1. 純化生物產品的得率是如何計算的
生物葯物的提取純化技術
第一節 概述
一、生物葯物的特點及純化方法
許多生物葯物具有生物活性，其穩定性受pH,一溫度、離子強終提取過程所使用的溶劑和表面活性劑、金屬離子等方面的嚴件物葯物對剪切力很敏感，分子量越大，其穩定性就越差，在甘離純化過程中，條件就應當越溫和。一些組分的濃度非常低。但是生物葯物產品的純度卻要求很高，含量要達到95%甚至98%以上。結晶態產品最好，葯物還應具有正常的顏色、穩定性和溶解速率。
生物葯物的制備，如蛋白質制備，涉及物理、化學和生物學知識。其主要原理有兩個方面：一是利用混合物中組分分配率差別，把它們分配於可機械分離的兩個或幾個物相中，如鹽析、有機溶劑提取、層析和結晶等；二是將混合物置於單一物相中，經物理力場作用使各組分分配於不同區域而達分離目的，如電泳、超離心、超濾等。相互分離主要利用蛋白間各種性質的微小差別,諸如分子形狀、分子量大小、帶電性質、溶解度、生物功能專一性等，制備方法可按這些主要因素進行分類。按分子大小和形態分差速離心、超濾、分子篩及透析等方法；按溶解度分為鹽析、溶劑抽提、分配層析、逆流分配及結晶等；按電荷差異分為電泳、電滲析、等電點沉澱、離子交換層析及吸附層析等；按生物功能專一性有親合層析法等。
蛋白分離純化比較困難。需要研究目的物質的微細特徵，巧妙聯用各種方法並進行嚴密的操作，並有必要了解精製過程的精製程度和回收率。具有活性的蛋白可利用吸收光譜等物理性質或以相當於單位氮活性增加進行追蹤；其他蛋白可用電泳、超離心、層析、擴散及溶解等測定純度；不穩定蛋白，如分離SH-酶時，使用試劑及緩沖液等要確認不含重金屬離子（特級試劑也需檢定）。
蛋白質純化的操作如脫鹽、濃縮乾燥等均與低分子物不同，須經獨特的繁瑣操作。
提純蛋白和酶時常混有核酸或多糖，一般可用專一性酶解、有機溶劑抽取及選擇性部分沉澱等法處理。小分子物質常在制備中經多次液相與固相轉化被分離或最後用透析法除去。而同類物質分離，情況則復雜得多。主要採用鹽析、有機溶劑沉澱，等電點沉澱、吸附、結晶、電泳、超離心及柱層析法等。其中，鹽析、等電點及結晶法用於蛋白質和酶的提純較多；有機溶劑抽提和沉澱用於核酸提純較多；柱層析、梯度離心對蛋白和核酸的提純應用十分廣泛。
蛋白分離純化方法很多。 Bonnerjea 等人對有關蛋白和酶的分離純化方法及其特徵進行了分析，發現主要有10種方法，它們的出現頻率為：
離子交換 75%
親和過程 60%
沉 淀 57%
凝膠過濾 50%
其 它 <33%
目前尚無一種方法可用以純化各種蛋白質，但每種蛋白質都可設法分離純化。選擇純化方法，需要考慮到純度、活性、得率等。
二、提取純化的單元操作和基本工藝流程
生物葯物的提取和純化可分為5個主要步驟：預處理、固液尹離產縮、純化和產品定型（乾燥，制丸，擠壓，造粒，製片）每一步驟都可採用各種單元操作。在提取純化過程中，要盡可能減少操作步驟，因為每一操作步驟都不可避免帶來損失。操作步驟多，總收率就會下降。生物葯物提取工藝流程的基本模式如1-1所示。根據主要分離因素排列的單元分離范圍見圖1-2。
圖1-1 生物葯物提取工藝流程的基本模式
表1-1根據主要分離因素排列的單元分離范圍
三、提取純化單元操作技術的特點
現代生物制葯領域提取純化技術的進步得益於生化分析分離技術開拓性工作的成果汾離純化技術的特點之一是各種技術產互交叉，新型的分離純化方法不斷涌現。如沉澱技術和親和技夢相結合•形成了親和沉澱技術；超濾和親和技術相結合，形成了嚴和超濾技術；萃取與載體膜相結合，形成了液膜載體萃取法。這種新方法取長補短，使分離純化過程更加科學合理、快速有效、經濟實用。盡管有些方法仍處於實驗室的試驗階段，要用於工業規模還需要進一步探索，有的甚至沒有實用價值，但都可為今後的產展提供新的思路。
