iex離子交換柱

① 鎶鏈鍀滀竴綃囨枃絝犺╀綘浜嗚В浠涔堟槸紱誨瓙瀵硅壊璋憋紙IPC錛

鎻寮紱誨瓙瀵硅壊璋憋紙IPC錛夌殑紲炵橀潰綰憋細楂樻晥鍒嗙繪瀬鎬у垎瀛愮殑縐樺瘑姝﹀櫒

鍦ㄥ甫鐢靛垎鏋愮墿鑹茶氨鐨勪笘鐣岄噷錛屾寫鎴樹笌鍥版儜騫跺瓨銆備紶緇熺殑紱誨瓙浜ゆ崲鏌辮櫧鐒朵竴搴︽槸涓誨姏錛屼絾鍏墮珮鏄傛垚鏈鍜屼綆鏁堢巼闂棰樻棩鐩婂嚫鏄俱傝繖鏃跺欙紝紱誨瓙瀵硅壊璋憋紙IPC錛夋倓鐒剁櫥鍦猴紝浠ュ叾鐙鐗圭殑鍒嗙葷瓥鐣ラ犺嗕簡甯歌勩傚畠騫墮潪綆鍗曠殑紱誨瓙鑹茶氨綾誨瀷錛屽傜誨瓙浜ゆ崲鑹茶氨錛圛EX錛夊拰紱誨瓙鎺掗櫎鑹茶氨錛圛EC錛夌殑緲葷増錛岃屾槸閫氳繃闈炵數鑽峰滻瀹氱浉涓庣誨瓙瀵硅瘯鍓傜殑宸у欓厤鍚堬紝瀹炵幇浜嗗規瀬鎬ф垨紱誨瓙鎬х墿璐ㄧ殑楂樻晥鍒嗙匯

鍦↖PC鐨勮繍浣滄満鍒朵腑錛屽叧閿鍦ㄤ簬鍒嗘瀽鐗╀笌紱誨瓙瀵硅瘯鍓傚艦鎴愪腑鎬у嶅悎鐗╃殑榪囩▼錛屽畠浠鍦ㄩ潪鏋佹ф熅涓婅繘琛屽垎紱匯傝繖涓榪囩▼灝ゅ叾閫傚悎鏋佹ф湁鏈洪吀銆佺⒈絳夊寲鍚堢墿鐨勫垎鏋愩備笌IEX鐨勭誨瓙絝炰簤鍜孖EC鐨勭誨瓙鍚擱檮鎺掓枼涓嶅悓錛孖PC閫氳繃嫻佸姩鐩哥殑璋冩帶錛屽閥濡欏湴鎺у埗浜嗗垎紱葷殑鍔ㄦ佽繃紼嬨

紱誨瓙瀵硅壊璋辯殑宸ヤ綔鍘熺悊騫墮潪鍗曚竴錛岃屾槸娑夊強澶氱嶅垎紱繪満鍒訛紝濡傚垎閰嶃佸惛闄勫拰闈欑數浣滅敤銆傚浘1鑷6娣卞叆鍓栨瀽浜嗚繖浜涙満鍒訛紝灞曠ず浜嗙誨瓙瀵瑰備綍鍦ㄧ數鍙屽眰涓褰㈡垚騫跺獎鍝嶅垎鏋愮墿鐨勭Щ鍔ㄣ傜誨瓙閰嶅瑰墏鐨勬祿搴︺佹祦鍔ㄧ浉涓鐨勬湁鏈烘敼鎬у墏銆佹熅娓┿乸H鍊間互鍙婃坊鍔犲墏錛屾瘡涓涓緇嗚妭閮藉瑰垎紱繪晥鏋滀駭鐢熸繁榪滃獎鍝嶃

