程中需不時轉動凱氏燒瓶；消化脂肪或糖含量較高的樣品時，應先消化加熱並不斷搖動；消化液渾濁或未澄清透明時，可先將凱氏燒瓶放冷至室溫，再加入過氧化氫繼續消化；加鹼後需進行水封，避免氨逸出影響結果准確性；蒸餾時需保證蒸汽均勻、充足，防止發生倒吸；若加鹼後消化液呈藍色而未生成氫氧化銅沉澱，說明鹼量不足，需適量補加鹼；蒸餾前檢查蒸餾裝置是否漏氣，使用碎瓷片或玻璃珠消泡，冷凝管下端要插入硼酸吸收液液面以下，蒸餾完畢後先提離液面，再蒸1min清洗管口，最後移開吸收瓶並關閉熱源，避免發生倒吸。

對於凱氏定氮法，常見問題解答如下：消化過程中沾壁和黑色殘留物，可通過在消化較完全時搖動定氮瓶解決；硫酸鉀的作用是提高溶液沸點，加快有機物分解；硫酸銅作用為催化、指示消化終點以及蒸餾時鹼性反應指示劑；混合指示劑必須臨用時混合；蒸餾後需沖洗冷凝管下端，以防止產生結果誤差；蒸餾裝置檢漏可通過滴加少量水在介面和瓶塞處觀察氣泡產生；硼酸使用量需按國標要求，10mL足夠；滴定時消耗鹽酸溶液量不宜更改國標濃度；空白消耗標准滴定液的體積即為試劑空白實驗消耗的標准滴定溶液的體積；同時含有多種蛋白質，需按復合配方食品換算蛋白質系數。

總結，凱氏定氮法是一個經典且准確的檢測方法，適用於食品中蛋白質的測定。然而，由於樣品中可能含有的非蛋白質含氮化合物，凱氏定氮法測得的結果為樣品中粗蛋白質含量，而非蛋白質含量。在實際實驗操作中，應嚴格遵循標准規定進行每一步操作，以確保結果准確性。本文為作者日常實驗總結所得，希望能為實驗者提供一些幫助。

㈤ 凱式定氮法的操作步驟

1. 樣品的選取和制備 選取有代表性的種子(帶殼種子需脫殼)挑揀干凈, 按四分法縮減取樣,
取樣量不得少於20克。將種子放於60～65℃烘箱中乾燥8小時以上, 用粉碎機磨碎, 95%通過40目篩, 裝入磨口瓶備用。
2. 稱樣
稱取0.1克試樣兩份(含氮1～7毫克), 精確至0.0001克, 同時測定試樣的水分含量。
3. 消煮1 將試樣置開25毫升凱氏瓶中,
加入加速劑粉末。除水稻為1克外, 其它均為2克。然後加3毫升硫酸, 輕輕搖動凱氏瓶, 使試樣被硫酸濕潤, 將凱氏瓶傾斜置於電爐上加熱, 開始小火,
待泡沫停止後加大火力, 保持凱氏瓶中的液體連續沸騰, 沸酸在瓶頸中部冷凝迴流。待溶液消煮到無微小的碳粒並呈透明的藍綠色時,
谷類繼續消煮30分鍾,豆類繼續消煮60分鍾。
4. 消煮2 將試樣置於50毫升凱氏瓶中,
加入0.5克加速劑和3毫升混液,在凱氏瓶上放一曲頸小漏斗, 傾斜在電爐上加熱, 開始小火(用調壓器將電壓控制在175伏左右),
保持凱氏瓶中液體呈微沸狀態。5分鍾後加大火力(將電壓控制在200伏左右)。保持凱氏瓶中液體連續沸騰, 消煮總時間, 水稻、高粱為30分鍾,
其它均為45分鍾。
注: 消煮中列入兩種消煮條件, 經與國際穀物化學協會標准法(ICC)比較, t值測驗均不顯著,
准確度與精密度也基本一致,在具體工作中可根據實際情況取其一種。
5. 蒸餾 消煮液稍冷卻後加少量蒸餾水,
輕輕搖勻。移入半微量蒸餾裝置的反應室中,用適量蒸餾水沖洗凱氏瓶4～5次。蒸餾時將冷凝管末端插到盛有10毫升硼酸指示劑混合液的錐形瓶中,
向反應室中加入40%氫氧化鈉溶液15毫升(如採用消煮2的條件, 加10毫升即可)。然後通氣蒸餾, 當餾出液體積約達50毫升時,降下錐形瓶。使冷凝管末端離開液面,
繼續蒸餾1～2分鍾, 用蒸餾水沖洗冷凝管末端,洗液均需流入錐形瓶中。
6. 滴定 谷類以0.02mol/L,
豆類以0.05mol/L標准鹽酸或硫酸滴定至錐形瓶中的溶液由藍綠色變成灰紫色為終點。空白用0.1克蔗糖代替樣品作空白測定。消耗標准酸溶液的體積不得超過0.3毫升。