生物葯物提取純化技術的另一特點是注重新材料的研製開發如膜分離介質，層析介質，親和配基，新型萃取劑等在最近幾年來發展非常快。提取純化設備方面推陳出新，在設備的計算機控制及生產自動化，連續化及GMP規范化等方面取得很大的成就。
膜過濾技術發展很快，分為微濾、超濾和納濾，不僅用於細胞的分離，還用於蛋白質的濃縮。超濾技術的主要特點是節能，對生物大分子類葯物無破壞作用。液一液萃取廣泛應用於抗生素及小分子量葯物的提取。溶劑選擇的餘地大，且易實現大規模生產。高速離心式液體萃取機是目前效率最高，使用最廣的裝置。液一液萃取技術還衍生出許多新的萃取技術，如雙水相萃取，親和萃取，超臨界萃取等。雙水相萃取蛋白質類葯物是大規模提取高純度蛋白質類葯物的有效技術。而超臨界界萃取利用超臨界流體的物理特性，即通過壓力和溫度的改變控制溶質在溶劑中的分子擴散能助，控制溶質的溶解度，從而實現分離。
層析（色譜）技術是最近幾十年來發展最快的純化技術。層析裝置的種類很多，且分離純化機理也各不相同，適應於許多葯物產品的分離純化。離子交換色譜是應用最廣，且易於實現大規模生產的方法。應用於抗生素、氨基酸、核昔酸、蛋白質的提取和純化。分子篩層析根據分子量大小不同的原理，適應於蛋白質類葯物的純化。層析分離技術的最高層次當屬基於分子識別的技術如親和層析。這一技術已衍生出一大批新的技術，如免疫親和層析、染料親和層析、金屬離子鰲合層析。疏水性層析是基於分子的疏水性能來分離純化的。高效液相色譜法本是分析化學的常用手段，現已將其擴展到生物葯物的分離純化的應用中。有些設備僅可進行分析，有的還可用於分離純化，在新葯開發的過程中，縮短了分離純化所需時間。
與層析技術同步發展的各種分離介質是層析分離的技術保障，商品化的預裝柱、緩沖劑、計算機程序控制還使操作變得簡單易學。置換層析與洗脫層析不同，是指吸附在層析柱上的一種組分被另一種置換劑（與層析上的介質的親和力大於原被吸附的組分）置換出層析柱的層析技術。該技術有上樣量高，解析度高的特點。被分離的樣品在分離過程中還有濃縮作用。
總之，隨著科技的發展，新的分離、提取、純化技術還將不斷得到改進。
四、提取純化的工藝論證
我國1992年修訂了GMP,要求從1993年3月1日以後新建或改建的葯廠，均要符合GMP的要求。1994年開始了各項驗證，其中工藝論證是關鍵的一個不可缺少的組成部分．產品的純化是生產過程中關鍵的一步。這涉及到葯物的質量。所謂工藝驗證，就是通過系統的方法得到關於生產工藝的書面材料，證明並保證生產過程能始終如一地生產出特定的高質量的產品。提取純化處理工藝驗證的范圍包括：廠房設施、工程儀表、機械設備、生產環境、工藝條件、計算機軟體、介質、原材料、半成品、成品、操作人員素質和測試方法等。以上各個部分都要有驗證材料或試驗數據，根據這些材料和數據寫出驗證報告。當工藝的某一部分有較大變動時（如大修、工藝條件變化），要進行重新驗證，即再驗證．再驗證是針對某一部分的行動，而不是整個工藝過程的驗證．因此比較簡單、快速、易行。驗證的實施過程包括以下步驟：提出驗證要求，組織驗證小組，制定驗證方案，實施驗證試驗，寫出驗證報告，再驗證等。
現以生物制葯純化最常用的層析工藝為例，說明驗證試驗的過程。首先對層析設備進行安裝驗證，即在不通電源的情況下，根具設備說明書查看安裝是否正確，並對接線、管路連接、安放地點、輸人電壓等逐項檢查，無誤後，再進行運轉試驗．接通電源後，觀察電機、泵、監測器、信號系統、閥、壓力、溫度等是否正常．泵的輸出流量要經過校正，監測波長也要校正，運轉3-5次後，未見漏液、氣泡等，一切正常，方可正式運轉。層析柱是整個層析工藝的關鍵設備，要根據出廠標准，逐項驗證，如載體外觀、顆粒大小（用顯微鏡測量）、柱效率、解析度、回收率、有無污染等．如更變層析柱或層析柱填料，要對新層析柱進行重新驗證。總之，工藝驗證是一項技術性很強，無固定章程可循，既費力，又耗時、耗材的工作．