紱誨瓙瀵規晥搴旀槸IPC鐨勬牳蹇冿紝瀹冮氳繃鐢佃В璐ㄦ憾瑙ｅ艦鎴愮揣瀵嗙殑紱誨瓙瀵癸紝濡傜兎鍩洪摼涓庡垎鏋愮墿鐨勯厤瀵癸紝璁╁畠浠紼沖畾鍦板惛闄勫湪闈炴瀬鎬у滻瀹氱浉涓娿傞夋嫨紱誨瓙瀵硅瘯鍓傛椂錛岃佽冭檻鍏剁誨瓙綾誨瀷銆侀摼闀褲佷翰姘存т互鍙婁笌鏀規у墏鐨勫吋瀹規э紝榪欐槸鍐沖畾鍒嗙繪晥鐜囩殑鍏抽敭鍥犵礌銆

灝界 IPC鍦ㄧ誨瓙瀵歸珮鏁堟恫鐩歌壊璋辨硶錛圚PLC錛変腑灞曠幇鍑轟簡鏄捐憲浼樺娍錛屽傜幆澧冩按鏍蜂腑媧楁釘鍓傚拰鑽鍝佺殑媯嫻嬶紝浠ュ強鐢熺墿鍒嗘瀽濡傞粦鑹茬礌姘у寲浜х墿鍜屾皚鍩洪吀緙╁悎浜х墿鐨勬祴瀹氾紝浣嗗畠騫墮潪娌℃湁灞闄愭с備笌IEX鍜屾ｇ浉鑹茶氨鐩告瘮錛孖PC鐨勫簲鐢ㄨ寖鍥磋櫧騫匡紝浣嗛渶瑕侀拡瀵圭壒瀹氬満鏅榪涜屽弬鏁頒紭鍖栦互杈懼埌鏈浣蟲晥鏋溿備緥濡傦紝鍦ㄩ噾灞炲垎鏋愪腑錛屽傞噸閲戝睘涓嶱AR鐨勮灟鍚堢墿鍜屾斁灝勬ч暐鐨勭函鍖栵紝紱誨瓙瀵笻PLC鍚屾牱澶ф樉韜鎵嬨

緇間笂鎵榪幫紝紱誨瓙瀵硅壊璋卞嚟鍊熷叾綆鍗曟с佸彲瀹氬埗鎬у拰鍦ㄥ垎鏋愬甫鐢靛拰鍙鏋佹у垎瀛愰嗗煙鐨勫箍娉涘簲鐢錛屽凡緇忔垚涓哄垎鏋愰嗗煙鐨勫己澶у伐鍏楓傞氳繃綺劇粏璋冩暣鍙傛暟錛孖PC涓烘垜浠鎻紺轟簡鏋佹у垎瀛愬垎紱葷殑鏂板ぉ鍦幫紝涓哄嶆潅鏍鋒湰鐨勯珮鏁堝垎鏋愭彁渚涗簡鏈夊姏鏀鎸併傚湪鏈鏉ョ殑鐮旂┒涓錛屾垜浠鏈夌悊鐢辨湡寰呯誨瓙瀵硅壊璋卞湪鏇村氶嗗煙涓鍙戞尌鏇村ぇ鐨勪綔鐢錛屾帹鍔ㄧ戝﹀墠娌跨殑榪涙ャ

鍙傝冭祫鏂欙細

• Ksborg S, Lagerström P-O, Modin R, Schill G. Ion-pair Chromatography (1973) doi:10.1016/S0021-9673(00)97031-6


• Grygo-Szymanko et al. Manganese speciation analysis (2017) doi:10.1080/00032719.2016.1267185


• Haddad & Jackson. Ion Chromatography principles (1990) doi:10.1016/S0301-4770(08)61141-0


• Weiss. Handbook of Ion Chromatography (2016) doi:10.1002/9783527651610


• Nishigaki et al. Simultaneous surfactant determination (2020) doi:10.2174/2213240606666190701103503


• ... (鏇村氭枃鐚寮曠敤)

