① 凝膠過濾層析上樣體積為什麼只有1-2ml，如果體積大了會有什麼影響
凝膠過濾層析上復樣體積為什制么只有1-2ml，如果體積大了會有什麼影響
你說的洗脫體積之差是指兩個組分的洗下來的體積?你這個問題第一次見,沒有聽說過樣品體積要小於洗脫體積之差這種說法,你在哪裡看到的.一般使用凝膠過濾層析,想要獲得高解析度,上樣體積控制在柱床體積的0.5—4%,最好是2%,群組分離時可以達到30%,小於0.5%沒有意義了.另外,目前市面上解析度最好的柱料是GE的Superdex,手填柱子的話可以達到10K解析度.預裝柱應該更高,但是十分昂貴,沒有試過.其他柱料分離的解析度要求兩種蛋白的分子量相差一倍以上,如果不滿足這個條件,大多是騙人的.還有柱料的選擇,緩沖液的選擇和樣品的處理等等很多條件都影響了凝膠層析的效果.
② 凝膠過濾層析和電泳的異同
記得最開始上生物化學的時候，老師問我凝膠電泳和凝膠過濾有什麼區別，當時我回回答一個用電，一個答不用電。。。。。凝膠過濾又稱為分子篩，是用一根柱子裡面有填料，填料是一些粒子，粒子裡面有很多的孔，分子比較小的能進入到粒子的孔裡面，二分子比較大的就會在粒子旁邊流下來。所以用一些蛋白或者是多糖過分子篩，分子大的會先流下來，分子小的後流下來。。。凝膠電泳是運用電泳儀，讓蛋白質或者是核酸在凝膠中移動，移動的速率和分子的大小成反比，分子大的跑得慢，分子小的跑得快。。。。簡單地說，就是這樣。。。。
③ 蛋白質純化，凝膠過濾層析填料
首先瓊脂糖凝膠可來以排源除，這是大孔凝膠，用於分子量較大的成分。
我做分子篩用的比較多的柱子都是葡聚糖凝膠凝膠，我的蛋白比你的大，用G50和G100的填料，做的結果都沒什麼問題。
你的蛋白7kD，如果沒有什麼特別的性質（高級結構是球形還是其他的，有無多聚），G50應該可以。如果你不放心，也可以考慮聚丙烯醯胺凝膠，它和葡聚糖凝膠相比更適合於分子量稍小的蛋白，可能更實用於你的實驗。
聚苯乙烯凝膠沒用過，不發表意見。
④ 凝膠過濾層析實驗中常用的凝膠有哪些
SDS-PAGE 、瓊脂糖
⑤ 凝膠過濾層析中凝膠顆粒的直徑越小越好還是越大越好 為什麼
這個要視你的要求而定，顆粒越小分離度越好，但同時柱壓越大，流速越慢，一般在滿足你分離度要求的情況下，顆粒直徑越大越好，這樣流速快，可以減少純化時間。
⑥ 凝膠過濾層析的基本原理
凝膠過濾層析又稱為排阻層析或分子篩方法。其基本原理是利用被分離物質分子大小不同及固定相（凝膠）具有分子篩的特點，將被分離物質各成分按分子大小分開，達到分離的目的。層析柱中的填料是某些惰性的多孔網狀結構物質，多是交聯的聚糖(如葡聚糖或瓊脂糖)類物質，小分子物質能進入其內部，流下時路程較長，而大分子物質卻被排除在外部，下來的路程短，當一混合溶液通過凝膠過濾層析柱時，溶液中的物質就按不同分子量篩分開了。
⑦ 凝膠過濾層析法加樣是應注意哪些問題
一般分為三個步驟：裝柱、加樣、洗脫淋洗。
裝柱是需要注意的是：【1】垂直放置版 【2】放置產生氣泡權 【3】放置柱分層
加樣時，【1】加樣前打開出口，使展開劑流出，至正好露出凝膠上平面時，立即關閉出口
【2】加樣時，用滴管緩緩沿柱內壁加入柱子
【3】打開柱子得出口，使待分離的樣品進入柱子。
加樣完成後，進行洗脫。
⑧ 凝膠過濾層析可根據蛋白質的大小將之分離...
