超濾膜鹼性蛋白酶截流率

Ⅰ 求一種多糖的分離和葯物活性

2.1 概述
 在自然科學，尤其是生命科學高度發展的今天，蛋白質、酶和核酸等生物大分子的結構與功能的研究是探求生命奧秘的中心課題，而生物大分子結構與功能的研究，必須首先解決生物大分子的制備問題，有能夠達到足夠純度的生物大分子的制備工作為前題，結構與功能的研究就無從談起。然而生物大分子的分離純化與制備是一件十分細致而困難的工作。

 與化學產品的分離制備相比較，生物大分子的制備有以下主要特點：
 ⑴生物材料的組成極其復雜，常常包含有數百種乃至幾千種化合物。
 ⑵許多生物大分子在生物材料中的含量極微，分離純化的步驟繁多，流程長。
 ⑶許多生物大分子一旦離開了生物體內的環境時就極易失活，因此分離過程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制備最困難之處。
 ⑷生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進行的，溫度、pH值、離子強度等各種參數對溶液中各種組成的綜合影響，很難准確估計和判斷。

 生物大分子的制備通常可按以下步驟進行：
 ①確定要制備的生物大分子的目的和要求，是進行科研、開發還是要發現新的物質。
 ②建立相應的可靠的分析測定方法，這是制備生物大分子的關鍵。
 ③通過文獻調研和預備性實驗，掌握生物大分子目的產物的物理化學性質。
 ④生物材料的破碎和預處理。
 ⑤分離純化方案的選擇和探索，這是最困難的過程。
 ⑥生物大分子制備物的均一性（即純度）的鑒定，要求達到一維電泳一條帶，二維電泳一個點，或HPLC和毛細管電泳都是一個峰。
 ⑦產物的濃縮，乾燥和保存。


 分析測定的方法主要有兩類：
 即生物學和物理、化學的測定方法。
 生物學的測定法主要有：酶的各種測活方法、蛋白質含量的各種測定法、免疫化學方法、放射性同位素示蹤法等；
 物理、化學方法主要有：比色法、氣相色譜和液相色譜法、光譜法（紫外／可見、紅外和熒光等分光光度法）、電泳法、以及核磁共振等。
 實際操作中盡可能多用儀器分析方法，以使分析測定更加快速、簡便。

要了解的生物大分子的物理、化學性質主要有：
 ①在水和各種有機溶劑中的溶解性。
 ②在不同溫度、pH 值和各種緩沖液中生物大分子的穩定性。
 ③固態時對溫度、含水量和凍干時的穩定性。
 ④各種物理性質：如分子的大小、穿膜的能力、帶電的情況、在電場中的行為、離心沉降的表現、在各種凝膠、樹脂等填料中的分配系數。
 ⑤其他化學性質：如對各種蛋白酶、水解酶的穩定性和對各種化學試劑的穩定性。
 ⑥對其他生物分子的特殊親和力。

 制備生物大分子的分離純化方法多種多樣，主要是利用它們之間特異性的差異，如分子的大小、形狀、酸鹼性、溶解性、溶解度、極性、電荷和與其他分子的親和性等。
 各種方法的基本原理可以歸納為兩個方面：
 ①利用混合物中幾個組分分配系數的差異，把它們分配到兩個或幾個相中，如鹽析、有機溶劑沉澱、層析和結晶等；
 ②將混合物置於某一物相（大多數是液相）中，通過物理力場的作用，使各組分分配於不同的區域，從而達到分離的目的，如電泳、離心、超濾等。
 目前純化蛋白質等生物大分子的關鍵技術是電泳、層析和高速與超速離心。

 2.2 生物大分子制備的前處理
 2.2.1 生物材料的選擇
 制備生物大分子，首先要選擇適當的生物材料。材料的來源無非是動物、植物和微生物及其代謝產物。
 選擇的材料應含量高、來源豐富、制備工藝簡單、成本低，盡可能保持新鮮，盡快加工處理。
 動物組織要先除去結締組織、脂肪等非活性部分，絞碎後在適當的溶劑中提取，如果所要求的成分在細胞內，則要先破碎細胞。
 植物要先去殼、除脂。
 微生物材料要及時將菌體與發酵液分開。
 生物材料如暫不提取，應冰凍保存。動物材料則需深度冷凍保存。

 2.2.2 細胞的破碎
 不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織，其細胞破碎的難易不一，使用的方法也不相同，如動物臟器的細胞膜較脆弱，容易破碎，植物和微生物由於具有較堅固的纖維素、半纖維素組成的細胞壁，要採取專門的細胞破碎方法。
 (1)機械法：
 1) 研磨：將剪碎的動物組織置於研缽或勻漿器中，加入少量石英砂研磨或勻漿。
 2) 組織搗碎器：這是一種較劇烈的破碎細胞的方法，通常可先用家用食品加工機將組織打碎，然後再用10000r/min～20000r/min的內刀式組織搗碎機(即高速分散器)將組織的細胞打碎。

 (2)物理法：
 1) 反復凍融法：將待破碎的細胞冷至－15℃到－20℃，然後放於室溫(或40℃)迅速融化，如此反復凍融多次，由於細胞內形成冰粒使剩餘胞液的鹽濃度增高而引起細胞溶脹破碎。
 2) 超聲波處理法：此法是藉助超聲波的振動力破碎細胞壁和細胞器。破碎微生物細菌和酵母菌時，時間要長一些。
 3) 壓榨法：這是一種溫和的、徹底破碎細胞的方法。在1000×105Pa～2000×105Pa 的高壓下使細胞懸液通過一個小孔突然釋放至常壓，細胞將徹底破碎。
 4) 冷熱交替法：從細菌或病毒中提取蛋白質和核酸時可用此法。在90℃左右維持數分鍾，立即放入冰浴中使之冷卻，如此反復多次，絕大部分細胞可以被破碎。

 (3)化學與生物化學方法：
 1) 自溶法：將新鮮的生物材料存放於一定的pH和適當的溫度下，細胞結構在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下發生溶解，使細胞內含物釋放出來。
 2) 溶脹法：細胞膜為天然的半透膜，在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中，由於存在滲透壓差，溶劑分子大量進入細胞，將細胞膜脹破釋放出細胞內含物。
 3) 酶解法：利用各種水解酶，如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶和酯酶等，於37℃，pH8，處理15分鍾，可以專一性地將細胞壁分解。
 4) 有機溶劑處理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或SDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細胞，可將細胞膜溶解，從而使細胞破裂，此法也可以與研磨法聯合使用。


 2.2.3 生物大分子的提取
 「提取」是在分離純化之前將經過預處理或破碎的細胞置於溶劑中，使被分離的生物大分子充分地釋放到溶劑中，並盡可能保持原來的天然狀態不丟失生物活性的過程。
 影響提取的因素主要有：
 目的產物在提取的溶劑中溶解度的大小；
 由固相擴散到液相的難易；
 溶劑的pH值和提取時間等。
 通常：
 極性物質易溶於極性溶劑，非極性物質易溶於非極性溶劑；
 鹼性物質易溶於酸性溶劑，酸性物質易溶於鹼性溶劑；
 溫度升高，溶解度加大；
 遠離等電點的pH值，溶解度增加。
 提取時所選擇的條件應有利於目的產物溶解度的增加和保持其生物活性。

 ⑴ 水溶液提取：
 蛋白質和酶的提取一般以水溶液為主。稀鹽溶液和緩沖液對蛋白質的穩定性好，溶解度大，是提取蛋白質和酶最常用的溶劑。用水溶液提取生物大分子應注意的幾個主要影響因素是：
 1) 鹽濃度（即離子強度）：
 離子強度對生物大分子的溶解度有極大的影響，有些物質，如DNA-蛋白復合物，在高離子強度下溶解度增加。
 絕大多數蛋白質和酶，在低離子強度的溶液中都有較大的溶解度，如在純水中加入少量中性鹽，蛋白質的溶解度比在純水時大大增加，稱為「鹽溶」現象。鹽溶現象的產生主要是少量離子的活動，減少了偶極分子之間極性基團的靜電吸引力，增加了溶質和溶劑分子間相互作用力的結果。
 為了提高提取效率，有時需要降低或提高溶劑的極性。向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其極性降低，增加離子強度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4）可以增加溶液的極性。


