① 請教常用的細胞篩選的方法~~
應該是流式細胞儀了 這個東西很管用
以下是部分內容 其實去網路一搜就好了
流式細胞計是對細胞進行自動分析和分選的裝置。它可以快速測量、存貯、顯示懸浮在液體中的分散細胞的一系列重要的生物物理、生物化學方面的特徵參量，並可以根據預選的參量范圍把指定的細胞亞群從中分選出來。多數流式細胞計是一種零解析度的儀器，它只能測量一個細胞的諸如總核酸量，總蛋白量等指標，而不能鑒別和測出某一特定部位的核酸或蛋白的多少。也就是說，它的細節 解析度為零。
流式細胞計可同時進行多參數測量，信息主要來自特異性熒光信號及非熒光散射信號。測量是在測量區進行的，所謂測量區就是照射激光束和噴出噴孔的液流束垂直相交點。液流中央的單個細胞通過測量區時，受到激光照射會向立體角為2π的整個空間散射光線，散射光的波長和入射光的波長相同。散射光的強度及其空間分布與細胞的大小、形態、質膜和細胞內部結構密切相關，因為這些生物學參數又和細胞對光線的反射、折射等光學特性有關。未遭受任何損壞的細胞對光線都具有特徵性的散射，因此可利用不同的散射光信號對不經染色活細胞進行分析和分選。經過固定的和染色處理的細胞由於光學性質的改變，其散射光信號當然不同於活細胞。散射光不僅與作為散射中心的細胞的參數相關，還跟散射角、及收集散射光線的立體角等非生物因素有關。
在流式細胞術測量中，常用的是兩種散射方向的散射光測量：①前向角（即0角）散射（FSC）；②側向散射（SSC），又稱90角散射。這時所說的角度指的是激光束照射方向與收集散射光信號的光電倍增管軸向方向之間大致所成的角度。一般說來，前向角散射光的強度與細胞的大小有關，對同種細胞群體隨著細胞截面積的增大而增大；對球形活細胞經實驗表明在小立體角范圍內基本上和截面積大小成線性關系；對於形狀復雜具有取向性的細胞則可能差異很大，尤其需要注意。側向散射光的測量主要用來獲取有關細胞內部精細結構的顆粒性質的有關信息。側向散射光雖然也與細胞的形狀和大小有關，但它對細胞膜、胞質、核膜的折射率更為敏感，也能對細胞質內較大顆粒給出靈敏反映。
在實際使用中，儀器首先要對光散射信號進行測量。當光散射分析與熒光探針聯合使用時，可鑒別出樣品中被染色和未被染色細胞。光散射測量最有效的用途是從非均一的群體中鑒別出某些亞群。
熒光信號主要包括兩部分：①自發熒光，即不經熒光染色細胞內部的熒光分子經光照射後所發出的熒光；②特徵熒光，即由細胞經染色結合上的熒光染料受光照而發出的熒光，其熒光強度較弱，波長也與照射激光不同。自發熒光信號為雜訊信號，在多數情況下會干擾對特異熒光信號的分辨和測量。在免疫細胞化學等測量中，對於結合水平不高的熒光抗體來說，如何提高信噪比是個關鍵。一般說來，細胞成分中能夠產生的自發熒光的分子（例核黃素、細胞色素等）的含量越高，自發熒光越強；培養細胞中死細胞/活細胞比例越高，自發熒光越強；細胞樣品中所含亮細胞的比例越高，自發熒光越強。
減少自發熒光干擾、提高信噪比的主要措施是：①盡量選用較亮的熒光染料；②選用適宜的激光和濾片光學系統；③採用電子補償電路，將自發熒光的本底貢獻予以補償。
樣品分選原理
流式細胞計的分選功能是由細胞分選器來完成的。總的過程是：由噴嘴射出的液柱被分割成一連串的小水滴，根據選定的某個參數由邏輯電路判明是否將被分選，而後由充電電路對選定細胞液滴充電，帶電液滴攜帶細胞通過靜電場而發生偏轉，落入收集器中；其它液體被當作廢液抽吸掉，某些類型的儀器也有採用捕獲管來進行分選的。
穩定的小液滴是由流動室上的壓電晶體在幾十KHz的電信號作用下發生振動而迫使液流均勻斷裂而形成的。一般液滴間距約距約數百μm。實驗經驗公式f=v/4.5d給出形成穩定水滴的振盪信號頻率。其中v是液流速度，d為噴孔直徑。由此可知使用不同孔徑的噴孔及改變液流速度，可能會改變分選效果。使分選的含細胞液滴在靜電場中的偏轉是由充電電路和偏轉板共同完成的。充電電壓一般選+150V，或-150V；偏轉板間的電位差為數千伏。充電電路中的充電脈沖發生器是由邏輯電路控制的，因此從參數測定經邏輯選擇再到脈沖充電需要一段延遲時間，一般為數十ms。精確測定延遲時間是決定分選質量的關鍵，儀器多採用移位寄存器數字電路來產生延遲。可根據具體要求予以適當調整。
