㈠ DNA粗提取實驗步驟
一 教學目的
1.初步掌握DNA的粗提取和鑒定的方法。
2.觀察提取出來的DNA物質。
二 教學建議
在本實驗的教學中，教師應注意以下幾點。
1.實驗材料必須准備充足。本實驗所用的實驗材料是雞血細胞液,由活雞的鮮血經沉澱後獲得。每組(2個學生)需用5 mL 雞血細胞液,則每班(50人)至少需要130 mL,而雞血細胞液與雞血的體積比為1:3,這樣每班至少需要390 mL 雞血細胞液。宰殺1隻中等大小的活雞,一般可得120 mL 左右的鮮血,因此,1個班實驗需要買4隻活雞。如果不具備購買活雞的條件,也可以到市場售活雞處去索取雞血,但所帶燒杯中必須提前放入抗凝劑。
2.盛放雞血細胞液的容器,最好是塑料容器。雞血細胞破碎以後釋放出的DNA,容易被玻璃容器吸附,由於細胞內DNA的含量本來就比較少,再被玻璃容器吸附去一部分,提取到的DNA就會更少。因此,實驗過程中最好使用塑料的燒杯和試管,這樣可以減少提取過程中DNA的損失。
3.獲取較純凈的DNA的關鍵步驟。
(1)充分攪拌雞血細胞液DNA存在於雞血細胞的細胞核中。將雞血細胞液與蒸餾水混合以後,必須用玻璃棒沿一個方向快速攪拌,使雞血細胞加速破裂,並釋放出DNA。
(2)沉澱DNA時必須用冷酒精實驗前必須准備好大量的體積分數為95%的酒精,並在冰箱(至少5S以下)中至少存放24 h。
(3)正確攪拌含有懸浮物的溶液實驗步驟3、5、7,都需要用玻璃棒攪拌。教師應提醒學生注意,在進行步驟3、5時,玻璃棒不要直插燒杯底部,而且攪拌要輕緩,以便獲得較完整的DNA分子。進行步驟7時,要將玻璃棒插入燒杯中溶液的中間,用手緩慢轉動510 min。
三 參考資料
實驗原理的補充介紹
1.DNA的釋放 DNA位於雞血細胞的細胞核中,正常情況下不會釋放出來。為了使DNA從細胞核中釋放出來,實驗中採用了向雞血細胞液中加入蒸餾水並且攪拌的方法。蒸餾水對於雞血細胞來說,是一種低滲液體,水分可以大量進入血細胞內,使血細胞破裂。同時,再加上攪拌的機械作用,就加速了雞血細胞的破裂(細胞膜和核膜的破裂),於是釋放出DNA,當然也有RNA。但是,釋放出來的大量DNA和RNA往往與蛋白質結合在一起。
2.將DNA與蛋白質分離 根據二者的特性,即在濃度較高的氯化鈉溶液(物質的量濃度為2 moL/L )中,核蛋白容易解聚,游離出DNA。而DNA在濃度較高的氯化鈉溶液中的溶解度很高,Na+與帶負電的DNA結合成DNA鈉鹽。這時DNA在溶液中呈溶解狀態。
3.DNA的析出與獲取 利用DNA在濃度較低的氯化鈉溶液中溶解度小的原理,向含有DNA的濃度較高的氯化鈉溶液中加入大量(300 mL )蒸餾水,稀釋氯化鈉溶液,使DNA的溶解度下降,而蛋白質的溶解度增高(這就是蛋白質的鹽溶現象),從而使二者分離。這時,加上不停地攪拌,溶解度下降的DNA逐漸呈絲狀物。再通過過濾,濾去蛋白質,就可以獲取DNA的黏稠物了。如果採用離心法則更好,用4 000 r/min 的旋轉頻率,離心15 min ,除去上清液(含有蛋白質),留下的沉澱物中含DNA。
4.DNA的再溶解 再用較高濃度的氯化鈉溶液去溶解DNA黏稠物。
5.DNA的沉澱和濃縮 除去了蛋白質的核酸溶液,必須再進一步沉澱和濃縮。最常用的方法是酒精沉澱法。就是將含有Na+的DNA溶液,加入到相當於其兩倍體積的體積分數為95%冷酒精溶液中,混勻以後可以使DNA沉澱、濃縮,形成含雜質較少的DNA絲狀物,懸浮於溶液中。如果出現的絲狀物較少,可以將此混合液再放入冰箱中冷卻幾分。濃縮後的DNA絲狀物,可以用緩緩旋轉玻璃棒的方法捲起(因為玻璃棒有吸附DNA的作用)。