 2) pH值：蛋白質、酶與核酸的溶解度和穩定性與pH值有關。過酸、過鹼均應盡量避免，一般控制在pH=6～8范圍內，提取溶劑的pH應在蛋白質和酶的穩定范圍內，通常選擇偏離等電點的兩側。
 3) 溫度：為防止變性和降解，制備具有活性的蛋白質和酶，提取時一般在0℃～5℃的低溫操作。
 4) 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：加入抑制劑或調節提取液的pH、離子強度或極性等方法使相應的水解酶失去活性，防止它們對欲提純的蛋白質、酶及核酸的降解作用。

 5) 攪拌與氧化：攪拌能促使被提取物的溶解，一般採用溫和攪拌為宜，速度太快容易產生大量泡沫，增大了與空氣的接觸面，會引起酶等物質的變性失活。因為一般蛋白質都含有相當數量的巰基，有些巰基常常是活性部位的必需基團，若提取液中有氧化劑或與空氣中的氧氣接觸過多都會使巰基氧化為分子內或分子間的二硫鍵，導致酶活性的喪失。在提取液中加入少量巰基乙醇或半胱氨酸以防止巰基氧化。

 ⑵ 有機溶劑提取
 一些和脂類結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶難溶於水、稀鹽、稀酸、或稀鹼中，常用不同比例的有機溶劑提取。
 常用的有機溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮等，這些溶劑可以與水互溶或部分互溶，同時具有親水性和親脂性。
 有些蛋白質和酶既溶於稀酸、稀鹼，又能溶於含有一定比例的有機溶劑的水溶液中，在這種情況下，採用稀的有機溶液提取常常可以防止水解酶的破壞，並兼有除去雜質提高純化效果的作用。
例如，胰島素（見講義p36）。

 2.3 生物大分子的分離純化
 由於生物體的組成成分是如此復雜，數千種乃至上萬種生物分子又處於同一體系中，因此不可能有一個適合於各類分子的固定的分離程序，但多數分離工作關鍵部分的基本手段是相同的。
 為了避免盲目性，節省實驗探索時間，要認真參考和借鑒前人的經驗，少走彎路。常用的分離純化方法和技術有：
 沉澱法（包括：鹽析、有機溶劑沉澱、選擇性沉澱等）、離心、吸附層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析、快速制備型液相色譜以及等電聚焦制備電泳等。本章以介紹沉澱法為主。

 2.3.1 沉澱法
 沉澱是溶液中的溶質由液相變成固相析出的過程。沉澱法（即溶解度法）操作簡便，成本低廉，不僅用於實驗室中，也用於某些生產目的的制備過程，是分離純化生物大分子，特別是制備蛋白質和酶時最常用的方法。通過沉澱，將目的生物大分子轉入固相沉澱或留在液相，而與雜質得到初步的分離。
 其基本原理是根據不同物質在溶劑中的溶解度不同而達到分離的目的，不同溶解度的產生是由於溶質分子之間及溶質與溶劑分子之間親和力的差異而引起的，溶解度的大小與溶質和溶劑的化學性質及結構有關，溶劑組分的改變或加入某些沉澱劑以及改變溶液的pH值、離子強度和極性都會使溶質的溶解度產生明顯的改變。

 在生物大分子制備中最常用的幾種沉澱方法是：
 ⑴中性鹽沉澱（鹽析法）：多用於各種蛋白質和酶的分離純化。
 ⑵有機溶劑沉澱：多用於蛋白質和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分離純化。
 ⑶選擇性沉澱（熱變性沉澱和酸鹼變性沉澱）：多用於除去某些不耐熱的和在一定pH值下易變性的雜蛋白。
 ⑷等電點沉澱：用於氨基酸、蛋白質及其他兩性物質的沉澱，但此法單獨應用較少，多與其他方法結合使用。
 ⑸有機聚合物沉澱： 是發展較快的一種新方法， 主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作為沉澱劑。

 2.3.1.1 中性鹽沉澱（鹽析法）
 在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉澱析出的過程稱為「鹽析」。除了蛋白質和酶以外，多肽、多糖和核酸等都可以用鹽析法進行沉澱分離。
 鹽析法應用最廣的還是在蛋白質領域，已有八十多年的歷史，其突出的優點是：
 ①成本低，不需要特別昂貴的設備。
 ②操作簡單、安全。
 ③對許多生物活性物質具有穩定作用。

 ⑴ 中性鹽沉澱蛋白質的基本原理
 蛋白質和酶均易溶於水，因為該分子的－COOH、－NH2和－OH都是親水基團，這些基團與極性水分子相互作用形成水化層，包圍於蛋白質分子周圍形成1nm～100nm顆粒的親水膠體，削弱了蛋白質分子之間的作用力，蛋白質分子表面極性基團越多，水化層越厚，蛋白質分子與溶劑分子之間的親和力越大，因而溶解度也越大。親水膠體在水中的穩定因素有兩個：即電荷和水膜。因為中性鹽的親水性大於蛋白質和酶分子的親水性，所以加入大量中性鹽後，奪走了水分子，破壞了水膜，暴露出疏水區域，同時又中和了電荷，破壞了親水膠體，蛋白質分子即形成沉澱。鹽析示意圖如下頁「圖 4」所示。

 ⑵ 中性鹽的選擇
 常用的中性鹽中最重要的是（NH4）2SO4，因為它與其他常用鹽類相比有十分突出的優點：
 1) 溶解度大：尤其是在低溫時仍有相當高的溶解度，這是其他鹽類所不具備的。由於酶和各種蛋白質通常是在低溫下穩定，因而鹽析操作也要求在低溫下（0～4℃）進行。由下表可以看到， 硫銨在0℃時的溶解度，遠遠高於其它鹽類：
 表2-1 幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克/100毫升水）
 0℃ 20℃ 80℃ 100 ℃
（NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103
 Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2
 NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101






 2) 分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨
鹽析，一步就可以除去75％的雜蛋白，純
度提高了四倍。
 3) 不易引起變性，有穩定酶與蛋白質結構的
作用。有的酶或蛋白質用2～3mol/L濃度的
（NH4）2SO4保存可達數年之久。
 4) 價格便宜，廢液不污染環境。

 ⑶ 鹽析的操作方法
 最常用的是固體硫酸銨加入法。將其研成細粉，在攪拌下緩慢均勻少量多次地加入，接近計劃飽和度時，加鹽的速度更要慢一些，盡量避免局部硫酸銨濃度過大而造成不應有的蛋白質沉澱。鹽析後要在冰浴中放置一段時間，待沉澱完全後再離心與過濾。
 在低濃度硫酸銨中鹽析可採用離心分離，高濃度硫酸銨常用過濾方法。
 各種飽和度下需加固體硫酸銨的量可由附錄中查出。

 ⑷ 鹽析曲線的製作
 如果要分離一種新的蛋白質和酶，沒有文獻數據可以借鑒，則應先確定沉澱該物質的硫酸銨飽和度。具體操作方法如下(講義p39)：

蛋白質量(mg)或酶活力

10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫銨飽
和度％

 ⑸鹽析的影響因素
 1) 蛋白質的濃度：高濃度的蛋白質用稍低的硫酸銨飽和度沉澱，若蛋白質濃度過高，易產生各種蛋白質的共沉澱作用。低濃度的蛋白質，共沉澱作用小，但回收率降低。較適中的蛋白質濃度是2.5％～3.0％，相當於25 mg/mL～30mg/mL。
 2) pH值對鹽析的影響：在等電點處溶解度小，pH值常選在該蛋白質的等電點附近。
 3) 溫度的影響：對於蛋白質、酶和多肽等生物大分子，在高離子強度溶液中，溫度升高，它們的溶解度反而減小。在低離子強度溶液或純水中蛋白質的溶解度大多數還是隨濃度升高而增加的。一般情況下，可在室溫下進行。但對於某些對溫度敏感的酶，要求在0℃～4℃下操作，以避免活力喪失。


