Ⅰ 外泌體提取策略
外泌體即細胞外囊泡（簡孫納卜稱EVs）是所有細胞主動分泌的納米級囊泡,活細胞釋放不同類型的細胞外囊泡進入細胞外環境進行細胞間交流,細胞外囊泡越來越多地被認為是有希望的液體活檢生物學標志物｡根據相似囊泡的直徑大小可將細胞外囊泡分為三類,直徑在50-150nm的外泌體,直徑在100-1000nm的微囊泡､外粒體和微顆粒,直徑在-100-5000nm的凋亡小體｡目前主要認為,外泌體產生的過程是細胞膜內陷形成內體,再形成多泡體,多泡體與質膜融合導致其管腔內囊泡釋放到細胞外,產生一種稱為外泌體的EV亞型｡
2 外泌體的提取純化方法
2.1 基於密度的分離方法
2.1.1 超速離心法
超速離心法是最常用的外泌體提取方法,首先,施加較低速度的離心力300g以從細胞培養液中去除細胞;然後,對上清液施加較大的離心力(10000-20000g),去除大的細胞碎片和破碎的細胞器;最後,再次進行高速(100000-150000g)離心從 上清液 中收集外泌體,所有離心在4℃下進行｡超速離心法獲得的外泌體不被分離試劑污染,且分離數量多,處理樣本小｡盡管超速離心法是提取外泌體最廣泛的「金標准」,但仍然有很多缺點,如所需的超高速離心儀器比較昂貴､樣品量大､耗時長､電鏡觀察外泌體時仍存在蛋白質污染｡
2.1.2 蔗糖密度梯度離心法
目前已發現,外泌體在蔗糖梯度為1.15-1.19g/mL密度中漂浮,所以根據這個特性,可以將樣品與蔗糖梯度溶液一起超速離心,外泌體沉降到不同的密度區域就可以將其區分出來｡蔗糖密度梯度離心法需要預先配好連續梯度濃度的蔗糖溶液,將蔗糖溶液鋪於離心管底部,再將樣本放於上部,4℃下100000g超速離心｡蔗糖密度梯度離心法獲得的外泌體純度較高,但是前期准備復雜,耗時長,又不能完全將外泌體與蛋白質分離開｡2013年10月ISEV會議一些研究人員表示,通過蔗糖密度梯度離心法分離囊泡時,細胞囊泡的生物功能喪失｡
2.2 沉澱法
2.2.1 聚乙二醇 (PEG)
PEG 是一種水溶性非離子化合物,具有極強的親水性,可以與疏水的脂質雙分子層結合,從而改變外泌體的溶解度而使外泌體沉澱｡RIDER等研究發現,PEG水平會影響外泌體的產率,且從外泌體中獲得的總蛋白和RNA在數量和質量上足以用於蛋白質組學和測序分析｡沉澱法操作簡單,不需要特殊設備,更經濟,外泌體產量高,但是會沉澱一些非外泌體的疏水性物質而導致外泌體純度不夠｡
2.2.2 試劑盒法
最近已經開發出基於聚合物共沉澱的試劑盒,如ExoQuick､TEI等,可用於提取多種體液中的外泌體｡聚合物沉澱劑ExoQuick與樣品4℃共孵育30min,然後室溫1500g離心30min,即可獲得外泌體沉澱｡與超速離心法比較,試劑盒法更簡便､耗時短,且能獲得更高的外泌體產量｡試劑盒法獲得外泌體沉澱含有的雜質較多,不同來源的樣本需要使用不同的試劑盒來進行提取,且試劑盒價格較貴｡
2.3 基於大小的分離方法
2.3.1 SEC SEC
主要根據外泌體的大小對外泌體進行分離和純化｡樣品中大分子物質不能進入凝膠孔而被流動相快速洗脫出來,尺寸小於孔徑的物質可進入多孔材料,需要較長時間被洗脫出來,即可通過不同的洗脫時間分離外泌體｡BING等證明了瓊脂糖凝膠可以從無血小板上清液中純化出外泌體,通過這種方法茄吵,外泌體很容易從蛋白質和高密度脂蛋白中分離出來｡HONG等通過改編和使用mini-SEC方法能夠有效分離出外泌體,與漫長而復雜的超速離心法不同,它可在30min內完成外泌體分離｡通過SEC分離的外泌體純度較高,分離出結構上完整且功能活躍的囊泡是基於微型SEC分離的重要優勢,但數量較少,而且需要特殊設備,故應用不廣泛｡
2.3.2超濾法
