凝膠包埋法和半透膜包埋法

① 酶、細胞、原生質體固定化

酶的一些不足之處：
（1）酶的穩定性較差
（2）酶的一次性使用
（3）產物的分離純化較困難
◆改善方法之一就是固定化技術的應用:
(1)固定化酶是指固定在一定載體上並在一定的空間范圍內進行催化反應的酶。固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游離酶的不足之處，具有增加穩定性，可反復或連續使用以及易於和反應產物分開等顯著優點。
(2)固定化細胞是指固定在載體上並在一定的空間范圍內進行生命活動的細胞。也稱為固定化活細胞或固定化增值細胞。通常只能用於胞外酶等胞外產物的生產。
(3) 固定化原生質體技術，有利於胞內物質的分泌。
1. 酶固定化
◆採用各種方法，將酶與水不溶性的載體結合，制備固定化酶的過程稱為酶的固定化。固定在載體上並在一定的空間范圍內進行催化反應的酶稱為固定化酶。
◆固定在載體上的菌體或菌體碎片稱為固定化菌體，它是固定化酶的一種形式。
1.1酶的固定化方法
固定化的方法：吸附法、包埋法、結合法、交聯法和熱處理法等。
(1)吸附法：
◆利用各種固體吸附劑將酶或含酶菌體吸附在其表面上，而使酶固定化的方法稱為物理吸附法，簡稱吸附法。
◆物理吸附法常用的固體吸附劑有活性炭、氧化鋁、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅膠、羥基磷灰石等。
◆靠物理吸附作用，結合力較弱，酶與載體結合不牢固而容易脫落，所以使用受到一定的限制。
(2)包埋法
◆將酶或含酶菌體包埋在各種多孔載體中，使酶固定化的方法稱為包埋法。
◆包埋法使用的多孔載體主要有：瓊脂、瓊脂糖、海藻酸鈉、角叉菜膠、明膠、聚丙烯醯胺、光交聯樹脂、聚醯胺、火棉膠等。
◆包埋法制備固定化酶或固定化菌體時，根據載體材料和方法的不同，可分為凝膠包埋法和半透膜包埋法兩大類。
◇凝膠包埋法：凝膠包埋法是將酶或含酶菌體包埋在各種凝膠內部的微孔中，製成一定形狀的固定化酶或固定化含酶菌體。大多數為球狀或片狀，也可按需要製成其他形狀。
常用的凝膠有瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠等天然凝膠以及聚丙烯醯胺凝膠、光交聯樹脂等合成凝膠。
◇半透膜包埋法：半透膜包埋法是將酶包埋在由各種高分子聚合物製成的小球內，製成固定化酶。
常用於制備固定化酶的半透膜有聚醯胺膜、火棉膠膜等。
(3)結合法
◆選擇適宜的載體，使之通過共價鍵或離子鍵與酶結合在一起的固定化方法稱為結合法。
◆根據酶與載體結合的化學鍵不同，結合法可分為離子鍵結合法和共價鍵結合法。
◇離子鍵結合法：通過離子鍵使酶與載體結合的固定化方法稱為離子鍵結合法。
離子鍵結合法所使用的載體是某些不溶於水的離子交換劑。常用的有DEAE-纖維素、TEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠等。
◇共價鍵結合法：通過共價鍵將酶與載體結合的固定化方法稱為共價鍵結合法。
共價鍵結合法所採用的載體主要有：纖維素、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠、甲殼質、氨基酸共聚物、甲基丙稀醇共聚物等。
酶分子中可以形成共價鍵的基團主要有：氨基、羧基、巰基、羥基、酚基和咪唑基等。
◇要使載體與酶形成共價鍵，必須首先使載體活化，即藉助於某種方法，在載體上引進一活潑基團。然後此活潑基團再與酶分子上的某一基團反應，形成共價鍵。
◇使載體活化的方法很多。主要的有重氮法、迭氮法、溴化氰法和烷化法等。
(4)交聯法
◆藉助雙功能試劑使酶分子之間發生交聯作用，製成網狀結構的固定化酶的方法稱為交聯法。交聯法也可用於含酶菌體或菌體碎片的固定化。
◆常用的雙功能試劑有戊二醛、己二胺、順丁烯二酸酐、雙偶氮苯等。其中應用最廣泛的是戊二醛。
(5)熱處理法
◆將含酶細胞在一定溫度下加熱處理一段時間，使酶固定在菌體內，而制備得到固定化菌體。◆熱處理法只適用於那些熱穩定性較好的酶的固定化，在加熱處理時，要嚴格控制好加熱溫度和時間，以免引起酶的變性失活。
1.2固定化酶的特性
(1)穩定性:固定化酶的穩定性一般比游離酶的穩定性好。
(2)最適溫度: 固定化酶的最適作用溫度一般與游離酶差不多，活化能也變化不大。
(3)最適pH值: 酶經過固定化後，其作用的最適pH值往往會發生一些變化。
◆影響固定化酶最適pH值的因素主要有兩個，一個是載體的帶電性質，另一個是酶催化反應產物的性質。
(4)底物特異性: 固定化酶的底物特異性與游離酶比較可能有些不同，其變化與底物分子量的大小有一定關系。對於那些作用於低分子底物的酶，固定化前後的底物特異性沒有明顯變化。
◆固定化酶底物特異性的改變，是由於載體的空間位阻作用引起的。
1.3固定化酶的應用
固定化酶既保持了酶的催化特性，又克服了游離酶的不足之處，具有如下顯著的優點：
（1）酶的穩定性增加，減少溫度、pH值、有機溶劑和其他外界因素對酶的活力的影響，可以較長期地保持較高的酶活力。
（2）固定化酶可反復使用或連續使用較長時間，提高酶的利用價值，降低生產成本。
（3）固定化酶易於和反應產物分開，有利於產物的分離純化，從而提高產品質量。
固定化酶已廣泛地應用於食品、輕工、醫葯、化工、分析、環保、能源和科學研究等領域。