 2.3.1.2 有機溶劑沉澱法
 ⑴基本原理
 有機溶劑對於許多蛋白質（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質都能發生沉澱作用，是較早使用的沉澱方法之一。其原理主要是：
 ①降低水溶液的介電常數，向溶液中加入有機溶劑能降低溶液的介電常數，減小溶劑的極性，從而削弱了溶劑分子與蛋白質分子間的相互作用力，導致蛋白質溶解度降低而沉澱。
 ②由於使用的有機溶劑與水互溶，它們在溶解於水的同時從蛋白質分子周圍的水化層中奪走了水分子，破壞了蛋白質分子的水膜，因而發生沉澱作用。


 有機溶劑沉澱法的優點是：
 ①分辨能力比鹽析法高，即一種蛋白質或其他溶質只在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內沉澱。
 ②沉澱不用脫鹽，過濾比較容易（如有必要，可用透析袋脫有機溶劑）。因而在生化制備中有廣泛的應用。
 其缺點是對某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活，操作需在低溫下進行。
 ⑵有機溶劑的選擇和濃度的計算
 用於生化制備的有機溶劑的選擇首先是要能與水互溶。沉澱蛋白質和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮。
 為了獲得沉澱而不著重於進行分離，可用溶液體積的倍數：如加入一倍、二倍、三倍原溶液體積的有機溶劑，來進行有機溶劑沉澱。

 ⑶有機溶劑沉澱的影響因素
 1) 溫度：多數生物大分子如蛋白質、酶和核酸在有機溶劑中對溫度特別敏感，溫度稍高就會引起變性，且有機溶劑與水混合時產生放熱反應，因此必須預冷，操作要在冰鹽浴中進行，加入有機溶劑時必須緩慢且不斷攪拌以免局部過濃。
 一般規律是溫度越低，得到的蛋白質活性越高。
 2) 樣品濃度：低濃度樣品回收率低，要使用比例更大的有機溶劑進行沉澱。高濃度樣品，可以節省有機溶劑，減少變性的危險，但雜蛋白的共沉澱作用大。
 通常使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白質初濃度為宜。


 3) pH值：選擇在樣品穩定的pH值范圍內，通常是選在等電點附近，從而提高此沉澱法的分辨能力。
 4) 離子強度：鹽濃度太大或太小都有不利影響，通常鹽濃度以不超過5％為宜，使用乙醇的量也以不超過原蛋白質水溶液的2倍體積為宜，少量的中性鹽對蛋白質變性有良好的保護作用，但鹽濃度過高會增加蛋白質在水中的溶解度，降低了沉澱效果，通常是在低濃度緩沖液中沉澱蛋白質。
 沉澱所得的固體樣品，如果不是立即溶解進行下一步的分離，則應盡可能抽干沉澱，減少其中有機溶劑的含量，如若必要可以裝透析袋透析脫有機溶劑，以免影響樣品的生物活性。

 2.3.1.3 選擇性變性沉澱法
 這一方法是利用生物大分子與非目的生物大分子在物理化學性質等方面的差異，選擇一定的條件使雜蛋白等非目的物變性沉澱而得到分離提純。
 ⑴ 熱變性
 利用生物大分子對熱的穩定性不同，加熱升高溫度使非目的生物大分子變性沉澱而保留目的物在溶液中。
 ⑵ 表面活性劑和有機溶劑變性
 使那些對表面活性劑和有機溶劑敏感性強的雜蛋白變性沉澱。通常在冰浴或冷室中進行。
 ⑶ 選擇性酸鹼變性
 利用對pH值的穩定性不同而使雜蛋白變性沉澱。通常是在分離純化流程中附帶進行的分離純化步驟。

 2.3.1.4 等電點沉澱法
 利用具有不同等電點的兩性電解質，在達到電中性時溶解度最低，易發生沉澱，從而實現分離的方法。氨基酸、蛋白質、酶和核酸都是兩性電解質，可以利用此法進行初步的沉澱分離。
 由於許多蛋白質的等電點十分接近，而且帶有水膜的蛋白質等生物大分子仍有一定的溶解度，不能完全沉澱析出，因此，單獨使用此法解析度較低，因而此法常與鹽析法、有機溶劑沉澱法或其他沉澱劑一起配合使用，以提高沉澱能力和分離效果。
 此法主要用於在分離純化流程中去除雜蛋白，而不用於沉澱目的物。

 2.3.1.5 有機聚合物沉澱法
 有機聚合物是六十年代發展起來的一類重要的沉澱劑，最早應用於提純免疫球蛋白和沉澱一些細菌和病毒。近年來廣泛用於核酸和酶的純化。其中應用最多的是
「聚乙二醇」【HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n ＞4)】( Polyethylene Glycol 簡寫為 PEG )，它的親水性強，溶干水和許多有機溶劑，對熱穩定，有廣泛圍的分子量，在生物大分子制備中，用的較多的是分子量為6000～20000的 PEG。
 本方法的優點是：
 ①操作條件溫和，不易引起生物大分子變性。
 ②沉澱效能高，使用很少量的P「EG即可以沉澱相當多
的生物大分子。
 ③沉澱後有機聚合物容易去除。

 2.3.2 透析
 自Thomas Graham 1861年發明透析方法至今已有一百多年。透析已成為生物化學實驗室最簡便最常用的分離純化技術之一。在生物大分子的制備過程中，除鹽、除少量有機溶劑、除去生物小分子雜質和濃縮樣品等都要用到透析的技術。
 透析只需要使用專用的半透膜即可完成。保留在透析袋內未透析出的樣品溶液稱為「保留液」，袋（膜）外的溶液稱為「滲出液」或「透析液」。截留分子量MwCO通常為1萬左右。
 用1％ BaCl2檢查(NH4)2SO4，用1％ AgNO3 檢查NaCl、KCl等。

 2.3.3 超濾
 超過濾即超濾，自20年代問世後，直至60年代以來發展迅速，很快由實驗室規模的分離手段發展成重要的工業單元操作技術。超濾現已成為一種重要的生化實驗技術，廣泛用於含有各種小分子溶質的各種生物大分子（如蛋白質、酶、核酸等）的濃縮、分離和純化。
 超濾是一種加壓膜分離技術，即在一定的壓力下，使小分子溶質和溶劑穿過一定孔徑的特製的薄膜，而使大分子溶質不能透過，留在膜的一邊，從而使大分子物質得到了部分的純化。

 超濾根據所加的操作壓力和所用膜的平均孔徑的不同，可分為微孔過濾、超濾和反滲透三種。
 微孔過濾所用的操作壓通常小於4×104Pa，膜的平均孔徑為500埃～14微米（1微米＝104埃），用於分離較大的微粒、細菌和污染物等。
 超濾所用操作壓為4×104Pa～7×105Pa，膜的平均孔徑為10—100埃，用於分離大分子溶質。
 反滲透所用的操作壓比超濾更大，常達到35×105Pa～140×105Pa，膜的平均孔徑最小，一般為10埃以下，用於分離小分子溶質，如海水脫鹽，制高純水等。

 超濾技術的優點是操作簡便，成本低廉，不需增加任何化學試劑，尤其是超濾技術的實驗條件溫和，與蒸發、冰凍乾燥相比沒有相的變化，而且不引起溫度、pH的變化，因而可以防止生物大分子的變性、失活和自溶。
 在生物大分子的制備技術中，超濾主要用於生物大分子的脫鹽、脫水和濃縮等。
 超濾法也有一定的局限性，它不能直接得到乾粉制劑。對於蛋白質溶液，一般只能得到10～50％的濃度。