超濾法是根據外泌體的大小使用相應孔徑的濾膜,將樣品中小分子物質過濾到膜的另一側,而將大分子物質滯留在膜上來達到分離的目的｡超慮法簡單､省時､成本低｡LIU等改則穗良了簡單的超濾法,通過將不同孔徑的膜(200､100､80､50､30nm)串聯在一起,實現了不同大小外泌體的快速分離,且捕獲效率明顯高於超速離心法｡然而,過濾器很容易被囊泡和其他大分子物質堵塞,這種情況很容易導致膜壓力過大而破碎｡
2.4 基於表面成分親和力的分離法
2.4.1 蛋白質
外泌體表面含有豐富的蛋白質,所以基於其表面成分的親和力特別適合於分離外泌體｡CD63是外泌體中發現的最豐富的蛋白質之一,因此,常用抗CD63免疫吸附外泌體｡ZHAO等通過使用抗CD63包裹的磁珠與血液樣品不斷混合,將外泌體捕獲到磁珠上後,加 緩沖液 沖洗5min,然後引入3種不同熒光染料標記的抗體[抗CD24､抗上皮細胞黏附分子(抗EpCAM)､抗糖類抗原-125(抗CA-125)],通過觀察不同熒光強度可以量化卵巢癌中不同腫瘤標志物的表達水平｡
2.4.2 膜磷脂
雖然大部分基於表面成分的親和方法是基於外泌體表面的蛋白質,但是脂質雙層也是一種很好的檢測目標｡XU等利用外泌體膜上表達的磷脂醯 絲氨酸 (PS)可以被PS結合受體Tim4很好地結合,用Tim4固定化的磁珠與樣品反應進行外泌體捕獲,並且觀察到洗脫的外泌體保持著完整的形態,與商業外泌體提取試劑盒相比,表現出更高的捕獲率｡CHEN等利用外泌體將帶負電荷的PS暴露在膜上的特點,使用帶正電荷基團的離子交換樹脂的磁珠與血漿樣品反應,血漿中的外泌體就能與磁珠結合,通過這種方法分離的外泌體具有比超速離心法更高的回收率和更少的雜質蛋白｡
2.5 ACE分離法
ACE微陣列產生的介電泳(DEP)分離力是通過施加交流電場產生的,納米級的粒子和其他納米級實體物質被吸引到圓形微電極邊緣周圍的DEP高場區域,細胞和大的實體物質被吸引到DEP低場區域｡ IBS EN等的ACE裝置需要30-50μL血漿樣品就能夠在15min內將外泌體濃縮到微電極周圍的高場區域｡ACE設備流程明顯快於目前使用的方法,這個裝置簡化了外泌體提取和回收過程的能力,明顯減少了加工步驟和消耗時間｡CHEN等構建了具有交叉電極的DEP晶元,能在30min內從血漿樣品中分離出外泌體｡經過測試證明,DEP晶元具有高捕獲率和高回收率,需要的時間更短,並且不需要笨重和貴重的儀器｡
2.6 微流控晶元法
微流控晶元法是新開發出來的用於快速高效分離樣品中外泌體的方法｡WOO等使用2個納米過濾器(Exodisc)集成的實驗盤在30min內實現了20-600nm外泌體的全自動富集｡使用納米粒子跟蹤分析定量檢測證實了細胞培養上清液中外泌體的回收率大於95%｡與超速離心法相比,Exodisc提供了高出100倍的mRNA水平,更省時,所需樣本量更少｡FANG等開發了一種微流體晶元,將包裹了抗CD63的磁珠與血漿樣品通入晶元,在第1個腔室中捕獲到外泌體,通入一抗與磁珠-外泌體混合物結合,再通入熒游標記的二抗形成磁珠-外泌體-一抗-二抗混合物聚集在第2個腔室｡微流控晶元法操作簡單,捕獲率高,特別適合於生物學研究｡外泌體作為癌症診斷的有前景的生物學標志物,其在癌症的液體 活檢 中受到關注｡外泌體的生物學價值和臨床應用價值凸顯了開發有效提取和分離外泌體技術的重要性和必要性｡相信隨著技術的不斷進步和創新,外泌體提取將變得更加簡便經濟,純度越來越高,完整性越來越好｡