看完了採納我哦~~

㈥ 說明常用蛋白質測定方法的原理,並對各種方法加以比較

1、凱氏定氮法

准備4個50mL凱氏燒瓶並標號，想1、2號燒瓶中加入定量的蛋白質樣品，另外兩個燒瓶作為對照，在每個燒瓶中加入硫酸鉀-硫酸銅混合物，再加入濃硫酸，將4個燒瓶放到消化架上進行消化。

消化完畢後進行蒸餾，全部蒸餾完畢後用標准鹽酸滴定各燒瓶中收集的氨量，直至指示劑混合液由綠色變回淡紫紅色，即為滴定終點，結算出蛋白質含量。

2、雙縮脲法

雙縮脲法是第一個用比色法測定蛋白質濃度的方法，硫銨不幹擾顯色， Cu2+與蛋白質的肽鍵，以及酪氨酸殘基絡合，形成紫藍色絡合物，此物在540nm波長處有最大吸收。

利用標准蛋白溶液和雙縮脲試劑繪制標准曲線，將待測血清與硫酸鈉在待測試管中混合，並只加入硫酸鈉不含血清的試管作對照，將兩支試管加入等量的雙縮脲試劑，混合後於37℃環境中放置10分鍾，在540nm波長進行比色，以對照管調零，讀取吸光度值，標准曲線上直接查出蛋白質含量。

3、酚試劑法

取6支試管標號，前5支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，不加標准蛋白溶液，每支試管液體總量加入蒸餾水補足而保持一致，混合均勻，在室溫下放置30分鍾，以未加蛋白質溶液的第一支試管作為空白對照，於650nm波長處測定各管中溶液的吸光度值。

4、紫外吸收法

大多數蛋白質在280nm波長處有特徵的最大吸收，這是由於蛋白質中有酪氨酸，色氨酸和苯丙氨酸存在，可用於測定0.1～0.5mg/mL含量的蛋白質溶液。

取9支試管分別標號，前8支試管分別加入不同濃度的標准蛋白溶液，1號試管不加標准蛋白溶液，最後一支試管加待測蛋白質溶液，而不加標准蛋白溶液，每支試管液體總量通過加入蒸餾水補足而保持一致，將液體混合均勻，在280nm波長處進行比色，記錄吸光度值。

5、考馬斯亮藍法

Bradford濃染液的配製：將100mg考馬斯亮藍G-250溶於50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，用蒸餾水補充至200ml，此染液放4℃至少6個月保持穩定。

標准曲線蛋白質樣本的准備：盡量使用與待測樣本性質相近的蛋白質作為標准品，測定抗體，可用純化的抗體作為標准。待測樣本是未知的，也可用抗體作為標准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之間繪制標准曲線。

將待測樣本溶於緩沖溶液中，該緩沖溶液應與製作標准曲線的緩沖溶液相同(最好用PBS)。按1：4用蒸餾水稀釋濃染料結合溶液，出現沉澱，過濾除去。

每個樣本加5ml稀釋的染料結合溶液，作用5～30min。染液與蛋白質結合後，將由紅色變為藍色，在595nm波長下測定其吸光度。注意，顯色反應不得超過30min。根據標准曲線計算待測樣本的濃度。