 超濾技術的關鍵是膜。
 常用的膜是由乙酸纖維或硝酸纖維或此二者的混合物製成。近年來發展了非纖維型的各向異性膜，例如聚碸膜、聚碸醯胺膜和聚丙烯腈膜等。這種膜在pH 1～14都是穩定的，且能在90℃下正常工作。超濾膜通常是比較穩定的，能連續用1～2年。
 超濾膜的基本性能指標：水通量（cm3/(cm2•h)）；截留率（以百分率％表示）；化學物理穩定性（包括機械強度）等。
 超濾裝置由若干超濾組件構成。分為板框式、管式、螺旋卷式和中空纖維式四種主要類型。
 由於超濾法處理的液體多數是含有水溶性生物大分子、有機膠體、多糖及微生物等。這些物質極易粘附和沉積於膜表面上，造成嚴重的濃差極化和堵塞，這是超濾法最關鍵的問題，要克服濃差極化，通常可加大液體流量，加強湍流和加強攪拌。

 2.3.4 冰凍乾燥
 冰凍乾燥機是生化與分子生物學實驗室必備的儀器之一，因為大多數生物大分子分離純化後的最終產品多數是水溶液，要從水溶液中得到固體產品，最好的辦法就是冰凍乾燥

Ⅱ 超濾膜的常見污染是什麼清洗方法是什麼

超濾膜的清洗，又可分為物理清洗法和化學清洗法兩種。

一、物理清洗法：

在這方面用的最多最普遍的就是水力沖洗法。它又可因水力沖洗方向的不同，分為逆向沖洗、反沖洗和正洗沖洗。

酸性清洗劑常用的有0.1N鹽酸溶液，0.1M草酸溶液，1～3%檸檬酸、檸檬酸胺、EDTA等。這類清洗劑在去除鈣離子、鎂離子、氟離子等金屬離子及其氫氧化物，無機鹽凝膠層是較為有效的。

鹼性清洗劑主要是0.1～0.5%的NaOH水溶液。它對去除蛋白質，油脂類的污染具有良好的效果。

氧化性清洗劑如1～1.5%雙氧水、0.5～1%NaOCl、0.05～0.1%疊氮酸鈉等，對去除有機物質的污染有顯著效果。

生物酶制劑如1%胃蛋白酶、胰蛋白酶等，對去除蛋白質、多糖、油脂類的污染是有效的。對去除有機物污染也有一定效果。應用酶清洗劑時，如能在55～60℃下進行清洗效果更佳。清洗時間的長短與酶濃度的高低有關。

超濾膜在特定條件下採用化學清洗方法雖是必要，但使用時須慎重。要避免化學清洗劑破壞膜的分離性能；不能使污染物發生變形，加重膜的污染；不應破壞污染物的膠體性質，使它變硬僵化。在食品工業，醫葯工業生產中，不能讓清洗劑的殘留物影響產品質量等。

Ⅲ 蛋白質層析、超濾常用技術手段

在分離分析特別是蛋白質分離分析中，層析是相當重要、且相當常見的一種技術，其原理較為復雜，對人員的要求相對較高，這里只能做一個相對簡單的介紹。
一、 吸附層析
1、 吸附柱層析
吸附柱層析是以固體吸附劑為固定相，以有機溶劑或緩沖液為流動相構成柱的一種層析方法。
2、 薄層層析
薄層層析是以塗布於玻板或滌綸片等載體上的基質為固定相，以液體為流動相的一種層析方法。這種層析方法是把吸附劑等物質塗布於載體上形成薄層，然後按紙層析操作進行展層。
3、 聚醯胺薄膜層析
聚醯胺對極性物質的吸附作用是由於它能和被分離物之間形成氫鍵。這種氫鍵的強弱就決定了被分離物與聚醯胺薄膜之間吸附能力的大小。層析時，展層劑與被分離物在聚醯胺膜表面競爭形成氫鍵。因此選擇適當的展層劑使分離在聚醯胺膜表面發生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的連續過程，就能導致分離物質達到分離目的。
二、 離子交換層析
離子交換層析是在以離子交換劑為固定相，液體為流動相的系統中進行的。離子交換劑是由基質、電荷基團和反離子構成的。離子交換劑與水溶液中離子或離子化合物的反應主要以離子交換方式進行，或藉助離子交換劑上電荷基團對溶液中離子或離子化合物的吸附作用進行。`
三、 凝膠過濾
凝膠過濾又叫分子篩層析，其原因是凝膠具有網狀結構，小分子物質能進入其內部，而大分子物質卻被排除在外部。當一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質就按不同分子量篩分開了。
四、 親和層析
親和層析的原理與眾所周知的抗原一抗體、激素一受體和酶一底物等特異性反應的機理相類似，每對反應物之間都有一定的親和力。正如在酶與底物的反應中，特異的廢物(S')才能和一定的酶(E)結合，產生復合物(E－S')一樣。在親和層析中是特異的配體才能和一定的生命大分子之間具有親和力，並產生復合物。而親和層析與酶一底物反應不同的是，前者進行反應時，配體(類似底物)是固相存在；後者進行反應時，底物呈液相存在。實質上親和層析是把具有識別能力的配體L(對酶的配體可以是類似底物、抑制劑或輔基等)以共價鍵的方式固化到含有活化基團的基質M(如活化瓊脂糖等)上，製成親和吸附劑M－L，或者叫做固相載體。而固化後的配體仍保持束縛特異物質的能力。因此，當把圍相載體裝人小層析柱(幾毫升到幾十毫升床體積)後，讓欲分離的樣品液通過該柱。這時樣品中對配體有親和力的物質S就可藉助靜電引力、范德瓦爾力，以及結構互補效應等作用吸附到固相載體上，而無親和力或非特異吸附的物質則被起始緩沖液洗滌出來，並形成了第一個層析峰。然後，恰當地改變起始緩沖 液的PH值、或增加離子強度、或加人抑③劑等因子，即可把物質S從固相載體上解離下來，並形成了第M個層析峰(見圖6－2)。顯然，通過這一操作程序就可把有效成分與雜質滿意地分離開。如果樣品液中存在兩個以上的物質與固相載體具有親和力(其大小有差異)時，採用選擇性緩沖液進行洗脫，也可以將它們分離開。用過的固相載體經再生處理後，可以重復使用。
上面介紹的親和層析法亦稱特異性配體親和層析法。除此之外，還有一種親和層析法叫通用性配體親和層析法。這兩種親和層析法相比，前者的配體一般為復雜的生命大分子物質(如抗體、受體和酶的類似底物等)，它具有較強的吸附選擇性和較大的結合力。而後者的配體則一般為簡單的小分子物質(如金屬、染料，以及氨基酸等)，它成本低廉、具有較高的吸附容量，通過改善吸附和脫附條件可提高層析的解析度。
五、 聚焦層析
聚焦層析也是一種柱層析。因此，它和另外的層析一樣，照例具有流動相，其流動相為多緩沖劑，固定相為多緩沖交換劑。
聚焦層析原理可以從PH梯度溶液的形成、蛋白質的行為和聚焦效應三方面來闡述。
1、PH梯度溶液的形成
在離子交換層析中，PH梯度溶液的形成是靠梯度混合儀實現的。例如，當使用陰離子 劑進行層析時，制備PH由高到低呈線性變化的梯度溶液的方法是，在梯度儀的混合室(這層析柱者)中裝高PH溶液，而在另一室裝低PH極限溶液，然後打開層析柱的下端出口，讓洗脫液連續不斷地流過柱體。這時從柱的上部到下部溶液的PH值是由高到低變化的。而在聚焦層析中，當洗脫液流進多緩沖交換劑時，由於交換劑帶具有緩沖能力的電荷基團，故PH梯度溶液可以自動形成。例如，當柱中裝陰離子交換劑PBE94(作固定相)時，先用起始緩沖液(配方見表了一2)平衡到PHg，再用含PH6的多緩沖劑物質(作流動相)的淋洗液通過柱體，這時多緩沖劑中酸性最強的組分與鹼性陰離子交換對結合發生中和作用。隨著淋洗液的不斷加人，住內每點的PH值從高到低逐漸下降。照此處理J段時間，從層析柱頂部到底部就形成了PH6～9的梯度。聚焦層析柱中的PH梯度溶液是在淋洗過程中自動形成的，但是隨著淋洗的進行，PH梯度會逐漸向下遷移，從底部流出液的PH卻由9逐漸降至6，並最後恆定於此值，這時層析柱的PH梯度也就消失了。
2．蛋白質的行為
蛋白質所帶電荷取決於它的等電點(PI)和層析柱中的PH值。當柱中的PH低於蛋白質的PI時，蛋白質帶正電荷，且不與陰離於交換劑結合。而隨著洗脫劑向前移動，固定相中的PH值是隨著淋洗時間延長而變化的。當蛋白質移動至環境PH高於其PI時，蛋白質由帶正電行變為帶負電荷，並與陰離子交換劑結合。由於洗脫劑的通過，蛋白質周圍的環境PH 再次低於PI時，它又帶正電荷，並從交換劑解吸下來。隨著洗脫液向柱底的遷移，上述過程將反復進行，於是各種蛋白質就在各自的等電點被洗下來，從而達到了分離的目的。
不同蛋白質具有不同的等電點，它們在被離子交換劑結合以前，移動之距離是不同的，洗脫出來的先後次序是按等電點排列的。