2.細胞固定化
◆通過各種方法將細胞與水不溶性的載體結合，制備固定化細胞的過程稱為細胞固定化。(固定化活細胞或固定化增殖細胞)
◆微生物細胞、植物細胞和動物細胞都可以製成固定化細胞。
2.1細胞固定化的方法
◆主要可分為吸附法和包埋法兩大類方法。
(1)吸附法
◆利用各種固體吸附劑，將細胞吸附在其表面而使細胞固定化的方法稱為吸附法。
◆用於細胞固定化的吸附劑主要有：硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金屬絲網、微載體和中空纖維等。
(2) 包埋法
◆將細胞包埋在多孔載體內部而製成固定化細胞的方法稱為包埋法。
◆包埋法可分為凝膠包埋法和半透膜包埋法。
◇以各種多孔凝膠為載體，將細胞包埋在凝膠的微孔內而使細胞固定化的方法稱為凝膠包埋法。
○凝膠包埋法是應用最廣泛的細胞固定化方法，適用於各種微生物、動物和植物細胞的固定化。
○凝膠包埋法所使用的載體主要有瓊脂、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠、聚丙烯醯胺凝膠和光交聯樹脂等。
2.2微生物細胞固定化
2.2.1固定化微生物細胞的特點：
①固定化微生物細胞保持了細胞的完整結構和天然狀態，穩定性好。
②固定化微生物細胞保持了細胞內原有的酶系、輔酶體系和代謝調控體系，可以按照原來的代謝途徑進行新陳代謝，並進行有效的代謝調節控制。
③發酵穩定性好，可以反復使用或者連續使用較長的一段時間。
④固定化微生物細胞密度提高，可以提高產率。
⑤提高工程菌的質粒穩定性，
2.2.2固定化微生物細胞的應用
◆主要用在兩個方面：
◇是利用固定化微生物細胞發酵生產各種胞外產物。
◇二是利用固定化微生物細胞與各種電極結合製成微生物電極。
(1)利用固定化微生物生產各種產物
(2)固定化微生物細胞製造微生物感測器
2.3植物細胞固定化
2.3.1固定化植物細胞的特點：
（1）植物細胞經固定化後，由於有載體的保護作用，可減輕剪切力和其他外界因素對植物細胞的影響，提高植物細胞的存活率和穩定性。
（2）細胞經固定化後，被束縛在一定的空間范圍內進行生命活動，不容易聚集成團。
（3）固定化植物細胞發酵可以簡便地在不同地培養階段更換不同的培養液，即首先在生長培養基中生長增殖，在達到一定的細胞密度後，改換成發酵培養基，以利於生產各種所需的次級代謝物。
（4）固定化植物細胞可反復使用或連續使用較長的一段時間，大大縮短生產周期，提高產率。
（5）固定化植物細胞易於與培養液分離，利於產品的分離純化，提高產品質量。
2.3.2 植物細胞固定化的方法：