高科技生物葯物的生產工廠，已有「交鑰匙工程」。所謂交鑰匙工程，就是將整個工廠組裝在高強度的，便於運輸的鋼制建築結構內，整個建築要達到潔凈標准，所有的生產設備和公用設施都安裝到位。在用戶在場的情況下，要對整個工廠進行發貨前的試運轉及鑒定。然後，整個工廠的生產設備和公用設施直接運輸到用戶的廠址，在各車間組裝後，與當地的水、電、下水道等系統及倉庫對接，立即就可以投人生產。
五、生物葯物生產的屏蔽防護技術
(Containment technology)
一些葯物，如抗癌葯，往往對生物活細胞具有毒性，因此必須對中試或大生產的全過程設置屏蔽防護裝置．1984年，Flickinger等就提出了中試和生產規模細胞毒素劑的安全生產裝置的設計概念，其基本要求是：人員進出口要加以控制；在工作場所保持負壓（一級、二級或三級生物密封室）：空氣的排放必須通過HEPA過勝器；對有煙霧產生的設備要有附加的屏蔽防護裝置；有適當的個人防護措施；生產過程中所排放的廢物要有生物學或化學的除污方法；對工作人員進行醫療監測；環境監測。
六、純化工藝過程的質量控制
生物葯物純化工藝技術要求高，應盡可能選用高質量的設備，並要求有清潔的各級GMP廠房。純化方法的設計應考慮到盡可能去除污染病毒、核酸、宿主細胞雜蛋白、糖及其他雜質；要防止純化過程中帶人有害物質．如採用柱層析技術純化，應提供填料的質量認證證明(IS09001證書），並證實從柱上不會掉下有害物質。樣品上樣前應除熱原質等。若用親和層析技術（以單克隆抗體品作為配基），應有檢測可能污染此類外源性物質的方法，不應含有可測出的異種免疫球蛋白，柱層析配製溶液用水一律用超純水(Milli Q水）。
關於純度的要求，可視產品的來源、用途和用法而制定，例如經反復多次使用的真核細胞表達的製品，要求純度達到98％以上；多次使用的原核細胞表達的製品要達95％以上；外用製品的純度可降低要求。用於健康人群或用於重症患者，對純度要求各不相同．
純化工藝的每一步均應測定純度，計算提純倍數收率等。純化工藝過程中應盡量避免加人對人體有害的物質，若不得不加人，應設法除盡；並在最終產品中檢測殘留量，殘留量應遠遠低於危害劑量，還要考慮到多次使用的積蓄作用。
附：基因工程α一型干擾素制備及質，控制要點
干擾素是一組多功能的細胞因子，分為干擾素α、干擾素β、和干擾素γ。干擾素α為多基因產物。分為許多亞型，都是由許多氨基酸殘基組成的多膚。人干擾素γ是一種免疫干擾素，是由100多個氨基酸殘基組成的多肽，天然產品是一種糖蛋白，兩處有糖基化位點．
發酵後可用離心法或其他方法收集菌體，要求盡可能縮小操作的范圍，凡接觸過菌液的用具，如離心杯、轉頭和玻璃器皿等應浸泡新潔爾滅殺菌1h以上，才可清洗。離心後的廢棄液經殺菌後才能倒人下水道。收獲的菌種如在24h內破菌裂解，可放在4-80C,否則應凍存於_30'C以下的冰箱中，在一300C保存的菌體可使用6個月。將收獲的菌體用適當的緩沖液做成所需濃度的均勻懸液，可用物理、化學或生物學方法進行裂解，裂解後的菌液，可用高速離心沉澱或其他適當方法分離，上清液即為粗製干擾素。不得用對人體有害的化學試劑裂解菌體，用加酶或其他蛋白裂解菌體時，應在半成品內證明此種蛋白的含量在允許的范圍內，對製品安全及效果沒有影響，並提供檢測方法．
濃縮與純化方法應能去除絕大部分非干擾素物質。一般要用不同原理多步驟的純化方法，並使干擾素濃縮至一定程度，應詳細說明濃縮純化的全過程。在純化過程中不得加人對人體有害的物質，加入的物質應能在以後的純化過程中被去除或證明其濃度在允許的范圍內，不得影響製品的安全與效果。如用異種抗體親和層析純化，應說明其來源及純度，並提供此種抗體微量IgG的檢測方法，在半成品檢定中應測定IgG的含量，並確定允許濃度。制備注射用製品時濃縮純化過程應特別注意去除熱原質，並採取措施防止溶液、試劑和容器污染，而造成製品熱原質增加。