供靜脈注射的25%人胎盤血白蛋白（即胎白）通常是用硫酸銨鹽析法、透析脫鹽、真空濃縮等工藝制備的，該工藝流程硫酸銨耗量大，能源消耗多，操作時間長，透析過程易產生污染。改用超濾工藝後，平均回收率可達97.18%；吸附損失為1.69%；透過損失為1.23%；截留率為98.77%。大幅度提高了白蛋白的產量和質量，每年可節省硫酸銨6.2噸，自來水16000噸。目前國外生產超濾膜和超濾裝置最有名的廠家是美國的Milipore公司和德國的Sartorius公司。
隨著現代生物技術的發展, 通過基因工程生產蛋白質葯物在治療人類面臨的重大疾病如癌症等方面展示出巨大的潛力. 為滿足生物技術產品工業化生產的需要, 開發高通量、低成本、高效的分離純化方法已引起人們的高度關注. 超濾技術由於具有通量高, 操作條件溫和, 易於放大等特點, 特別適合生物活性大分子的分離. 在生物技術領域, 超濾技術目前已廣泛應用於細胞收集分離、除菌消毒、緩沖液置換、分級( fract ionatio n) 、脫鹽及濃縮[ 1] . 近年來越來越多的研究表明, 通過選擇適當的膜或膜表面改性,以及對分離過程進行優化, 充分利用和調控膜—蛋白質以及蛋白質—蛋白質之間的靜電相互作用, 可以實現分子量相近的兩種蛋白質的高選擇性超濾分離[2- 7] .

為克服常規蛋白質超濾分離過程優化中存在的實驗蛋白質消耗多、工作量大、費時以及費用高等缺點, 我們相繼開發了脈沖進樣技術( Pulsed sampleinject ion technique ) [8]和參數連續變化超濾技術( Parameter scanning ultraf ilt ration) [9]. 並以此為基礎, 結合載體相超濾技術( Carrier phase ult rafil—t rat ion) [10]進一步提出了一種蛋白質超濾分離快速優化新方法[11], 實現了人血漿白蛋白—免疫球蛋白[12]、人源化單克隆抗體( A lemtuzumab) 單體— 二聚體[13]的超濾分離過程快速優化和高選擇性分離,並在膜的篩選及其適用性快速評估方面展現出巨大的潛力. 該方法的主要特徵是與AKTA Prime 系統聯用, 採用脈動進樣技術顯著減少了蛋白質的用量;而利用雙緩沖體系( 類似梯度洗脫) 的參數連續變化超濾技術, 在pH 或離子強度連續變化的情況下考查pH 或離子強度對蛋白質透過率或截留率的影響, 進一步縮短了實驗時間, 降低了蛋白質的用量,極大地減少了實驗量, 加快了過程優化進程; 另外,載體相超濾技術的應用則可保證超濾分離自始至終在設定的條件下進行, 從而最大限度地保證超濾過程的穩定性.

