採用陽離子交換樹脂分離核苷酸

⑴ 吸附薄層層析與分配，離子交換薄層層分析的區別

離子交換層析（Ion Exchange Chromatography簡稱為IEC）是以離子交換劑為固定相，依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。1848年，Thompson等人在研究土壤鹼性物質交換過程中發現離子交換現象。本世紀40年代，出現了具有穩定交換特性的聚苯乙烯離子交換樹脂。50年代，離子交換層析進入生物化學領域，應用於氨基酸的分析。目前離子交換層析仍是生物化學領域中常用的一種層析方法，廣泛的應用於各種生化物質如氨基酸、蛋白、糖類、核苷酸等的分離純化。常用的離子交換劑有：離子交換纖維素、離子交換葡聚糖和離子交換樹脂 。
離子交換層析中，基質是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂；而帶有負電荷的稱之陽離子樹脂。離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化。由於蛋白質也有等電點，當蛋白質處於不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質，所以這類蛋白質被留在柱子上，然後通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將
吸附在柱子上的蛋白質洗脫下來。結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質，結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。
⒈離子交換劑預處理和裝柱對於離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉澱的顆粒，以保證有較好的均勻度，對於已溶脹好的產品則不必經這一步驟。溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀鹼處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用「鹼-酸-鹼」處理，使最終轉為-OH-型或鹽型交換劑；對於陽離子交換劑則用「酸-鹼-酸」處理，使最終轉為-H-型交換劑。洗滌好的纖維素使用前必須平衡至所需的pH和離子強度。已平衡的交換劑在裝柱前還要減壓除氣泡。為了避免顆粒大小不等的交換劑在自然沉降時分層，要適當加壓裝柱，同時使柱床壓緊，減少死體積，有利於解析度的提高。柱子裝好後再用起始緩沖液淋洗，直至達到充分平衡方可使用。
⒉加樣與洗脫加樣：層析所用的樣品應與起始緩沖液有相同的pH和離子強度，所選定的pH值應落在交換劑與被結合物有相反電荷的范圍，同時要注意離子強度應低，可用透析、凝膠過濾或稀釋法達此目的。樣品中的不溶物應在透析後或凝膠過濾前，以離心法除去。為了達到滿意的分離效果，上樣量要適當，不要超過柱的負荷能力。柱的負荷能力可用交換容量來推算，通常上樣量為交換劑交換總量的1％-5％。
洗脫：已結合樣品的離子交換前，可通過改變溶液的pH或改變離子強度的方法將結合物洗脫，也可同時改變pH與離子強度。為了使復雜的組份分離完全，往往需要逐步改變pH或離子強度，其中最簡單的方法是階段洗脫法，即分次將不同pH與離子強度的溶液加入，使不同成分逐步洗脫。由於這種洗脫pH與離子強度的變化大，使許多洗脫體積相近的成分同時洗脫，純度較差，不適宜精細的分離。最好的洗脫方法是連續梯度洗脫，洗脫裝置見圖16-6.兩個容器放於同一水平上，第一個容器盛有一定pH的緩沖液，第二個容器含有高鹽濃度或不同pH的緩沖液，兩容器連通，第一個容器與柱相連，當溶液由第一容器流入柱時，第二容器中的溶液就會自動來補充，經攪拌與第一容器的溶液相混合，這樣流入柱中的緩沖液的洗脫能力即成梯度變化。第一容器中任何時間的濃度都可用下式進行計算：
C＝C2－（C2－C1）（1－V）A2/A1
式中A1、A2分別代表兩容器的截面積：C1、C2分別表示容器中溶液的濃度；V為流出體積對總體積之比。當A1＝A2時為線性梯度，當A1＞A2時為凹形梯度，A1＞A2時為凸形梯度。
洗脫時應滿足以下要求：①洗脫液體積應足夠大，一般要幾十倍於床體積，從而使分離的各峰不致於太擁擠。②梯度的上限要足夠高，使緊密吸附的物質能被洗脫下來。③梯度不要上升太快，要恰好使移動的區帶在快到柱末端時達到解吸狀態。目的物的過早解吸，會引起區帶擴散；而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。