提取後往往需要進一步檢測，確定提取的是不是外泌體。有三種方法：1. 掃描電鏡觀察；2. NTA儀器粒徑檢測；3. WB檢測。如圖所示，在外泌體上往往存在許多標志物，這時候就可以選擇相應的抗體進行WB檢測。根據22 篇外泌體相關文獻的統計，排在前4 位的檢測指標為 CD63（13/22）、Tsg101(8/22)、CD9 和CD81並列第三位（6/22）；接著檢測較多的4 個指標為Alix （4/22）、HSP70(3/22)、flotillin (3/22)和Syntenin (2/22)；此外還有一些指標僅在1 篇文獻中出現過，例如HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、nicastrin、AChE、AQP2、RPL5、a-1AT。針對外泌體的定性檢測至少選擇兩個指標就能滿足文章發表需要了，比如檢測CD63 和Tsg101。
Ⅱ 外泌體相關研究文獻分享,輕松讀完一篇文獻（十九）
分享一篇發表在J Extracell Vesicles（2020年IF=25.83）上的文章，標題為《Active cargo loading into extracellular vesicles: Highlights the heterogeneous encapsulation behaviour》。細胞外囊泡(EVs)是生物納米顆粒，來源於大多數細胞類型，用於調節細胞間通信。它們作為天然分泌的納米囊泡，在葯物傳遞領域展現出巨大潛力，因其固有的生物相容性、合適的尺寸和固有的細胞靶向能力。
盡管EV治療具有獨特優勢，但封裝大量治療分子以穩定使用作為輸送載體仍是一個挑戰。研究主要分為兩類載葯方法：預裝載和後裝載。預裝載涉及將小分子葯物與親本細胞共孵育或轉染葯物編碼DNA到親本細胞，然後分離自然攜帶治療分子的EV。然而，這種方法僅限於培養細胞來源的EV，難以應用於血漿或食物來源的EV。後裝載方法則在被動或主動刺激下，如孵育、超聲、凍融和電穿孔，將葯物載入純化的EV。盡管如此，所有方法都遇到了裝載能力較差的問題，特別是對於親水分子的封裝。
為了提高裝載效率並促進治療葯物封裝，研究提出了一種高效載葯方法，名為「超聲和擠壓輔助主動負載」(SEAL)。該方法通過在硫酸銨中重懸並超聲mEVs，暫時滲透膜以建立主動載入所需的跨膜銨梯度。擠壓操作縮小mEVs，使顆粒尺寸均一，從而重塑不利於載葯和遞送的非球形或多層囊泡。然後用PBS透析散裝溶液，並用阿黴素孵育進行活性負荷。
通過TritonX-100裂解mEVs樣品，檢測熒光信號以確定SEAL的效率。與被動孵育相比，由於葯物封裝更有效，熒光強度增加了10.5倍。顯著的熒光猝滅進一步證實了更多葯物在SEAL制備的mEVs腔內累積。在脂質體模型中也獲得了一致的結果。Western blot檢測顯示超聲和擠壓處理沒有顯著影響mEVs的蛋白含量。
為了優化SEAL的技術參數以改善載葯量，研究發現2-4分鍾的超聲處理和0.5-1M硫酸銨溶液條件效率最佳。延長超聲處理時間或使用更濃縮的溶液都不能在不影響結構完整性的情況下提高封裝效率。擠壓操作結果顯示，超聲處理後的3個擠壓循環足以減小mEVs的尺寸，提高封裝效率。通過多參數分析，揭示了mEVs的封裝異質性與成分方差之間的相關性，進一步指導了純化過程中去除不需要的組分，提高純度。
為了徹底揭示異質性，研究應用nFCM系統對SEAL制備的Dox-mEVs進行單顆粒分析。這提供了更定量的方法來表徵載葯能力，包括活性載率和活性載入效率。研究發現未/低負載顆粒的共存是顯著的，因此採用超濾(UF)、尺寸排除色譜(SEC)和胰蛋白酶處理三種EV純化方法進行了研究，發現SEC和胰蛋白酶處理能夠增加活性負載率，而UF純化導致樣品損失。