小分子量蛋白質
大分子量蛋白質
⑨ 凝膠過濾層析里為了完全分開兩種組分,樣品為什麼一定不能大於洗脫體積之差
凝膠層析操作中應注意的一些具體問題。 (1)層析柱的選擇層析柱大小主要是根據樣品量的多少以及對解析度的要求來進行選擇。一般來講，主要是層析柱的長度對解析度影響較大，長的層析柱解析度要比短的高；但層析柱長度不能過長，否則會引起柱子不均一、流速過慢等實驗上的一些困難。一般柱長度不超過100cm，為得到高解析度，可以將柱子串聯使用。層析柱的直徑和長度比一般在1:25－1:100之間。用於分組分離的凝膠柱，如脫鹽柱由於對解析度要求較低，所以一般比較短。 (2)凝膠柱的鑒定凝膠柱的填裝情況將直接影響分離效果，關於填裝的方法前面已有介紹，這里主要介紹對填裝好的凝膠柱的鑒定。凝膠柱填裝後用肉眼觀察應均勻、無紋路、無氣泡。另外通常可以採用一種有色的物質，如藍色葡聚糖-2000、血紅蛋白等上柱，觀察有色區帶在柱中的洗脫行為以檢測凝膠柱的均勻程度。如果色帶狹窄、平整、均勻下降，則表明柱中的凝膠填裝情況較好，可以使用；如果色帶彌散、歪曲，則需重新裝柱。另外值得一提的是，有時為了防止新凝膠柱對樣品的吸附，可以用一些物質預先過柱，以消除吸附。 (3)洗脫液的選擇由於凝膠層析的分離原理是分子篩作用，它不象其它層析分離方式主要依賴於溶劑強度和選擇性的改變來進行分離，在凝膠層析中流動相只是起運載工具的作用，一般不依賴於流動相性質和組成的改變來提高解析度，改變洗脫液的主要目的是為了消除組分與固定相的吸附等相互作用，所以和其它層析方法相比，凝膠層析洗脫液的選擇不那麼嚴格。由於凝膠層析的分離機理簡單以及凝膠穩定工作的pH 范圍較廣，所以洗脫液的選擇主要取決於待分離樣品，一般來說只要能溶解被洗脫物質並不使其變性的緩沖液都可以用於凝膠層析。為了防止凝膠可能有吸附作用，一般洗脫液都含有一定濃度的鹽。 (4)加樣量關於加樣前面已經有所介紹，要盡量快速、均勻。另外加樣量對實驗結果也可能造成較大的影響，加樣過多，會造成洗脫峰的重疊，影響分離效果；加樣過少，提純後各組分量少、濃度較低，實驗效率低。加樣量的多少要根據具體的實驗要求而定：凝膠柱較大，當然加樣量就可以較大；樣品中各組分分子量差異較大，加樣量也可以較大；一般分級分離時加樣體積約為凝膠柱床體積的1％－5％左右，而分組分離時加樣體積可以較大，一般約為凝膠柱床體積的10％－25％。如果有條件可以首先以較小的加樣量先進行一次分析，根據洗脫峰的情況來選擇合適的加樣量。設要分離的兩個組分的洗脫體積分別為Ve1和Ve2，那麼加樣量不能超過(Ve1－Ve2)。實際由於樣品擴散，所以加樣量應小於這個值。從洗脫峰上看，如果所要的各個組分的洗脫峰分得很開，為了提高效率，可以適當增加加樣量；如果各個組分的洗脫峰只是剛好分開或沒有完全分開，則不能再加大加樣量，甚至要減小加樣量。另外加樣前要注意，樣品中的不溶物必須在上樣前去掉，以免污染凝膠柱。樣品的粘度不能過大，否則會影響分離效果。 (5)洗脫速度洗脫速度也會影響凝膠層析的分離效果，一般洗脫速度要恆定而且合適。保持洗脫速度恆定通常有兩種方法，一種是使用恆流泵，另一種是恆壓重力洗脫。洗脫速度取決於很多因素，包括柱長、凝膠種類、顆粒大小等，一般來講，洗脫速度慢一些樣品可以與凝膠基質充分平衡，分離效果好。但洗脫速度過慢會造成樣品擴散加劇、區帶變寬，反而會降低解析度，而且實驗時間會大大延長；所以實驗中應根據實際情況來選擇合適的洗脫速度，可以通過進行預備實驗來選擇洗脫速度。一般凝膠的流速是2－10 cm/hr，市售的凝膠一般會提供一個建議流速，可供參考。總之，凝膠層析的各種條件，包括凝膠類型、層析柱大小、洗脫液、上樣量、洗脫速度等等，都要根據具體的實驗要求來選擇。例如樣品中各個組分差異較小，則實驗要求凝膠層析要有較高的解析度，提高解析度的選擇應主要包括：選擇包括各個待分離組分但分離范圍盡量小一些的凝膠，選擇顆粒小的凝膠，選擇解析度高的凝膠類型，選擇較長、直徑較大的層析柱、減少加樣量、降低洗脫速度等等。
⑩ 影響凝膠過濾層析實驗結果的因素有哪些
凝膠層析操作中應注意的一些具體問題.