濃縮純化最後所得的純化干擾素即為「半成品原液」，取樣供作純度檢定後，立即加人人白蛋白，使其最終含量為2％，稱為加「白蛋白半成品」，取樣測定干擾素效價，保存在一300C,應盡量避免凍融，直到制劑配製時才取出融化、合並、離心、除菌過濾、制備成品，「加白蛋白半成品」在一300C下保存不得超過半年。
制劑配製：除菌過濾採用0.3μm薄膜，過濾後樣品應做無菌試驗，並取樣測定干擾素效價，根據除菌樣品的效價測定結果，將讓述無菌試驗合格的「加白蛋白半成品」用無菌的2 %白蛋白緩沖液稀釋至所需濃度，不得加防腐劑，稀釋後的「加白蛋白半成品」需做熱原測定、效價測定和無菌試驗。
冷凍乾燥：凍干工藝應不損害干擾素的活性，並使凍干後製品的水分達到一定的標准。
基因工程干擾素分注射用和外用兩種．其質量標准不同，應分別予以規定。每種製品又分為半成品和成品檢定．
2. 超濾離心管怎麼使用
蛋白濃縮和換Buffer通常使用的超濾管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超濾管（MWCO10kD）。也有其它型號的、不同體積大小和MWCO超濾管可選，視目的蛋白的分子量與濃縮前體積、濃縮目標體積而定。可重復使用。
1、選擇合適的超濾管，主要考慮MWCO和濃縮體積，通常應截留分子量不應大於目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量為35kDa，就可以選擇10kDa截留分子量的超濾管。若目的蛋白分子量為10kD左右，則可以用截留分子量3kD的超濾管。
2、新買來的超濾是乾燥的，使用前加入MilliQ水，水量完全過膜，冰浴或冰箱里預冷幾分鍾。然後將水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超過管頂的白線為准。操作要輕，加入蛋白液前，超濾管需要插在冰上預冷。
3、平衡。質量和重心二者都要達到平衡。注意轉速和加速度不可太快，否則直接損壞超濾膜。開始離心超濾（離心機預冷至4度）。膜與轉軸的方向根據說明書調整（角轉離心機的情況是膜與軸垂直）。在實際使用中，一般轉速開的比說明書里的要低，這樣可以延長離心管的使用壽命。
4、當濃縮到剩下1ml時，【取50ul國產Bradford溶液，加入10ul流穿，看有沒變藍色，以此判斷超濾管是否漏掉蛋白。如果管漏了，將上層和流穿重新倒入新管中開始超濾。要精確判斷是否漏管，用5mg/ml的BSA離心10min，再取流穿，跑蛋白膠或Bradford粗測】，繼續加入剩下的蛋白液濃縮（在冰上操作，防止蛋白受熱），直到所有濃縮液都加完為止。離心過程中注意是否發生蛋白沉澱，導致堵管。若發生沉澱，要確定沉澱的具體原因，是蛋白濃度過高還是Buffer不合適；前者可用多根超濾管同時超濾，降低濃度的辦法解決，後者的方法是換不同的Buffer，直到蛋白不發生沉澱為止。
5、前面幾步用以濃縮蛋白，如果要換Buffer，在總蛋白液濃縮至1ml左右的時候，輕輕加入新的Buffer（經0.22um超濾膜超濾），再濃縮至1ml左右，連續三次，最後一次的濃縮終體積根據需要的蛋白濃度而定，一般不多於500ul，也有濃縮至200ul以內的情況。按照每次至少10倍左右的體積濃縮算，三次達到1000倍以上，基本上可以達到換buffer的目的。
6、取出最終蛋白濃縮液的操作在冰上操作，用黃槍頭（200ul）取，輕輕順著邊緣插入槍頭，輕輕吹打、混勻蛋白液，注意不要碰到超濾膜，然後吸取濃縮液，每次吸接近200ul，直到吸完。管底剩下的最後一點濃縮液不必吸取，否則難度太大，有可能損壞超濾膜。最後加入MilliQ水到超濾管中，沒過超濾膜，防止膜失水變干。