◆植物細胞固定化的方法主要有吸附法和包埋法兩種。
◆吸附法是將植物細胞吸附在泡沫塑料的孔洞或裂縫內，或者將植物細胞吸附在中空纖維的外壁上。
◆包埋法是將植物細胞包埋在瓊脂、角叉菜膠、海藻酸鈣凝膠、聚丙烯醯胺凝膠、明膠等多孔凝膠之中。包埋方法與微生物細胞包埋時基本相同。
2.3.3固定化植物細胞的應用：
◆固定化植物細胞的主要用途是製造人工種子，就有可能獲得大量具有相同遺傳特性的植株。對種質的保存具有重要意義。並可以節約種子的用量。
◆固定化植物細胞還可以用於生產各種色素、香精、葯物、酶等次級代謝物。
2.4動物細胞固定化
2.4.2固定化動物細胞的特點：
（1）提高細胞存活率：動物細胞經固定化後，由於有載體的保護作用，可以減輕或免受剪切力的影響，同時動物細胞可附著在載體表面生長，從而可顯著提高動物細胞的存活率。
（2）提高產率：動物細胞固定化後，可先在生長培養基中生長繁殖，使細胞在載體上形成最佳分布並達到一定的細胞密度。然後可簡便地改換成發酵培養基，控制發酵條件，使細胞從生長期轉變到生產期，以利於提高產率。
（3）固定化動物細胞可反復使用或連續使用較長的時間。例如，中國倉鼠卵巢細胞（CHO）生產人干擾素可以穩定地生產30天。
（4）固定化細胞易於與產物分開，利於產物分離純化，提高產品質量。
2.4.2動物細胞固定化方法：
◆動物細胞固定化地方法有吸附法和包埋法兩種。
(1)吸附法：
◆大多數動物細胞屬於附著細胞，它們在培養過程中，必須趨向於附著在固體表面。故此吸附法特別適合於動物細胞的固定化。
◆轉瓶是由玻璃或塑料製成，表面經過一定方法處理而帶上電荷。
◆微載體是指顆粒細小的固定化載體，直徑一般為100～200μm，相對密度接近1.0。是由帶有表面電荷的葡聚糖、明膠、纖維素、聚丙烯醯胺、聚苯乙烯或玻璃等材料製成。微載體已用於多種動物細胞的固定化；
◆中空纖維由聚丙烯、硅化聚碳酸酯等高分子聚合物製成。
(2)包埋法
◆包埋固定化法一般適用於懸浮細胞。
◆根據載體和方法的不同，有凝膠包埋法、半透膜包埋法兩種。
①凝膠包埋法：利用各種多孔凝膠為載體將動物細胞固定化。細胞被固定在凝膠的微孔中生長繁殖和新陳代謝，由於有載體的保護，動物細胞有較好的穩定性，可顯著提高其存活率。
用於動物細胞固定化的凝膠載體主要有瓊脂糖凝膠、海藻酸鈣凝膠和血纖維蛋白等。
②半透膜包埋法：利用高分子聚合物形成的半透膜將動物細胞包埋，形成微囊型固定化動物細胞。
2.4.3固定化動物細胞的應用：
動物細胞中大部分為貼壁細胞，需要貼附在載體的表面才能正常生長。所以固定化動物細胞廣泛應用。特別是採用微載體對動物細胞進行吸附固定化。