Ⅳ 與化學產品的分離制備相比較，生物大分子的制備有什麼特點

2.1 概述 ? 在自然科學,尤其是生命科學高度發展的今天,蛋白質、酶和核酸等生物大分子的結構與功能的研究是探求生命奧秘的中心課題,而生物大分子結構與功能的研究,必須首先解決生物大分子的制備問題,有能夠達到足夠純度的生物大分子的制備工作為前題,結構與功能的研究就無從談起.然而生物大分子的分離純化與制備是一件十分細致而困難的工作. ? 與化學產品的分離制備相比較,生物大分子的制備有以下主要特點： ? ⑴生物材料的組成極其復雜,常常包含有數百種乃至幾千種化合物. ? ⑵許多生物大分子在生物材料中的含量極微,分離純化的步驟繁多,流程長. ? ⑶許多生物大分子一旦離開了生物體內的環境時就極易失活,因此分離過程中如何防止其失活,就是生物大分子提取制備最困難之處. ? ⑷生物大分子的制備幾乎都是在溶液中進行的,溫度、pH值、離子強度等各種參數對溶液中各種組成的綜合影響,很難准確估計和判斷. ? 生物大分子的制備通常可按以下步驟進行： ? ①確定要制備的生物大分子的目的和要求,是進行科研、開發還是要發現新的物質. ? ②建立相應的可靠的分析測定方法,這是制備生物大分子的關鍵. ? ③通過文獻調研和預備性實驗,掌握生物大分子目的產物的物理化學性質. ? ④生物材料的破碎和預處理. ? ⑤分離純化方案的選擇和探索,這是最困難的過程. ? ⑥生物大分子制備物的均一性（即純度）的鑒定,要求達到一維電泳一條帶,二維電泳一個點,或HPLC和毛細管電泳都是一個峰. ? ⑦產物的濃縮,乾燥和保存. ? ? 分析測定的方法主要有兩類： ? 即生物學和物理、化學的測定方法. ? 生物學的測定法主要有：酶的各種測活方法、蛋白質含量的各種測定法、免疫化學方法、放射性同位素示蹤法等； ? 物理、化學方法主要有：比色法、氣相色譜和液相色譜法、光譜法（紫外／可見、紅外和熒光等分光光度法）、電泳法、以及核磁共振等. ? 實際操作中盡可能多用儀器分析方法,以使分析測定更加快速、簡便. 要了解的生物大分子的物理、化學性質主要有： ? ①在水和各種有機溶劑中的溶解性. ? ②在不同溫度、pH 值和各種緩沖液中生物大分子的穩定性. ? ③固態時對溫度、含水量和凍干時的穩定性. ? ④各種物理性質：如分子的大小、穿膜的能力、帶電的情況、在電場中的行為、離心沉降的表現、在各種凝膠、樹脂等填料中的分配系數. ? ⑤其他化學性質：如對各種蛋白酶、水解酶的穩定性和對各種化學試劑的穩定性. ? ⑥對其他生物分子的特殊親和力. ? 制備生物大分子的分離純化方法多種多樣,主要是利用它們之間特異性的差異,如分子的大小、形狀、酸鹼性、溶解性、溶解度、極性、電荷和與其他分子的親和性等. ? 各種方法的基本原理可以歸納為兩個方面： ? ①利用混合物中幾個組分分配系數的差異,把它們分配到兩個或幾個相中,如鹽析、有機溶劑沉澱、層析和結晶等； ? ②將混合物置於某一物相（大多數是液相）中,通過物理力場的作用,使各組分分配於不同的區域,從而達到分離的目的,如電泳、離心、超濾等. ? 目前純化蛋白質等生物大分子的關鍵技術是電泳、層析和高速與超速離心. ? 2.2 生物大分子制備的前處理 ? 2.2.1 生物材料的選擇 ? 制備生物大分子,首先要選擇適當的生物材料.材料的來源無非是動物、植物和微生物及其代謝產物. ? 選擇的材料應含量高、來源豐富、制備工藝簡單、成本低,盡可能保持新鮮,盡快加工處理. ? 動物組織要先除去結締組織、脂肪等非活性部分,絞碎後在適當的溶劑中提取,如果所要求的成分在細胞內,則要先破碎細胞. ? 植物要先去殼、除脂. ? 微生物材料要及時將菌體與發酵液分開. ? 生物材料如暫不提取,應冰凍保存.動物材料則需深度冷凍保存. ? 2.2.2 細胞的破碎 ? 不同的生物體或同一生物體的不同部位的組織,其細胞破碎的難易不一,使用的方法也不相同,如動物臟器的細胞膜較脆弱,容易破碎,植物和微生物由於具有較堅固的纖維素、半纖維素組成的細胞壁,要採取專門的細胞破碎方法. ? (1)機械法： ? 1) 研磨：將剪碎的動物組織置於研缽或勻漿器中,加入少量石英砂研磨或勻漿. ? 2) 組織搗碎器：這是一種較劇烈的破碎細胞的方法,通常可先用家用食品加工機將組織打碎,然後再用10000r/min～20000r/min的內刀式組織搗碎機(即高速分散器)將組織的細胞打碎. ? (2)物理法： ? 1) 反復凍融法：將待破碎的細胞冷至－15℃到－20℃,然後放於室溫(或40℃)迅速融化,如此反復凍融多次,由於細胞內形成冰粒使剩餘胞液的鹽濃度增高而引起細胞溶脹破碎. ? 2) 超聲波處理法：此法是藉助超聲波的振動力破碎細胞壁和細胞器.破碎微生物細菌和酵母菌時,時間要長一些. ? 3) 壓榨法：這是一種溫和的、徹底破碎細胞的方法.在1000×105Pa～2000×105Pa 的高壓下使細胞懸液通過一個小孔突然釋放至常壓,細胞將徹底破碎. ? 4) 冷熱交替法：從細菌或病毒中提取蛋白質和核酸時可用此法.在90℃左右維持數分鍾,立即放入冰浴中使之冷卻,如此反復多次,絕大部分細胞可以被破碎. ? (3)化學與生物化學方法： ? 1) 自溶法：將新鮮的生物材料存放於一定的pH和適當的溫度下,細胞結構在自身所具有的各種水解酶（如蛋白酶和酯酶等）的作用下發生溶解,使細胞內含物釋放出來. ? 2) 溶脹法：細胞膜為天然的半透膜,在低滲溶液和低濃度的稀鹽溶液中,由於存在滲透壓差,溶劑分子大量進入細胞,將細胞膜脹破釋放出細胞內含物. ? 3) 酶解法：利用各種水解酶,如溶菌酶、纖維素酶、蝸牛酶和酯酶等,於37℃,pH8,處理15分鍾,可以專一性地將細胞壁分解. ? 4) 有機溶劑處理法：利用氯仿、甲苯、丙酮等脂溶性溶劑或SDS（十二烷基硫酸鈉）等表面活性劑處理細胞,可將細胞膜溶解,從而使細胞破裂,此法也可以與研磨法聯合使用. ? ? 2.2.3 生物大分子的提取 ? 「提取」是在分離純化之前將經過預處理或破碎的細胞置於溶劑中,使被分離的生物大分子充分地釋放到溶劑中,並盡可能保持原來的天然狀態不丟失生物活性的過程. ? 影響提取的因素主要有： ? 目的產物在提取的溶劑中溶解度的大小； ? 由固相擴散到液相的難易； ? 溶劑的pH值和提取時間等. ? 通常： ? 極性物質易溶於極性溶劑,非極性物質易溶於非極性溶劑； ? 鹼性物質易溶於酸性溶劑,酸性物質易溶於鹼性溶劑； ? 溫度升高,溶解度加大； ? 遠離等電點的pH值,溶解度增加. ? 提取時所選擇的條件應有利於目的產物溶解度的增加和保持其生物活性. ? ⑴ 水溶液提取： ? 蛋白質和酶的提取一般以水溶液為主.稀鹽溶液和緩沖液對蛋白質的穩定性好,溶解度大,是提取蛋白質和酶最常用的溶劑.用水溶液提取生物大分子應注意的幾個主要影響因素是： ? 1) 鹽濃度（即離子強度）： ? 離子強度對生物大分子的溶解度有極大的影響,有些物質,如DNA-蛋白復合物,在高離子強度下溶解度增加. ? 絕大多數蛋白質和酶,在低離子強度的溶液中都有較大的溶解度,如在純水中加入少量中性鹽,蛋白質的溶解度比在純水時大大增加,稱為「鹽溶」現象.鹽溶現象的產生主要是少量離子的活動,減少了偶極分子之間極性基團的靜電吸引力,增加了溶質和溶劑分子間相互作用力的結果. ? 為了提高提取效率,有時需要降低或提高溶劑的極性.