7、以下是處理超濾管，重復利用超濾管的步驟。
8、倒出超濾管里的水，用milliQ水輕輕潤洗幾次，【若管底有可見的蛋白沉澱，可以先加入水，然後用槍頭吹打，注意不要碰到膜，吹打至沉澱懸起，然後倒掉，不可用自來水猛沖】然後加入0.2M的NaOH溶液，室溫放置20min，期間平衡超濾管。再離心10min。倒出殘留的NaOH溶液，將管芯浸入MilliQ水的燒杯(1或2L)中,放置幾個小時,再換新的水,放置幾個小時，不斷稀釋NaOH濃度。50ml管和蓋子用自來水洗，內壁再用MilliQ水洗干凈。
9、取出浸沒的管芯，加至接近滿的MilliQ水，50ml管也加滿MilliQ水，將管芯慢慢放入50ml
離心管，排出部分水，然後蓋上蓋子，放4度保存，直到下次使用。一般來說，按照上述步驟和注意事項，每根管用三四年不會壞。
3. N-TIMS法測定
儀器設備及器皿
熱電離質譜儀 MAT262、TRITON等相當類型，配備有負離子進樣裝置，及點焊機、超凈台等質譜計配套設備。Re和Os同位素測定均採用單帶源。
可控電熱板連續可調，數碼顯示電熱板表面溫度
Teflon蒸發皿 100mL。用於蒸發含Os的HBr溶液。
Teflon尖底瓶 5mL。用於Os的微蒸餾。
微蒸餾器的Teflon尖底瓶清洗 先用酒精棉擦洗其內部，再用超純水沖洗干凈。加入5mL超純HNO3，蓋上蓋子，在烘箱中～120℃加熱24h。取出，打開蓋子，棄去HNO3，用超純水清洗干凈。再加入分析純HBr，蓋上蓋子，在烘箱中～120℃加熱24h。取出，打開蓋子，棄去HBr，用超純水清洗干凈。加入5mL超純HNO3，蓋上蓋子。在烘箱中～120℃加熱24h。取出，打開蓋子，棄去HNO3，用超純水清洗干凈。敞開蓋子，放置在搪瓷盤上，在烘箱～120℃加熱烘烤24h。再加入0.5mL超純HNO3，密閉。烘箱中～120℃加熱2h，冷卻後，用4.5mL超純水稀釋，用ICP-MS檢測尖底瓶中的溶液是否還有殘存的Os。如果還殘存有Os，則重復上面的清洗流程。
其他裝置、器皿及其清洗同86.5.3.1。
試劑和材料
微蒸餾用氧化劑溶液w(CrO3)=100g/L，c(H2SO4)=9mol/L，加熱蒸餾90min，以除去可能存在的痕量Os。
超純HBr分析純HBr經石英蒸餾器兩次蒸餾，為了保證HBr的純度和濃度，每次蒸餾捨去開始的蒸出部分，並在蒸餾液剩下1/10時停止蒸餾。最後再用雙瓶亞沸蒸餾一次。純化後c(HBr)=8.2mol/L。
助發射劑Ba(OH)2飽和溶液稱取4.0g分析純Ba(OH)2·8H2O於60mLTeflon試劑瓶內。約90℃熱水浴中加熱30min，自然冷卻過夜，可得到Ba(OH)2飽和溶液。在試劑瓶下部可看到Ba(OH)2·8H2O針狀結晶，溶液表面漂浮有白色Ba(CO3)2。用滴管取中間部分溶液到1.5mLTeflon離心管中，備點帶時使用。用Parafilm膜密封Ba(OH)2飽和溶液，防止空氣中的CO2與Ba(OH)2生成Ba(CO3)2沉澱。Ba的存在顯著降低了鉑燈絲的電功函，提高了試樣離子的產出率。
助發射劑Ba(NO3)2溶液由分析純Ba(OH)2、優級純NaOH和超純HNO3配製而成。Ba4g/L、Na1g/L、HNO31mol/L。
陰離子交換樹脂BioradAG-1X874～38μm(200～400目)，Cl-型。使用前用超純水清洗，除去陰離子樹脂中的漂浮物。然後將陰離子樹脂裝入內徑約3mm的玻璃交換柱中，柱床高2cm，下墊玻璃纖維。用5mL8mol/LHNO3清洗Re，並用水洗至中性，再用2mL0.8mol/LHNO3平衡。採用N-TIMS測量Re時，必須用小陰離子交換柱對已分離出來的Re溶液作進一步純化。