3.原生質體固定化
◆固定化原生質體的制備主要包括原生質體的制備和原生質體固定化兩個階段。
3.1原生質體的制備
◆不同種類的細胞，由於各自細胞壁的組成、結構和性質不同，原生質體的制備方法也不一樣。
◆原生質體的制備過程是首先將對數生長期的細胞收集起來，懸浮在含有滲透壓穩定劑的高滲緩沖液中。然後加入適宜的細胞壁水解酶，在一定的條件下作用一段時間，使細胞壁破壞。分離除去細胞壁碎片、未作用的細胞以及細胞壁水解酶，而得到原生質體。
◆除去細胞壁所使用的酶應根據細胞壁的主要成分的不同而進行選擇。
◇細菌的細胞壁主要成分是肽多糖，所以細菌原生質體制備時主要採用從蛋清中得到的溶菌酶；
◇酵母細胞壁主要由β-葡聚糖構成，故採用β-1，3-葡聚糖酶；
◇黴菌的細胞壁組分比較復雜，除含有幾丁質外，還有其他多種組分，故要去除黴菌的細胞壁，則需有幾丁質酶與其他有關酶共同作用。
◇植物細胞壁由纖維素、半纖維素和果膠組成，故制備植物原生質體時主要應用纖維素酶和果膠酶。
◆為防止制備得到的原生質體破裂，應加入適當的滲透壓穩定劑。如：無機鹽、糖類、糖醇等化合物。
◆應選擇對數生長期的細胞制備原生質體，以獲得較高的原生質體形成率。
◆所加進的細胞壁溶解酶的種類和濃度、酶作用溫度，pH值以及作用時間等對原生質體的制備都有明顯影響，必須經過試驗確定其最佳條件。
3.2原生質體固定化
◆採用包埋法製成固定化原生質體。
◆原生質體固定化一般採用凝膠包埋法。常用的凝膠有：瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠和光交聯樹脂等。
3.3固定化原生質體的特點：
(1)固定化原生質體由於解除了細胞壁這一擴散屏障，可增加細胞膜的通透性，有利於氧氣和營養物質的傳遞和吸收，也有利於胞內物質的分泌，可顯著提高產率。
(2)固定化原生質體由於有載體的保護作用，具有較好的操作穩定性和保存穩定性，可反復使用和連續使用較長的時間，利於連續化生產。在冰箱保存較長時間後仍能保持其生產能力。
(3)固定化原生質體易於和發酵產物分開，有利於產物的分離純化，提高產品質量。
(4)固定化原生質體發酵的培養基中需要添加滲透壓穩定劑，以保持原生質體的穩定性。這些滲透壓穩定劑在發酵結束後，可用層析或膜分離技術等方法與產物分離。
3.4固定化原生質體的應用
固定化原生質體一方面保持了細胞原有的新陳代謝特性，可以照常產生原來在細胞內產生的各種代謝產物，另一方面又去除了細胞壁這一擴散屏障，有利於胞內產物不斷地分泌到胞外，這樣就可以不經過細胞破碎和提取工藝而在發酵液中獲得所需的發酵產物，為胞內物質的工業化生產開辟了新途徑。
固定化原生質體可用於各種氨基酸、酶和生物鹼等物質的生產以及甾體轉化等。