⒊洗脫餾份的分析按一定體積（5-10ml/管）收集的洗脫液可逐管進行測定，得到層析圖譜。依實驗目的的不同，可採用適宜的檢測方法（生物活性測定、免疫學測定等）確定圖譜中目的物的位置，並回收目的物。
⒋離子交換劑的再生與保存離子交換劑可在柱上再生。如離子交換纖維素可用2mol/：NaCl淋洗柱，若有強吸附物則可用0.1mol/LNaOH洗柱；若有脂溶性物質則可用非離子型去污劑洗柱後再生，也可用乙醇洗滌，其順序為：0.5mol/LNaOH-水-乙醇-水-20％NaOH-水。保存離子交換劑時要加防腐劑。對陰離子交換劑宜用0.002％氯已定（洗必泰），陽離子交換劑可用乙基硫柳汞（0.005％）。有些產品建立用0.02％疊氮鈉。
⒌離子交換層析的應用離子交換層析技術已廣泛用於各學科領域。在生物化學及臨床生化檢驗中主要用於分離氨基酸、多肽及蛋白質，也可用於分離核酸、核苷酸及其它帶電荷的生物分子。

概念
層析是「色層分析」的簡稱。利用各組分物理性質的不同，將多組分混合物進行分離及測定的方法。有吸附層析、分配層析兩種。一般用於有機化合物、金屬離子、氨基酸等的分析。
層析（chromatography）利用物質在固定相與流動相之間不同的分配比例，達到分離目的的技術。層析對生物大分子如蛋白質和核酸等復雜的有機物的混合物的分離分析有極高的分辨力。
[編輯本段]語源學
chrome意為「色彩」，graphy源自希臘文，意為「寫」。色譜為層析的同義語，都是從英語chromatography譯來的。
層析（色譜） chromatograpby
在把微細分散的固體或是附著於固體表面的液體作為固定相，把液體（與上述液體不相混合的）或氣體作為移動相的系統中，使試料混合物中的各成分邊保持向兩相分布的平衡狀態邊移動，利用各成分對固定相親和力不同所引起的移動速度差，將它們彼此分離開的定性與定量分析方法，稱為層析，亦稱色譜法。根據移動相種類的不同，分為液體層析、氣體層析二種。用作固定相的有矽膠、活性炭、氧化鋁、離子交換樹脂、離子交換纖維等，或是在硅藻土和纖維素那樣的無活性的載體上附著適當的液體，也可使用其他物質。將作為固定相的微細粉末狀物質裝入細長形圓筒中進行的層析稱為柱層析（column chromatogra-phy），在玻璃板上塗上一層薄而均的物質作為固定相的稱為薄層層析（thin-layer chromatography），後者可與用濾紙作為固定相的紙上層析進行同樣的分析，即在固定相的一端，點上微量試料，在密閉容器中，使移動相（液體）從此端滲入，移動接近另一端。通過這種展開操作，各成分呈斑點狀移動到各自的位置上，再根據Rf值的測定進行鑒定。當斑點不易為肉眼觀察時，可利用適當的顯色劑，或通過紫外燈下產生熒光的方法進行觀察。也可採用在第一種移動相展開後再用另一移動相進行展開（這時的展開方向應與原方向垂直），使各成分分離完全的雙相層析（two-dimensional chromatography）。分離後，將斑點位置的固定相切取下來，把其中含有來自試料的物質提取進行定量分析。但為制備與定量，柱層析則更為適宜。在柱層析中，移動相從加入試料的一端展開到達另一端後，繼續展開使各成分和移動相一起向柱外分別溶出，這就是廣泛使用的所謂洗提層析（elution chromatography）。層析根據固定相與溶質（試料）間親和力的差異分為吸附型、分配型、離子交換型（離子交換層析）等三種類型。但這並不是很嚴格的，有時常見到其中間類型。此外，近來也應用親和層析，即將與基質類似的化合物（通常為共價鍵）結合到固定相上，再利用其特異的親和性沉澱與其對應的特定的酶或蛋白質。
[編輯本段]類別
◆按層析的機理劃分：
吸附層析、分配層析、離子交換層析、凝膠過濾層析、親和層析等。
吸附層析：利用吸附劑表面對不同組分吸附性能的差異，達到分離鑒定的目的。
分配層析：利用不同組分在流動相和固定相之間的分配系數不同，使之分離。
離子交換層析：利用不同組分對離子交換劑親和力的不同。
凝膠層析：利用某些凝膠對於不同分子大小的組分阻滯作用的不同。
◆按流動相與固定相的不同劃分：
氣相層析、液相層析。這兩大類層析是以流動相不同來劃分的。如同時區分流動相和固定相，劃分為：氣固層析、氣液層析、液固層析和液液層析等。
◆按操作形式劃分：
柱層析、紙層析、薄層層析、高效液相層析等。
柱層析：將固定相裝於柱內，使樣品沿一個方向移動而達到分離。
紙層析：用濾紙做液體的載體，點樣後，用流動相展開，以達到分離鑒定的目的。
薄層層析：將適當粒度的吸附劑鋪成薄層，以紙層析類似的方法進行物質的分離和鑒定。
以上劃分無嚴格界限，有些名稱相互交叉，如親和層析應屬於一種特殊的吸附層析，紙層析是一種分配層析，柱層析可做各種層析。