其他試劑同86.5.3.1。
高純鉑帶純度w(Pt)=99.999%。美國H.Cross公司產品規格為0.7mm×0.025mm，美國ESPI公司產品規格為0.5mm×0.02mm。鉑電離帶在使用前必須經過處理，不然Os本底會高達幾十pg以上，Re本底高於幾百pg。Pt帶的處理流程為:用丙酮浸泡鉑帶，超聲洗滌30min，以除去鉑帶上少量的Re。將鉑帶插件置於超凈台中的點樣裝置上，在潔凈的大氣中勻速升高電流使其燒紅直至發光，此時通過鉑帶的電流約為2.5A，持續10min後迅速降下電流。這一步可以將鉑帶上的微量Os燒掉。在空氣中燒過的鉑帶必須在乾燥器中放置半天後方可點樣，這樣試樣在鉑帶上的分布集中而不會散開。一定要小心用保鮮膜包好放帶的盒子，防止再被污染。經過上面3步處理過的Pt帶的Os本底可降至1pg以下。
試樣制備
樣品採集和加工、Re-Os含量粗測、取樣量和稀釋劑的加入、試樣分解、鋨的蒸餾分離和錸的萃取分離步驟同86.5.3.1ICP-MS法測定。對於N-TIMS測定，需要進一步進行鋨的微蒸餾純化和錸的離子交換純化。
1)微蒸餾純化Os。為了進行NTIMS測定，還必須對Os的水吸收液作進一步微蒸餾純化(圖86.3)。將Os的蒸餾溶液加入等體積超純HBr，在烘箱中於80℃保溫4h。將溶液轉入100mLTeflon蒸發皿內，蒸餾到小體積(約30μL)，用微量取樣管的塑料吸頭吸取濃縮液轉移至Teflon尖底瓶蓋中央，緩慢蒸發至干。用微量取樣管吸取10μL8mol/LHBr置於Teflon尖底瓶的尖底上，將40μL配製好的微蒸餾用氧化劑溶液［w(CrO3)=100g/L，c(H2SO4)=9mol/L］加到Teflon尖底瓶蓋上含Os的殘渣上。迅速將已裝有10μL8mol/LHBr的Teflon尖底瓶的底部倒扣在已裝好試樣和氧化劑溶液的蓋上，盡快旋緊密封，塑料瓶底部和周圍用鋁箔包圍，頂上不包鋁箔。將倒置的尖底瓶平移至電熱板上，於60～80℃加熱3.5～4h。殘渣中的鋨被氧化成OsO4進入氣相，達到小瓶的尖頂上被HBr重新還原為六溴鋨酸。微蒸餾完成以後，將蓋子上的氧化劑用Milli-Q水洗去，磕掉上面的水，將微蒸餾器正立放置，擰緊蓋子，過夜，在80℃下保溫4h，然後將尖底中的HBr溶液蒸干備點帶用。
2)陰離子交換純化Re。將用於ICP-MS測定Re的溶液蒸發至近干，用3mL0.8mol/LHNO3中和溶解殘渣。轉移該溶液到已用0.8mol/LHNO3平衡的陰離子交換柱上。依次用3mL0.8mol/LHNO3、3mL1mol/LHCl和1mL水洗去雜質。最後用3mL4mol/LHNO3洗脫Re於10mL比色管中，並觀察是否有穿漏的樹脂顆粒。用滴管移取無樹脂顆粒的清液到7mLTeflon圓底小瓶中，在電熱板上加熱近干。反復加水和加熱近干數次，以降低酸度。如果HNO3濃度過高，點帶時溶液發散，不利於質譜測定。根據Re含量高低保留體積為數十微升，備N-TIMS測定Re同位素比值。對於低含量Re的試樣最好每次重新裝柱。
N-TIMS同位素比值測定
Re和Os質譜測量均採用單帶源和輸氧技術。待真空度達到1×10-7hPa時，開始輸入氧氣，使試樣中Re和Os充分氧化。當氧氣氣壓穩定在5×10-7hPa水平時，方可開始加熱燈絲。OsO3-的發射溫度約為890℃，ReO-4要低一些。
Os同位素比值測量
為了獲得足夠強而穩定的OsO-3信號，要正確地把試樣點在Pt帶上:在點樣前加入10μLHBr到已完成微蒸餾的尖底瓶的尖底部分，置烘箱中於60～80℃加熱15min。冷卻後即可點樣。點樣時不要將微蒸餾器壁上的溶渣混合到尖底處溶液中。用微量移液器將試樣的HBr溶液小心地點在鉑帶上(每次取0.2μL)，以0.6A電流蒸干。當微蒸餾器中含OsHBr溶液全部轉移完全蒸干後，緩慢升高電流至1.2A，持續1min趕盡多餘的HBr，隨後降下電流(蒸干即可，不要升電流，不要發紅)。