（50）數據處理原理：FCM的數據處理主要包括數據的顯示和分析，至於對儀器給出的結果如何解釋則隨所要解決的具體問題而定。
①數據顯示：FCM的數據顯示方式包括單參數直方圖、二維點圖、二維等高圖、假三維圖和列表模式等。
直方圖是一維數據用昨最多的圖形顯示形式，既可用於定性分析，又可用於定量分析，形同一般X—Y平面描圖儀給出的曲線。根據選擇放大器類型不同，橫座標可以是線性標度或對數標度，用「道數」來表示,實質上是所測的熒光或散射光的強度。縱座標一般表示的是細胞的相對數。圖10-2給出的是直方圖形式。只能顯示一個參數與細胞之間的關系是它的局限性。
二維點圖能夠顯示兩個獨立參數與細胞相對數之間的關系。橫座標和縱座標分別為與細胞有關的兩個獨立參數，平面上每一個點表示同時具有相應座標植的細胞存在（圖10-3）。可以由二維點圖得到兩個一維直方圖，但是由於兼並現象存在，二維點圖的信息量要大於二個一維直方圖的信息量。所謂兼並就是說多個細胞具有相同的二維座標在圖上只表現為一個點，這樣對細胞點密集的地方就難於顯示它的精細結構。
圖10-2 直方圖 圖10-3 二維點圖
二維等高圖類似於地圖上的等高線表示法。它是為了克服二維點圖的不足而設置的顯示方法。等高圖上每一條連續曲線上具有相同的細胞相對或絕對數，即「等高」。曲線層次越高所代表的細胞數愈多。一般層次所表示的細胞數間隔是相等的，因此等高線越密集則表示變化率越大，等高線越疏則表示變化平衡。圖10-4給出了二維等高圖的樣式。
假三維圖是利用計算機技術對二維等高圖的一種視覺直觀的表現方法。它把原二維圖中的隱座標—細胞數同時顯現，但參數維圖可以通過旋轉、傾斜等操作，以便多方位的觀察「山峰」和「谷地」的結構和細節 ，這無疑是有助於對數據進行分析的。圖10-5為假三維圖的示意圖。
圖10-4 二維等高圖 圖10-5 假三維圖
列表模式其實只是多參數數據文件的一種計算機存貯方式，三個以上的參數數據顯示是用多個直方圖、二維圖和假三維圖來完成的。可用ListMode中的特殊技術，開窗或用游標調出相關部分再改變維數進行顯示。例如，「一調二」就是在一維圖上調出二維圖來；「二調一」就是從二維圖中調出一維圖來。圖10-6給出了從二維圖等高圖中調出相應窗口的直方圖的示意圖。
圖10-6 從二維圖設窗調出直方圖示意
上面簡要地介紹了幾種數據顯示形式，在實際應用中，可根據需要選擇匹配，以便了解和獲得盡可能多的有用信息。
②數據分析：數據分析的方法總的可分為參數方法和非參數方法兩大類。當被檢測的生物學系統能夠用某種數學模型技術時則多使用參數方法。數學模型可以是一個方程或方程組，方程的參數產生所需要的信息來自所測的數據。例如在測定老鼠精子的DNA含量時，可以獲取細胞頻數的尖銳波形分布。如果採用正態分布函數來描述這些數據，則參數即為面積、平均值和標准偏差。方程的數據擬合則通常使用最小二乘法。而非參數分析法對測量得到的分布形狀不需要做任何假設，即採用無設定參數分析法。分析程序可以很簡單，只需要直觀觀測頻數分布；也可能很復雜，要對兩個或多個直方圖逐道地進行比較。
逐點描圖（或用手工，或用描圖儀、計算機系統）是大家常用的數據分析的重要手段。我們常可以用來了解數據的特性、尋找那些不曾預料的特異徵兆、選擇統計分析的模型、顯示最終結果等。事實上，不經過先對數據進行直觀觀察分析就決不應該對這批數據進行數值分析。從這一點來看，非參數分析是參數分析的基礎。