② 包涵體變復性的包涵體變性

稀釋復性：直接加入水或緩沖液，放置過夜，缺點是體積增加較大，變性劑稀釋速度太快，不易控制。目前稀釋法主要有一次稀釋、分段稀釋和連續稀釋三種方式。
透析復性：好處是不增加體積，通過逐漸降低外透液濃度來控制變性劑去除速度，有人稱易形成無活性蛋白質聚體，且不適合大規模操作，無法應用到生產規模。
超濾復性：在生產中較多的使用，規模較大，易於對透析速度進行控制，缺點是不適合樣品量較少的情況，且有些蛋白可能在超濾過程中不可逆的變性。
柱上復性：是最近研究較多並成功的在生產中應用的一種復性方法，包涵體蛋白變性後，在色譜柱上復性，大致可分成疏水柱復性及凝膠柱復性兩類。其中的凝膠柱復性均是用Sephacry1S-100或Superdex75 等分子篩填料，柱較長（40cm-100cm不等）。相比稀釋和透析兩種方法，色譜柱復性回收率高（高達90%以上）、快速、易放大，樣品稀釋倍數小（一般五倍左右）
高蛋白質濃度下的復性：通常有兩種方法，一是緩慢地連續或不連續地將變性蛋白加入到復性緩沖液中，使得蛋白質在加入過程中或加入階段之間有足夠的時間進行折疊復性；二是採用溫度跳躍式復性，即讓蛋白質先在低溫下折疊復性以減少蛋白質聚集的形成，當形成聚集體的中間體已經減少時，迅速提高溫度以促進蛋白質折疊復性。
此外，吸附法、反膠束法和雙水相萃取法等都可用蛋白質的復性。 復性是一個非常復雜的過程，除與蛋白質復性的過程式控制制相關外，還很大程度上與蛋白質本身的性質有關，有些蛋白非常容易復性，如牛胰RNA酶有12對二硫鍵，在較寬松的條件下復性效率可以達到95%以上，而有一些蛋白至今沒有發現能夠對其進行復性的方法如IL-11，很多蛋白的復性效率只有百分之零點幾，如在純化IL-2時以十二烷基硫酸鈉溶液中加入銅離子（0.05%SDS，7.5-30u mol/l CuCl2）的方法，25-37°C下反應3小時，再EDTA至1m mol/l終止反應，復性後的二聚體低於1%。[6]一般說來，蛋白質的復性效率在20%左右。
影響復性效率的因素
蛋白質的復性濃度：正確折疊的蛋白質的得率低通常是由於多肽鏈之間的聚集作用，蛋白質的濃度是使蛋白質聚集的主要因素，因而，一般濃度控制在0.1-1mg/ml；如果變性蛋白加入復性液中過快，容易形成絮狀沉澱，可能是蛋白重新凝聚的緣故。所以我們採用再水浴和磁力攪拌下，逐滴加入變性蛋白，使變性蛋白在復性液中始終處於低濃度狀態。
pH和溫度：復性緩沖液的pH值必須在7.0以上，這樣可以防止自由硫醇的質子化作用影響正確配對的二硫鍵的形成，過高或過低會降低復性效率，最適宜的復性pH值一般是8.0-9.0。
此外，影響復性效率的因素還有，變性劑的起始濃度和去除速度、氧化還原電勢、離子強度、共溶劑和其他添加劑的存在與否等。
提高包涵體蛋白的復性產率
氧化-還原轉換系統
對於含有二硫鍵的蛋白，復性過程應能夠促使二硫鍵形成。常用的方法有：空氣氧化法、使用氧化交換系統、混合硫化物法、谷胱甘肽再氧化法及DTT再氧化法.
最常用的氧化交換系統是GSH/GSSG,而cysteine/cystine、cysteamine/cystamine、DTT/GSSG、DTE/GSSG等也都有應用。氧化交換系統通過促使不正確形成的二硫鍵的快速交換反應提高了正確配對的二硫鍵的產率。通常使用1-3m mol/l還原型巰基試劑,還原型和氧化型巰基試劑的比例通常為10：1—5：1。
添加低分子化合物