向水溶液中加入蔗糖或甘油可使其極性降低,增加離子強度（如加入KCl、NaCl、NH4Cl或(NH4)2SO4）可以增加溶液的極性. ? ? 2) pH值：蛋白質、酶與核酸的溶解度和穩定性與pH值有關.過酸、過鹼均應盡量避免,一般控制在pH=6～8范圍內,提取溶劑的pH應在蛋白質和酶的穩定范圍內,通常選擇偏離等電點的兩側. ? 3) 溫度：為防止變性和降解,制備具有活性的蛋白質和酶,提取時一般在0℃～5℃的低溫操作. ? 4) 防止蛋白酶或核酸酶的降解作用：加入抑制劑或調節提取液的pH、離子強度或極性等方法使相應的水解酶失去活性,防止它們對欲提純的蛋白質、酶及核酸的降解作用. ? 5) 攪拌與氧化：攪拌能促使被提取物的溶解,一般採用溫和攪拌為宜,速度太快容易產生大量泡沫,增大了與空氣的接觸面,會引起酶等物質的變性失活.因為一般蛋白質都含有相當數量的巰基,有些巰基常常是活性部位的必需基團,若提取液中有氧化劑或與空氣中的氧氣接觸過多都會使巰基氧化為分子內或分子間的二硫鍵,導致酶活性的喪失.在提取液中加入少量巰基乙醇或半胱氨酸以防止巰基氧化. ? ⑵ 有機溶劑提取 ? 一些和脂類結合比較牢固或分子中非極性側鏈較多的蛋白質和酶難溶於水、稀鹽、稀酸、或稀鹼中,常用不同比例的有機溶劑提取. ? 常用的有機溶劑有乙醇、丙酮、異丙醇、正丁酮等,這些溶劑可以與水互溶或部分互溶,同時具有親水性和親脂性. ? 有些蛋白質和酶既溶於稀酸、稀鹼,又能溶於含有一定比例的有機溶劑的水溶液中,在這種情況下,採用稀的有機溶液提取常常可以防止水解酶的破壞,並兼有除去雜質提高純化效果的作用. 例如,胰島素（見講義p36）. ? 2.3 生物大分子的分離純化 ? 由於生物體的組成成分是如此復雜,數千種乃至上萬種生物分子又處於同一體系中,因此不可能有一個適合於各類分子的固定的分離程序,但多數分離工作關鍵部分的基本手段是相同的. ? 為了避免盲目性,節省實驗探索時間,要認真參考和借鑒前人的經驗,少走彎路.常用的分離純化方法和技術有： ? 沉澱法（包括：鹽析、有機溶劑沉澱、選擇性沉澱等）、離心、吸附層析、凝膠過濾層析、離子交換層析、親和層析、快速制備型液相色譜以及等電聚焦制備電泳等.本章以介紹沉澱法為主. ? 2.3.1 沉澱法 ? 沉澱是溶液中的溶質由液相變成固相析出的過程.沉澱法（即溶解度法）操作簡便,成本低廉,不僅用於實驗室中,也用於某些生產目的的制備過程,是分離純化生物大分子,特別是制備蛋白質和酶時最常用的方法.通過沉澱,將目的生物大分子轉入固相沉澱或留在液相,而與雜質得到初步的分離. ? 其基本原理是根據不同物質在溶劑中的溶解度不同而達到分離的目的,不同溶解度的產生是由於溶質分子之間及溶質與溶劑分子之間親和力的差異而引起的,溶解度的大小與溶質和溶劑的化學性質及結構有關,溶劑組分的改變或加入某些沉澱劑以及改變溶液的pH值、離子強度和極性都會使溶質的溶解度產生明顯的改變. ? 在生物大分子制備中最常用的幾種沉澱方法是： ? ⑴中性鹽沉澱（鹽析法）：多用於各種蛋白質和酶的分離純化. ? ⑵有機溶劑沉澱：多用於蛋白質和酶、多糖、核酸以及生物小分子的分離純化. ? ⑶選擇性沉澱（熱變性沉澱和酸鹼變性沉澱）：多用於除去某些不耐熱的和在一定pH值下易變性的雜蛋白. ? ⑷等電點沉澱：用於氨基酸、蛋白質及其他兩性物質的沉澱,但此法單獨應用較少,多與其他方法結合使用. ? ⑸有機聚合物沉澱： 是發展較快的一種新方法, 主要使用PEG聚乙二醇（Polyethyene glycol）作為沉澱劑. ? 2.3.1.1 中性鹽沉澱（鹽析法） ? 在溶液中加入中性鹽使生物大分子沉澱析出的過程稱為「鹽析」.除了蛋白質和酶以外,多肽、多糖和核酸等都可以用鹽析法進行沉澱分離. ? 鹽析法應用最廣的還是在蛋白質領域,已有八十多年的歷史,其突出的優點是： ? ①成本低,不需要特別昂貴的設備. ? ②操作簡單、安全. ? ③對許多生物活性物質具有穩定作用. ? ⑴ 中性鹽沉澱蛋白質的基本原理 ? 蛋白質和酶均易溶於水,因為該分子的－COOH、－NH2和－OH都是親水基團,這些基團與極性水分子相互作用形成水化層,包圍於蛋白質分子周圍形成1nm～100nm顆粒的親水膠體,削弱了蛋白質分子之間的作用力,蛋白質分子表面極性基團越多,水化層越厚,蛋白質分子與溶劑分子之間的親和力越大,因而溶解度也越大.親水膠體在水中的穩定因素有兩個：即電荷和水膜.因為中性鹽的親水性大於蛋白質和酶分子的親水性,所以加入大量中性鹽後,奪走了水分子,破壞了水膜,暴露出疏水區域,同時又中和了電荷,破壞了親水膠體,蛋白質分子即形成沉澱.鹽析示意圖如下頁「圖 4」所示. ? ⑵ 中性鹽的選擇 ? 常用的中性鹽中最重要的是（NH4）2SO4,因為它與其他常用鹽類相比有十分突出的優點： ? 1) 溶解度大：尤其是在低溫時仍有相當高的溶解度,這是其他鹽類所不具備的.由於酶和各種蛋白質通常是在低溫下穩定,因而鹽析操作也要求在低溫下（0～4℃）進行.由下表可以看到, 硫銨在0℃時的溶解度,遠遠高於其它鹽類： ? 表2-1 幾種鹽在不同溫度下的溶解度（克/100毫升水） ? 0℃ 20℃ 80℃ 100 ℃ （NH4)2SO4 70.6 75.4 95.3 103 ? Na2SO4 4.9 18.9 43.3 42.2 ? NaH2PO4 1.6 7.8 93.8 101 ? ? ? ? ? 2) 分離效果好：有的提取液加入適量硫酸銨 鹽析,一步就可以除去75％的雜蛋白,純 度提高了四倍. ? 3) 不易引起變性,有穩定酶與蛋白質結構的 作用.有的酶或蛋白質用2～3mol/L濃度的 （NH4）2SO4保存可達數年之久. ? 4) 價格便宜,廢液不污染環境. ? ⑶ 鹽析的操作方法 ? 最常用的是固體硫酸銨加入法.將其研成細粉,在攪拌下緩慢均勻少量多次地加入,接近計劃飽和度時,加鹽的速度更要慢一些,盡量避免局部硫酸銨濃度過大而造成不應有的蛋白質沉澱.鹽析後要在冰浴中放置一段時間,待沉澱完全後再離心與過濾. ? 在低濃度硫酸銨中鹽析可採用離心分離,高濃度硫酸銨常用過濾方法. ? 各種飽和度下需加固體硫酸銨的量可由附錄中查出. ? ⑷ 鹽析曲線的製作 ? 如果要分離一種新的蛋白質和酶,沒有文獻數據可以借鑒,則應先確定沉澱該物質的硫酸銨飽和度.具體操作方法如下(講義p39)： 蛋白質量(mg)或酶活力 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 硫銨飽 和度％ ? ⑸鹽析的影響因素 ? 1) 蛋白質的濃度：高濃度的蛋白質用稍低的硫酸銨飽和度沉澱,若蛋白質濃度過高,易產生各種蛋白質的共沉澱作用.低濃度的蛋白質,共沉澱作用小,但回收率降低.較適中的蛋白質濃度是2.5％～3.0％,相當於25 mg/mL～30mg/mL. ? 2) pH值對鹽析的影響：在等電點處溶解度小,pH值常選在該蛋白質的等電點附近. ? 3) 溫度的影響：對於蛋白質、酶和多肽等生物大分子,在高離子強度溶液中,溫度升高,它們的溶解度反而減小.在低離子強度溶液或純水中蛋白質的溶解度大多數還是隨濃度升高而增加的.一般情況下,可在室溫下進行.但對於某些對溫度敏感的酶,要求在0℃～4℃下操作,以避免活力喪失. ? ? 2.3.1.2 有機溶劑沉澱法 ? ⑴基本原理 ? 有機溶劑對於許多蛋白質（酶）、核酸、多糖和小分子生化物質都能發生沉澱作用,是較早使用的沉澱方法之一.