加發射劑。取5～7μLBa(OH)2飽和溶液作為發射劑滴在試樣上，以0.6A電流蒸干，可看到乳白色的沉澱覆蓋在Pt帶上。隨後緩慢升高電流至乳白色沉澱開始熔化成像冰一樣的狀態，而後降低電流。
圖86.3 微蒸餾示意
測量過程。在測量時，電離帶升溫速度的選擇是能否成功測量Os的又一重要因素。如升溫速度太快，會明顯降低Os的陰離子產生效率，甚至不產生OsO3-負離子。具體升溫步驟(以美國H.Cross公司出品，規格為0.7mm×0.025mm的Pt帶為例)為:首先以100mA/min的速率自動增加電離帶電流，直到1900mA為止。然後以8～10mA/min的速率繼續緩慢升高電流，同時用離子計數器監測(190Os16O3)-離子(質量數238)。當出現幾十個計數時，停止升高電流，持續數分鍾後離子流強度會自然穩步上升。當上升速度明顯變慢時，離子流強度一般已達到預期的大小，開始測量質量232、234、235、236、237、238、240。如果信號不夠大，則繼續緩慢地升高電流，直到獲得穩定的足夠強的離子流。在升溫的過程中，必須注意信號的變化，根據實際情況調整電流增加的速度和強度。如果信號開始衰減，則表明電離帶的溫度已經超過Os發射的最佳溫度了。
Re同位素比值的質譜測量
ReO4-的發射溫度相對OsO3-要低一些，Re同位素比值較容易測量。把經陰離子交換純化後的含Re溶液用微量移液器小心地點在鉑帶上。按上面Os的方法點樣、加發射劑和測量。測量Re採用3μLBa(NO3)2溶液(Ba4g/L、Na1g/L、HNO31mol/L)作為發射劑。
質量分餾效應和同位素干擾校正
1)質量分餾效應校正。TIMS法質譜測定同位素組成時，由於輕同位素的優先蒸發和電離也不可避免地發生質量分餾，從而導致測量值偏離實際同位素比值。為了得到准確的同位素比值，必須對測量值進行質量分餾校正，對於普Os用240/236值作為標准化值，240/236值為3.092203。按指數規律對其他同位素比值進行校正。Triton和MAT262均可對普Os進行在線分餾校正。對於加有稀釋劑的情況，可首先對OsO3-進行脫氧計算，在Os的正離子狀態下以192Os/188Os(未加稀釋劑時192Os/188Os=3.0827)作為標准化值進行質量分餾校正的迭代計算(楊剛，2005)。N-TIMS的質量分餾一般小於0.1%，大大好於ICP-MS(1%～2%)。為了標定稀釋劑，曾經用普Os和190Os稀釋劑以不同比例混合得到3種不同比值的Os同位素的溶液。分別測定了同位素比值並進行了計算。結果表明，在238質量信號強度在200mV以上，進行分餾校正與不進行分餾校正相比僅相差0.012%;如果信號強度只有幾十mV，二者的差別可有0.1%～0.2%。
在實際測量中，Re同位素呈現出明顯的同位素分鎦效應，因此必須對測量結果進行同位素分鎦校正。本實驗室曾經在4年間隔中採用Mat-262N-TIMS對天然Re標準的187/185進行數十次測量，計算得出Re同位素比值分鎦系數約為(1.002±0.001)。因此在測定加有稀釋劑的Re同位素比值時需以普通Re為同位素比值標准，用外標法進行同位素比值校正。
Suzuki(2004)採用全蒸發方法N-TIMS測定Re同位素比值，其基本原理就是接收所有Re的信號，利用所有249和251峰的強度總和相比得到185/187的比值。也就是在數據採集過程中是採集數據的強度而不是瞬時比值，最後用強度的總和相除得到最後的比值。從理論上講，全蒸發方法避免了輕同位素的優先蒸發和電離造成的同位素比值的變化，消除了Re的質量分餾問題。與常規方法比較，該法優點是准確度高、需要試樣量少、測量時間短(一般10～15min測一個試樣)。可以准確測定稀釋法中Re同位素比值。