6.DNA的鑒定 本實驗中鑒定DNA的方法為二苯胺法(配方見下述的「葯品配製」)。二苯胺法的原理是:DNA中嘌呤核苷酸上的脫氧核糖遇酸生成ω-羥基-γ酮基戊醛,它再和二苯胺作用而顯現藍色(溶液呈淺藍色)。
鑒定時溶液藍色的深淺,與溶液中DNA含量的多少有關。
二苯胺試劑的配製
A液： 15 g二苯胺溶於100 mL 冰醋酸中,再加15 mL濃硫酸,用棕色瓶保存。如冰醋酸呈結晶狀態,則需加溫後待其熔化,再使用。
B液： 乙醛的體積分數為0.2%的溶液。
配製： 將0.1 mL B液加入到10 mL A液中,現配現用。
DNA粗提取與鑒定的另一種方法
1.材料用具
新鮮菜花(或蒜黃、菠菜)。
塑料燒杯,量筒,玻璃棒,尼龍紗布,陶瓷研缽,試管,試管架,試管夾,漏斗,酒精燈,石棉網,三角架,火柴,刀片,天平。
研磨液,體積分數為95%的酒精溶液,二苯胺試劑,蒸餾水。
2.方法步驟
(1)DNA的粗提取
①准備材料 將新鮮菜花和體積分數為95%的酒精溶液放入冰箱冷凍室,至少24 h。
②取材 稱取30 g菜花,去梗取花,切碎。
③研磨 將碎菜花放入研缽中,倒入10 mL研磨液,充分研磨10 min 。
④過濾 在漏斗中墊上尼龍紗布,將菜花研磨液濾入燒杯中(有條件的學校可將濾液倒入塑料離心管中進行離心,用1 000r/min的旋轉頻率,離心25 min,取上清液放入燒杯中)。在4 ℃冰箱中放置幾分後,再取上清液。
⑤加冷酒精 將一倍體積的上清液倒入兩倍體積的體積分數為95%的冷酒精溶液中,並用玻璃棒緩緩地輕輕攪拌溶液(玻璃棒不要直插燒杯底部)。沉澱35 min後,可見白色的DNA絮狀物出現。用玻璃棒緩緩旋轉,絮狀物會纏在玻璃棒上。
(2)DNA的鑒定
①配製二苯胺試劑 取0.1 mL B液,滴入到10 mL A液中,混勻。
②鑒定 取4 mL DNA提取液放入試管中,加入4 mL 二苯胺試劑,混勻後觀察溶液顏色(不變藍)。用沸水浴(100 ℃)加熱10 min 。在加熱過程中,隨時注意試管中溶液顏色的變化(逐漸出現淺藍色)。
研磨液的配製方法
Tris：10.1 g(相對分子質量為121.14),先加50 mL 蒸餾水溶解,用物質的量濃度為2 moL/L 的鹽酸調至pH8.0,再加下述葯品。
NaCl：8.76 g(相對分子質量58.44)
EDTA：37.2 g(相對分子質量372.24)
SDS：20 g(相對分子質量288.3)
待上述葯品全部溶解後,再用蒸餾水定容至1 000 mL。
若在室溫低於20 ℃時配製葯液,SDS呈沉澱析出,此時需要加溫,才能將SDS溶解。如果提前配製的研磨液出現了沉澱,則應加溫使沉澱溶解後再使用。
研磨液中幾種葯品的作用
SDS(十二烷基磺酸鈉):可使蛋白質變性,與DNA分離。
EDTA(乙二胺四乙酸二鈉):為DNA酶的抑制劑,可以防止細胞破碎後DNA酶降解DNA。
物質的量濃度為0.15 moL/L的氯化鈉溶液：能很好地溶解DNA。
Tris/HCl：提供緩沖體系,DNA在這個緩沖體系中呈穩定狀態。(Tris為三羥甲基氨基甲烷)
鑒定DNA的其他方法 用紫外燈照射法鑒定DNA效果很好。具體鑒定方法如下。
1.配製染色劑。用蒸餾水配製萬分之五的溴化乙錠(EB)溶液。
2.將玻璃棒上纏繞的白色絮狀物抹於蠟紙上,再滴1滴EB溶液染色。
3.將蠟紙放在紫外燈(260 nm)下照射(暗室中),可見橙紅色的螢光(DNA的紫外吸收高峰在280 nm處)。