② 酶的固定化方法有哪些

一、包埋法
定義：將酶、細胞或原生質體包埋在各種多孔載體中，使其固定化的方法。
分類：根據載體的材料和方法的不同分為凝膠包埋法（網格型包埋法）、半透膜包埋法（微囊型包埋法）。
1、凝膠包埋法：應用最廣泛的固定化方法。
定義：以各種多孔凝膠為載體，將酶、細胞或原生質體包埋在凝膠的微孔內的固定化方法。
載體：瓊脂凝膠、海藻酸鈣凝膠、角叉菜膠、明膠、聚丙烯醯胺凝膠等。
注意事項：凝膠的孔徑應控制在小於酶分子直徑的范圍內；不適於那些底物或產物分子很大的酶類的固定化。
2、半透膜包埋法
定義：將酶或細胞包埋在由各種高分子聚合物製成的小球內，製成固定化酶或固定化細胞。
載體：聚醯胺膜、火棉膠膜等。 適用：底物和產物都是小分子物質的酶的固定化。
方法：將酶液滴分散在與水互不相溶的有機溶劑中，在酶液滴表面形成半透膜，將酶包埋在微膠囊中。

二、結合法
定義：選擇適宜的載體，使之通過共價鍵或離子鍵與酶結合在一起的固定化方法。
分類：根據酶與載體結合的化學鍵不同分為離子鍵結合法、共價鍵結合法。
1、離子鍵結合法
定義：通過離子鍵使酶與載體結合的固定化方法。
載體：某些不溶於水的離子交換劑，如DEAE-纖維素、DEAE-葡聚糖凝膠。
方法：一定條件下，酶與載體混合攪拌幾小時，或是將酶液緩緩流過處理好的離子交換柱。
特點：結合力較弱，在pH、離子強度等條件改變時，酶容易脫落。
使用注意：pH、離子強度、溫度等的控制。
2、共價鍵結合法
定義：通過共價鍵將酶與載體結合的固定化方法。
常用載體：纖維素、葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠等
可以形成共價鍵的基團：氨基、羧基、巰基、羥基、酚基和咪唑基等。
特點：結合牢固、酶不會脫落、可連續使用較長時間；載體活化的操作復雜；共價結合可能影響酶的空間結構，從而影響酶的催化活性。

③ 固定化細胞的固定化原理及方法

細胞的種類多種多樣，大小和特性個不相同，故此細胞固定化的方法有很多種。歸結起來，主要可以分為吸附法和包埋法兩大類。 吸附法 利用各種吸附劑，將細胞吸附在其表面而使細胞固定的方法稱為吸附法。
用於細胞固定化的吸附劑主要有硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、多孔塑料、金屬絲網、微載體、和中空纖維等。
酵母細胞帶有負電荷，在pH3~5的條件下能夠吸附在多空陶瓷、多空塑料等載體的表面，製成固定化細胞，用於酒精和啤酒等的發酵生產；在環境保護領域內使用的活性污泥中含有各種各樣的微生物，這些微生物可以沉積吸附在硅藻土、多孔玻璃、多孔陶瓷、多空塑料等載體的表面，用於各種有機廢水的處理，降低廢水中的化學需氧量（COD)和生化需氧量（BOD）；各種黴菌會長出菌絲體，這些菌絲體可以吸附纏繞在多空塑料、金屬絲網等載體上用於生產有機酸和酶等；植物細胞可吸附在中空纖維外壁，用於生產色素、香精、葯物和酶等次級代謝產物；動物細胞大多屬於貼壁細胞，必需依附在固體表面才能正常生長，故可吸附在容器壁、微載體、中空纖維外壁等載體上，製成固定化細胞，用於各種蛋白質的生產。
2.包埋法
將細胞包埋在多空載體內部而製成固定化細胞的方法稱為包埋法。包埋法可分為凝膠包埋法和半透膜包埋法。
凝膠包埋法是應用最廣泛的細胞固定方法。

④ 鍗婇忚啘鍖呭煁娉曠殑浼樼己鐐

鍗婇忚啘鍖呭煁娉曠殑浼樼己鐐瑰備笅錛
1銆佷紭鐐癸細鍗婇忚啘鑳藉熷厑璁告煇浜涘垎瀛愭垨紱誨瓙閫氳繃錛屽悓鏃墮樆姝㈠叾浠栧垎瀛愭垨紱誨瓙鐨勯氳繃錛屼粠鑰屽疄鐜板規販鍚堢墿鐨勫垎紱誨拰綰鍖栥
2銆佺己鐐癸細楂樿川閲忕殑鍗婇忚啘闇瑕佷嬌鐢ㄩ珮璐ㄩ噺鐨勫師鏉愭枡鍜屽嶆潅鐨勫埗澶囧伐鑹猴紝鍥犳ゅ埗澶囨垚鏈杈冮珮銆