研究還分析了封裝異質性與脂質包涵體的相關性，證明只有具有脂質包涵體的顆粒是可主動載入的。脂質探針介導的磁分離技術(LPMIT)用於選擇性去除非脂質封閉顆粒，提高Dox-mEVs樣品的純度。純化的Dox-mEVs樣品的活性負載率進一步提高到63.2%。
牛乳中含有大量酪蛋白，使mEVs的純化和應用更加復雜。因此，研究引入了免疫磁性分離技術(IMIT)以去除所觀察到的酪蛋白成分，並進一步提高活性負載率到83.6%。
研究最後進行了細胞毒性分析和細胞內化行為分析，證明由SEAL制備的裝載mEVs的治療潛力以及樣品純度對整體治療性能的影響。細胞毒性分析顯示空白mEVs的細胞毒性可以忽略不計，而Dox-mEVs表現出強大的細胞毒性反應。細胞內化行為分析則表明轉鐵蛋白偶聯後Dox-mEVs增強了細胞毒性，進一步證實了配體促進的內化。
文章的目的是分享在提高EV葯物封裝效率和改善治療性能方面的最新研究成果。通過引入高效載葯方法和優化純化過程，研究揭示了葯物封裝異質性對治療結果的潛在影響，並證明了SEAL制備的mEVs制劑具有優越的治療性能。有興趣的讀者可以自行查找原文進行更深入的了解和研究。
Ⅲ 實戰分享 | 外泌體提取之經驗小結
近些年來，關於外泌體的研究如火如荼。外泌體在免疫中抗原呈遞、腫瘤的生長與遷移、組織損傷的修復等生理病理上起著重要的作用。同時，不同細胞分泌的外泌體具有不用的組成成分和功能，可作為疾病診斷的生物標志物。 來自華中科技大學同濟醫學院附屬協和醫院的崔老師，對外泌體提取積累了自己的心得，並將自己的研究成果發表在 Bioactive Materials 上。 下文是崔老師的分享。
要進行關於外泌體的研究，提取純化外泌體一直是大家非常關注的問題。 能否獲得較高純度的足量外泌體，直接關系著後續研究能否開展 。雖然目前仍然沒有能同時保證外泌體的含量、純度和生物活性的提取宏氏方法，但是我們可以結合當前的實際情況，對外泌體提取做一些探討和經驗總結。
超速離心（差速離心）法是目前最常用的外泌體提取方法 ，即採用低速離心、高速離心交替進行，可分離到大小相近的囊泡顆粒。超離法因操作簡單，獲得的囊泡數量較多而廣受歡迎。本人近期發表的論文中最後也是採用了這種方法。
具體的步驟大家都比較熟悉，無論是提取血清來源的外泌體，還是細胞條件培養基來源的外泌體 ，大家都習慣於先將血清或者條件培養基收集後保存於-80℃的溫度下，等達到一定量後，再批量進行超速離心。
這樣的話， 大家會發現一個非常嚴重的問題，尤其是在拍攝電鏡的時候——背景雜質很多，並且很多囊泡的形態不夠典型，不鎮絕雀是文獻中描述的那種典型的雙凹圓盤狀或者茶托狀。
通過幾次實驗的對比，我大概發現了原因， 主要是由於在凍存收集到培養基的時候，沒有進行低速離心和普通高速離心。
低速離心可以去除培養基中的未貼壁細胞、死細胞以及大的細胞殘骸，而普通高速離心可以去除其中的大型細胞外囊泡。無論是未貼壁細胞、死細胞、大的細胞殘骸，還是大型細胞外囊泡，在-80℃凍存及復溫的過程中，都會發生破裂，產生小型的細胞膜碎片結構。
這樣的話，就導致了電鏡背景很雜亂，難以達到高水平論文雜志期刊的要求。另外，還會導致這御早樣一個矛盾現象，即蛋白定量中計算的外泌體產量虛高，而蛋白免疫印跡中外泌體標記物蛋白的含量卻不高。
因此，在這里推薦給大家一個小貼士
就是在收集准備提取外泌體的條件培養基或者血清時，一定要提前做到低速離心和普通高速離心這一步，尤其是為了做透射電鏡或者蛋白免疫印跡實驗而提取的外泌體 ，一定要注意這一點。盡管過程比較費時，但是能生產出有用的結果才是更重要的。
至於其他的外泌體提取方法，如密度梯度離心、色譜柱、超濾離心法、微流控晶元法、磁珠免疫法、多聚物沉澱法，我看到學校裡面鮮少有人去嘗試，畢竟更麻煩。但不同的方法各有優劣，大家可根據自己的實驗，謹慎選用。