(1)層析柱的選擇
層析柱大小主要是根據樣品量的多少以及對解析度的要求來進行選擇.一般來講,主要是層析柱的長度對解析度影響較大,長的層析柱解析度要比短的高；但層析柱長度不能過長,否則會引起柱子不均一、流速過慢等實驗上的一些困難.一般柱長度不超過100cm,為得到高解析度,可以將柱子串聯使用.層析柱的直徑和長度比一般在1:25－1:100之間.用於分組分離的凝膠柱,如脫鹽柱由於對解析度要求較低,所以一般比較短.
(2)凝膠柱的鑒定
凝膠柱的填裝情況將直接影響分離效果,關於填裝的方法前面已有介紹,這里主要介紹對填裝好的凝膠柱的鑒定.凝膠柱填裝後用肉眼觀察應均勻、無紋路、無氣泡.另外通常可以採用一種有色的物質,如藍色葡聚糖-2000、血紅蛋白等上柱,觀察有色區帶在柱中的洗脫行為以檢測凝膠柱的均勻程度.如果色帶狹窄、平整、均勻下降,則表明柱中的凝膠填裝情況較好,可以使用；如果色帶彌散、歪曲,則需重新裝柱.另外值得一提的是,有時為了防止新凝膠柱對樣品的吸附,可以用一些物質預先過柱,以消除吸附.
(3)洗脫液的選擇
由於凝膠層析的分離原理是分子篩作用,它不象其它層析分離方式主要依賴於溶劑強度和選擇性的改變來進行分離,在凝膠層析中流動相只是起運載工具的作用,一般不依賴於流動相性質和組成的改變來提高解析度,改變洗脫液的主要目的是為了消除組分與固定相的吸附等相互作用,所以和其它層析方法相比,凝膠層析洗脫液的選擇不那麼嚴格.由於凝膠層析的分離機理簡單以及凝膠穩定工作的pH 范圍較廣,所以洗脫液的選擇主要取決於待分離樣品,一般來說只要能溶解被洗脫物質並不使其變性的緩沖液都可以用於凝膠層析.為了防止凝膠可能有吸附作用,一般洗脫液都含有一定濃度的鹽.
(4)加樣量
關於加樣前面已經有所介紹,要盡量快速、均勻.另外加樣量對實驗結果也可能造成較大的影響,加樣過多,會造成洗脫峰的重疊,影響分離效果；加樣過少,提純後各組分量少、濃度較低,實驗效率低.加樣量的多少要根據具體的實驗要求而定：凝膠柱較大,當然加樣量就可以較大；樣品中各組分分子量差異較大,加樣量也可以較大；一般分級分離時加樣體積約為凝膠柱床體積的1％－5％左右,而分組分離時加樣體積可以較大,一般約為凝膠柱床體積的10％－25％.如果有條件可以首先以較小的加樣量先進行一次分析,根據洗脫峰的情況來選擇合適的加樣量.設要分離的兩個組分的洗脫體積分別為Ve1和Ve2,那麼加樣量不能超過(Ve1－Ve2).實際由於樣品擴散,所以加樣量應小於這個值.
從洗脫峰上看,如果所要的各個組分的洗脫峰分得很開,為了提高效率,可以適當增加加樣量；如果各個組分的洗脫峰只是剛好分開或沒有完全分開,則不能再加大加樣量,甚至要減小加樣量.另外加樣前要注意,樣品中的不溶物必須在上樣前去掉,以免污染凝膠柱.樣品的粘度不能過大,否則會影響分離效果.
(5)洗脫速度
洗脫速度也會影響凝膠層析的分離效果,一般洗脫速度要恆定而且合適.保持洗脫速度恆定通常有兩種方法,一種是使用恆流泵,另一種是恆壓重力洗脫.洗脫速度取決於很多因素,包括柱長、凝膠種類、顆粒大小等,一般來講,洗脫速度慢一些樣品可以與凝膠基質充分平衡,分離效果好.但洗脫速度過慢會造成樣品擴散加劇、區帶變寬,反而會降低解析度,而且實驗時間會大大延長；所以實驗中應根據實際情況來選擇合適的洗脫速度,可以通過進行預備實驗來選擇洗脫速度.一般凝膠的流速是2－10 cm/hr,市售的凝膠一般會提供一個建議流速,可供參考.總之,凝膠層析的各種條件,包括凝膠類型、層析柱大小、洗脫液、上樣量、洗脫速度等等,都要根據具體的實驗要求來選擇.例如樣品中各個組分差異較小,則實驗要求凝膠層析要有較高的解析度,提高解析度的選擇應主要包括：選擇包括各個待分離組分但分離范圍盡量小一些的凝膠,選擇顆粒小的凝膠,選擇解析度高的凝膠類型,選擇較長、直徑較大的層析柱、減少加樣量、降低洗脫速度等等.