2)同位素干擾校正。採用逐級剝譜法進行氧同位素校正。錸和氧同位素結合的多原子負離子形式有ReO3-和ReO4-兩種，以ReO4-為主。鋨和氧同位素結合的離子形式有OsO3-和OsO4-兩種，以OsO3-為主。氧有3種同位素，它們與Re、Os排列組合形成多種不同質量的多原子負離子。
在氧的3種同位素中，16O同位素豐度最高，3個16O與各種鋨同位素結合，形成了N-TIMS測定Re、Os同位素的主質量峰。7個Os同位素(184、186、187、189、190、192)分別與3個16O結合形成的幾個主質量峰的質量分別為232、234、235、236、237、238、240。自然氧同位素的豐度在附錄86.5D的表86.23中。
按照等概率模型計算了Os同位素與不同組合的3個氧同位素結合所出現的概率見表86.6。
表86.6 根據等概率模型在OsO-3與ReO-4中各種氧同位素組合出現的概率
注:Δm為OsO-3、ReO-4與主質量峰的差值。
OsO-3與主質量峰差值(Δm)為0時，即1個Os同位素與3個16O結合構成的主質量峰出現的概率為0.992879(3個自然16O同位素豐度的乘積);低質量鋨同位素和不同比例的16O、17O、18O結合，使OsO-3質量數增加，並疊加在高質量鋨同位素的主質量峰上。
OsO-3與主質量峰差值(Δm)為1時，即1個Os同位素與2個16O和1個17O結合構成的質量峰出現的概率為0.001132(3×16O同位素豐度×16O同位素豐度×17O同位素豐度)。
OsO3-與主質量峰差值(Δm)為2時，出現的概率為0.005973，即3×16O同位素豐度×16O同位素豐度×18O同位素豐度+3×16O同位素豐度×17O同位素豐度×17O同位素豐度)。
Δm在3以上干擾峰出現的概率很低(見表86.6)，一般可忽略。在Os同位素譜圖中只有184Os16O16O16O-(質量232)質譜峰不受其他同位素的影響。為了消除各種次峰對主質量峰的干擾，可採用逐級剝譜法進行氧同位素的校正。首先根據表86.6扣除184Os與不同氧同位素結合對186Os等其他高質量鋨同位素主質量峰的貢獻，然後再根據修正後的186Os峰值按表86.6扣除它對187Os等其他高質量鋨同位素主質量的貢獻。依此類推，從低質量到高質量逐級剝除所有低質量Os同位素與不同氧同位素結合對高質量鋨同位素主質量峰的貢獻。採用Excel表可方便地扣除干擾，得到修正氧同位素干擾後的鋨同位素比值。
Re的兩個同位素(187、185)分別與4個16O結合形成N-TIMS測定時的兩個主質量峰249和251。同樣可按照等概率模型計算Re同位素與不同組合的4個O同位素結合所出現的概率。
ReO4-與主質量峰差值(Δm)為0時，即1個Re同位素與4個16O結合構成的主質量峰出現的概率為0.990516(4個自然16O同位素豐度的乘積)。
ReO4-與主質量峰差值(Δm)為2時，即1個Re同位素與2個16O和2個17O結合構成的質量峰+1個Re同位素與3個16O和1個18O結合構成的質量峰出現的概率為0.007945(6×16O同位素豐度×16O同位素豐度×17O同位素豐度×17O同位素豐度+4×16O同位素豐度×16O同位素豐度×16O同位素豐度×18O同位素豐度)。
錸和鋨的離子電離電位不同，錸的離子電離電位較低，因而Os的存在不會影響Re的測量，少量187Re16O16O16O-(235)的存在會影響187Os16O16O16O-(235)的准確測定，這一干擾可以利用185Re16O16O16O-(233)的峰強度通過計算消除。