其原理主要是： ? ①降低水溶液的介電常數,向溶液中加入有機溶劑能降低溶液的介電常數,減小溶劑的極性,從而削弱了溶劑分子與蛋白質分子間的相互作用力,導致蛋白質溶解度降低而沉澱. ? ②由於使用的有機溶劑與水互溶,它們在溶解於水的同時從蛋白質分子周圍的水化層中奪走了水分子,破壞了蛋白質分子的水膜,因而發生沉澱作用. ? ? 有機溶劑沉澱法的優點是： ? ①分辨能力比鹽析法高,即一種蛋白質或其他溶質只在一個比較窄的有機溶劑濃度范圍內沉澱. ? ②沉澱不用脫鹽,過濾比較容易（如有必要,可用透析袋脫有機溶劑）.因而在生化制備中有廣泛的應用. ? 其缺點是對某些具有生物活性的大分子容易引起變性失活,操作需在低溫下進行. ? ⑵有機溶劑的選擇和濃度的計算 ? 用於生化制備的有機溶劑的選擇首先是要能與水互溶.沉澱蛋白質和酶常用的是乙醇、甲醇和丙酮. ? 為了獲得沉澱而不著重於進行分離,可用溶液體積的倍數：如加入一倍、二倍、三倍原溶液體積的有機溶劑,來進行有機溶劑沉澱. ? ⑶有機溶劑沉澱的影響因素 ? 1) 溫度：多數生物大分子如蛋白質、酶和核酸在有機溶劑中對溫度特別敏感,溫度稍高就會引起變性,且有機溶劑與水混合時產生放熱反應,因此必須預冷,操作要在冰鹽浴中進行,加入有機溶劑時必須緩慢且不斷攪拌以免局部過濃. ? 一般規律是溫度越低,得到的蛋白質活性越高. ? 2) 樣品濃度：低濃度樣品回收率低,要使用比例更大的有機溶劑進行沉澱.高濃度樣品,可以節省有機溶劑,減少變性的危險,但雜蛋白的共沉澱作用大. ? 通常使用5mg/mL～20mg/mL的蛋白質初濃度為宜. ? ? 3) pH值：選擇在樣品穩定的pH值范圍內,通常是選在等電點附近,從而提高此沉澱法的分辨能力. ? 4) 離子強度：鹽濃度太大或太小都有不利影響,通常鹽濃度以不超過5％為宜,使用乙醇的量也以不超過原蛋白質水溶液的2倍體積為宜,少量的中性鹽對蛋白質變性有良好的保護作用,但鹽濃度過高會增加蛋白質在水中的溶解度,降低了沉澱效果,通常是在低濃度緩沖液中沉澱蛋白質. ? 沉澱所得的固體樣品,如果不是立即溶解進行下一步的分離,則應盡可能抽干沉澱,減少其中有機溶劑的含量,如若必要可以裝透析袋透析脫有機溶劑,以免影響樣品的生物活性. ? 2.3.1.3 選擇性變性沉澱法 ? 這一方法是利用生物大分子與非目的生物大分子在物理化學性質等方面的差異,選擇一定的條件使雜蛋白等非目的物變性沉澱而得到分離提純. ? ⑴ 熱變性 ? 利用生物大分子對熱的穩定性不同,加熱升高溫度使非目的生物大分子變性沉澱而保留目的物在溶液中. ? ⑵ 表面活性劑和有機溶劑變性 ? 使那些對表面活性劑和有機溶劑敏感性強的雜蛋白變性沉澱.通常在冰浴或冷室中進行. ? ⑶ 選擇性酸鹼變性 ? 利用對pH值的穩定性不同而使雜蛋白變性沉澱.通常是在分離純化流程中附帶進行的分離純化步驟. ? 2.3.1.4 等電點沉澱法 ? 利用具有不同等電點的兩性電解質,在達到電中性時溶解度最低,易發生沉澱,從而實現分離的方法.氨基酸、蛋白質、酶和核酸都是兩性電解質,可以利用此法進行初步的沉澱分離. ? 由於許多蛋白質的等電點十分接近,而且帶有水膜的蛋白質等生物大分子仍有一定的溶解度,不能完全沉澱析出,因此,單獨使用此法解析度較低,因而此法常與鹽析法、有機溶劑沉澱法或其他沉澱劑一起配合使用,以提高沉澱能力和分離效果. ? 此法主要用於在分離純化流程中去除雜蛋白,而不用於沉澱目的物. ? 2.3.1.5 有機聚合物沉澱法 ? 有機聚合物是六十年代發展起來的一類重要的沉澱劑,最早應用於提純免疫球蛋白和沉澱一些細菌和病毒.近年來廣泛用於核酸和酶的純化.其中應用最多的是 「聚乙二醇」【HOCH2(CH2OCH2)nCH2OH (n ＞4)】( Polyethylene Glycol 簡寫為 PEG ),它的親水性強,溶干水和許多有機溶劑,對熱穩定,有廣泛圍的分子量,在生物大分子制備中,用的較多的是分子量為6000～20000的 PEG. ? 本方法的優點是： ? ①操作條件溫和,不易引起生物大分子變性. ? ②沉澱效能高,使用很少量的P「EG即可以沉澱相當多 的生物大分子. ? ③沉澱後有機聚合物容易去除. ? 2.3.2 透析 ? 自Thomas Graham 1861年發明透析方法至今已有一百多年.透析已成為生物化學實驗室最簡便最常用的分離純化技術之一.在生物大分子的制備過程中,除鹽、除少量有機溶劑、除去生物小分子雜質和濃縮樣品等都要用到透析的技術. ? 透析只需要使用專用的半透膜即可完成.保留在透析袋內未透析出的樣品溶液稱為「保留液」,袋（膜）外的溶液稱為「滲出液」或「透析液」.截留分子量MwCO通常為1萬左右. ? 用1％ BaCl2檢查(NH4)2SO4,用1％ AgNO3 檢查NaCl、KCl等. ? 2.3.3 超濾 ? 超過濾即超濾,自20年代問世後,直至60年代以來發展迅速,很快由實驗室規模的分離手段發展成重要的工業單元操作技術.超濾現已成為一種重要的生化實驗技術,廣泛用於含有各種小分子溶質的各種生物大分子（如蛋白質、酶、核酸等）的濃縮、分離和純化. ? 超濾是一種加壓膜分離技術,即在一定的壓力下,使小分子溶質和溶劑穿過一定孔徑的特製的薄膜,而使大分子溶質不能透過,留在膜的一邊,從而使大分子物質得到了部分的純化. ? 超濾根據所加的操作壓力和所用膜的平均孔徑的不同,可分為微孔過濾、超濾和反滲透三種. ? 微孔過濾所用的操作壓通常小於4×104Pa,膜的平均孔徑為500埃～14微米（1微米＝104埃）,用於分離較大的微粒、細菌和污染物等. ? 超濾所用操作壓為4×104Pa～7×105Pa,膜的平均孔徑為10—100埃,用於分離大分子溶質. ? 反滲透所用的操作壓比超濾更大,常達到35×105Pa～140×105Pa,膜的平均孔徑最小,一般為10埃以下,用於分離小分子溶質,如海水脫鹽,制高純水等. ? 超濾技術的優點是操作簡便,成本低廉,不需增加任何化學試劑,尤其是超濾技術的實驗條件溫和,與蒸發、冰凍乾燥相比沒有相的變化,而且不引起溫度、pH的變化,因而可以防止生物大分子的變性、失活和自溶. ? 在生物大分子的制備技術中,超濾主要用於生物大分子的脫鹽、脫水和濃縮等. ? 超濾法也有一定的局限性,它不能直接得到乾粉制劑.對於蛋白質溶液,一般只能得到10～50％的濃度. ? 超濾技術的關鍵是膜. ? 常用的膜是由乙酸纖維或硝酸纖維或此二者的混合物製成.近年來發展了非纖維型的各向異性膜,例如聚碸膜、聚碸醯胺膜和聚丙烯腈膜等.這種膜在pH 1～14都是穩定的,且能在90℃下正常工作.超濾膜通常是比較穩定的,能連續用1～2年. ? 超濾膜的基本性能指標：水通量（cm3/(cm2?h)）；截留率（以百分率％表示）；化學物理穩定性（包括機械強度）等. ? 超濾裝置由若干超濾組件構成.分為板框式、管式、螺旋卷式和中空纖維式四種主要類型. ? 由於超濾法處理的液體多數是含有水溶性生物大分子、有機膠體、多糖及微生物等.這些物質極易粘附和沉積於膜表面上,造成嚴重的濃差極化和堵塞,這是超濾法最關鍵的問題,要克服濃差極化,通常可加大液體流量,加強湍流和加強攪拌. ? 2.3.4 冰凍乾燥 ? 冰凍乾燥機是生化與分子生物學實驗室必備的儀器之一,因為大多數生物大分子分離純化後的最終產品多數是水溶液,要從水溶液中得到固體產品,最好的辦法就是冰凍乾燥