逐道比較工作量較大，但用直觀法很容易發現明顯的差異，特別是對照組和測試組。考慮到FCM的可靠性，要注意到對每組測量，都要有對照組，對照組可以是空白對照組、陰性對照組、或零時刻對照組等，具體設置應根據整體實驗要求而定。對照組和測試組的逐道比較往往可以減少許多不必要的誤差和錯誤解釋。順便指出，進行比較時對曲線的總細胞數進行歸一化處理，甚至對兩條曲線逐道相減而得到「差結果曲線」往往是適宜的。
因為數據分析往往和結果解釋關系十分密切，也就是說和生物學背景相關，因此具體的分析法和原理將在後面結合實例再介紹。
② 求免疫熒光DHE染色具體步驟和細胞流式的具體步驟
細胞免疫熒光的詳細操作步驟1，取出細胞爬片放到35mm或60mm用過的細胞培養皿里，PBS洗三遍。注意有的時候作的細胞爬片可能比較小，因此夾取的時候要小心。2，4%多聚甲醛固定20分鍾，PBS洗三遍。3，0.2%TritonX100通透10分鍾，PBS洗三遍。4，與二抗相同宿主的血清封閉30分鍾，PBS洗三遍。5.，一抗4度濕盒內過夜，也可37度2小時，感覺前者效果好，PBS洗三遍。6，二抗室溫2小時，或者37度1半小時，PBS洗三遍。7，最好用DAPI染核，然後直接照熒光片。8，蒸餾水洗掉PBS，甘油封片，指甲油封片子的四周。
③ 幹細胞磁珠分選和流式分選的區別
應管理員要求，我來比較一下流式分選和磁珠分選的優缺點，本來想列一個表，但表格可能表述不清楚，還是用通俗的語言寫啊，個人體會歡迎拍磚。
簡單說一下原理：
現在流式分選一般都是電荷式分選，即對感興趣的目標細胞所在的液滴充上電荷，液滴經過電極板，通過電場作用發生偏轉，從而實現分選。
磁珠分選首先使用磁珠偶聯的抗體去標記細胞，然後把標記好的細胞過柱子（柱子周圍連磁鐵），帶磁珠的細胞就留在柱子上，不帶磁珠的細胞就流走了，從而實現分選。
現在可以比較不同了：
1、對細胞的刺激。 我覺得磁珠分選最大的優勢就是對細胞的刺激要小一點。因為流式分選細胞首先要經過幾十微米的噴嘴，然後要被充電，還要經過幾千伏的電場，最後以幾十米每秒的速度落到收集管裡面，有些原代細胞就受不了，分選免疫細胞也要考慮細胞活化的影響；而磁珠分選相對來說就對細胞沒什麼刺激。
2、設備要求。 磁珠分選小的實驗室就能做，買一些專用的磁鐵和柱子就可以了，而流式分選就需要分選型的流式細胞儀，都是幾百萬以上的。對操作員的要求來說，流式分選也要高一點，需要專門培訓，需要注意的細節也要多很多。
當然如果你周圍有什麼流式平台的話，磁珠分選和流式分選的成本應該是差不多的，流式分選一次大約1-2千（各地方不同），磁珠分選的柱子磁珠差不多也要燒這么多錢。
3、試劑不同。 這個最好理解，流式分選用的是熒光素偶聯的抗體，磁珠分選用的是磁珠結合的抗體。
下面就要說下流式分選的優勢了：
4、分選純度。這個肯定是流式分選的純度高，磁珠分選如果操作好的話也能達到80-90%的純度，但流式分選一般都能達到90％以上（樣本制備和儀器條件正常的條件下）。
5、多參數分選。流式細胞術很大的優勢就是多參數，比如我可以分選CD4+CD25+CD127low的Treg，三色的一次就能分選。磁珠分選就必須先分CD4，再分CD25，更多參數的就沒法進行。
6、低表達群細胞分選。比如有些幹細胞它的表達比例只有百分之零點幾，比例太少磁珠分選無法操作，流式就可以把這些細胞富集起來。
7、胞內熒光分選。流式分選在分子生物學中很大一部分應用就是分選GFP、YFP等陽性細胞，還有可以用Hoechst染精子的單倍體進行分選，這些針對胞內成分的分選也是磁珠分選無法實現的。
另外要說明的是，現在都很流行磁珠分選和流式分選相結合的方法，像上面舉的例子分選CD4+CD25+CD127low的Treg，如果僅用流式分選可能時間太長，純度也有影響。那麼可以選擇先用磁珠純化出CD4陽性的細胞，再過流式分選CD4+CD25+CD127low的群體，這樣既節省了時間保證了活性，也可以提高分選的純度。