低分子化合物自身並不能加速蛋白質的折疊，但可能通過破壞錯誤折疊中間體的穩定性，或增加折疊中間體和未折疊分子的可溶性來提高復性產率。如鹽酸胍、脲、烷基脲、以及碳酸醯胺類等，在非變性濃度下是很有效的促進劑。蛋白質的輔因子、配基或底物亦可起到很好的促折疊作用，如蛋白質的輔因子Zn2+或Cu2+可以穩定蛋白質的折疊中間體,從而防止了蛋白質的聚集，加入濃度大於0.4 mol/lTris緩沖液可提高包涵體蛋白質的折疊效率。濃度為0.4-0.6M L-Arg有助於增加復性中間產物的溶解度。成功的應用於很多蛋白如t-PA的復性中，可以抑制二聚體的形成。
PEG-NaSO4兩相法
用PEG和NaSO4作為成相劑,然後加入鹽酸胍，再把變性的還原的蛋白質溶液加入其中進行復性,但這種方法需復性的變性蛋白質的濃度必須低。
分子伴侶和折疊酶等
這類蛋白質主要包括硫氧還蛋白二硫鍵異構酶、肽醯-輔氨醯順反異構酶、分子伴侶、FK506結合蛋白、Cyclophilin等。分子伴侶和折疊酶等不僅可在細胞內調節蛋白質的折疊和聚集過程的平衡，而且可在體外促進蛋白質的折疊復性。
其它
提高復性率的策略還有許多，如：非離子型去垢劑，尤其是離子型或兩性離子去垢劑或表面活性劑CHAPs、Triton X-100、磷脂、laury lmaltosid、Sarkosyl等對蛋白質復性有促進作用；待折疊復性的蛋白質的抗體可有效協助其復性；多聚離子化合物如肝素不僅可以促進蛋白質的作用，而且具有穩定天然蛋白質的作用。[10] 根據具體的蛋白性質和需要，可以從生化、免疫、物理性質等方面對蛋白質的復性效率進行檢測。
凝膠電泳：一般可以用非變性的聚丙烯醯胺凝膠電泳可以檢測變性和天然狀態的蛋白質，或用非還原的聚丙烯醯胺電泳檢測有二硫鍵的蛋白復性後二硫鍵的配對情況。
光譜學方法：可以用紫外差光譜、熒光光譜、圓二色性光譜（CD）等，利用兩種狀態下的光譜學特徵進行復性情況的檢測，但一般只用於復性研究中的過程檢測。
色譜方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由於兩種狀態的蛋白色譜行為不同，
生物學活性及比活測定：一般用細胞方法或生化方法進行測定，較好的反映了復性蛋白的活性，值得注意的是，不同的測活方法測得的結果不同，而且常常不能完全反映體內活性。
黏度和濁度測定：復性後的蛋白溶解度增加，變性狀態時由於疏水殘基暴露，一般水溶性很差，大多形成可見的沉澱析出。
免疫學方法：如ELISA、WESTERN等，特別是對結構決定簇的抗體檢驗，比較真實的反映了蛋白質的折疊狀態。
在正常的生理條件下，組成蛋白質的多肽鏈都能以獨特的方式進行折疊，形成自己特有的空間結構，以執行某一些生命活動。當外界環境改變時，可能造成基因突變和蛋白質序列改變，錯誤剪接和運輸，錯誤折疊和異常聚積，形成對機體有害的反應，引起構象病的發生和無生物活性、不可溶的包涵體形成。目前對包涵體形成和復性過程中發生聚集的機制尚不清楚，許多已建立的高效復性方法是在反復實驗和優化的基礎上建立的，且沒有普遍性，但從這許許多多的個例中發現了一些規律：如聚集的發生是由鏈間的疏水相互作用介導、聚集具有相對特異性、折疊中間體可能具有不同的作用等等，並利用這些知識建立了一些重組蛋白質高效復興性的方法。相信隨著結構生物學、生物信息學、蛋白質工程學及相關新技術和新設備的發展和完善，在不久的將來，預測和設計最佳復性方案將成為可能。