[編輯本段]基本原理
層析須在兩相系統間進行。一相是固定相，需支持物，是固體或液體。另一相為流動相，是液體或氣體。當流動相流經固定相時，被分離物質在兩相間的分配，由平衡狀態到失去平衡到又恢復平衡，即不斷經歷吸附和解吸的過程。隨著流動相不斷向前流動，被分離物質間出現向前移動的速率差異，由開始的單一區帶逐漸分離出許多區帶，這個過程叫展層。
系數K是物質在兩相中的濃度比。K值大，則在固定相中吸附牢，K值小吸附差。各物質間的K值差別大，則易被分離。不同類型層析的K值含義不同，可視為吸附平衡常數，分配常數或離子交換常數等。
研究層析現象而發展的塔板理論，與有機化學實驗中的分餾法原理有些相似。被分餾的有機溶劑在分餾柱內的填充物上形成許多熱交換層，從而把低沸點溶劑先分餾出來，達到純化的目的。在層析時用理論塔板數n來衡量層析效能。
tR為物質在層析柱上的保留時間，W為洗脫下來的物質峰形的寬度。n值愈大表示層析柱的效能愈高。如用理論塔板高度H表示，則包含了層析柱長度的因子。
式中L為層析柱的柱長。H值越大，則柱效越低。
此外影響層析分離效果的還有渦流擴散、縱向擴散和傳質阻抗等因素。因此選擇層析固定相支持物的粒度、均勻度等物理性能，流動相的層析系統和溫度等都是做好層析的關鍵。
[編輯本段]幾種常用的層析
◆吸附層析
吸附劑的吸附力強弱，是由能否有效地接受或供給電子，或提供和接受活潑氫來決定。被吸附物的化學結構如與吸附劑有相似的電子特性，吸附就更牢固。常用吸附劑的吸附力的強弱順序為：活性炭、氧化鋁、硅膠、氧化鎂、碳酸鈣、磷酸鈣、石膏、纖維素、澱粉和糖等。以活性炭的吸附力最強。吸附劑在使用前須先用加熱脫水等方法活化。大多數吸附劑遇水即鈍化，因此吸附層析大多用於能溶於有機溶劑的有機化合物的分離，較少用於無機化合物。洗脫溶劑的解析能力的強弱順序是：醋酸、水、甲醇、乙醇、丙酮、乙酸乙酯、醚、氯仿、苯、四氯化碳和己烷等。為了能得到較好的分離效果，常用兩種或數種不同強度的溶劑按一定比例混合，得到合適洗脫能力的溶劑系統，以獲得最佳分離效果。
◆分配層析
在支持物上形成部分互溶的兩相系統。一般是水相和有機溶劑相。常用支持物是硅膠、纖維素和澱粉等，這些親水物質能儲留相當量的水。被分離物質在兩相中都能溶解，但分配比率不同，展層時就會形成以不同速度向前移動的區帶。
◆離子交換層析
支持物是人工交聯的帶有能解離基團的有機高分子，如離子交換樹脂、離子交換纖維素、離子交換凝膠等。帶陽離子基團的，如磺酸基（—SO3H）、羧甲基（—CH2COOH）和磷酸基等為陽離子交換劑。帶陰離子基團的，如DEAE—（二乙基胺乙基）和QAE—（四級胺乙基）等為陰離子交換劑。離子交換層析只適用於能在水中解離的化合物，包括有機物和無機物。對於蛋白質、核酸、氨基酸及核苷酸的分離分析有極好的分辨力。離子交換基團在水溶液中解離後，能吸引水中被分離物的離子，各種物質在離子交換劑上的離子濃度與周圍溶液的離子濃度保持平衡狀態，各種離子有不同的交換常數，K值愈高，被吸附愈牢。洗脫時，增加溶液的離子強度，如改變pH，增加鹽濃度，離子被取代而解吸下來。洗脫過程中，按K值不同，分成不同的區帶。
◆凝膠過濾層析
支持物是人工合成的交聯高聚物，在水中膨脹後成為凝膠。凝膠內為內水層，凝膠周圍的水為外水層。控制交聯度以形成不同孔徑的網狀結構。交聯度小的孔徑大，交聯度大的孔徑小。凝膠只允許被分離物質中小於孔徑的分子進入，大於孔徑的分子被排斥在外水層，最先被洗脫下來。而進入孔徑的分子也按分子量大小大致分離成不同的區帶。選擇不同規格的凝膠，可把一個混合物按分子量的差異分成不同的組分。這種方法曾被稱為分子篩。目前常用的凝膠商品有：葡聚糖凝膠（sephadex）、聚丙烯醯胺凝膠（bio-gel）、瓊脂糖凝膠（sepharose）和聚苯乙烯凝膠（styragel）等。
◆親和層析
在一對有專一的相互作用的物質中，把其中之一聯結在支持物上，用於純化相對的另一物質。常見的親和對如：酶和抑制劑，抗原和抗體，激素和受體等。支持物為瓊脂糖或纖維素等。
◆氣相層析
屬於分配層析或吸附層析，僅適用於分析分離揮發性和低揮發性物質。固定相是在惰性支持物（如磨細的耐火磚）上覆蓋一層高沸點液體，如硅油、高沸點石蠟和油脂、環氧類聚合物。外塗層約為支持物重量的20％。分析時操作溫度范圍，一般從室溫到200℃。特殊的層析柱能達到500℃。流動相常用氦、氬或氮為展層氣體。氣相層析分離的區帶十分清晰，是由於揮發性物質在兩相間能很快達到平衡，所需分析時間大為縮短，一般為數分鍾至10餘分鍾。檢測記錄系統繪出的各峰是測定流出氣體電阻變化的結果，因而測定樣品量可到微克和毫微克水平。具有快速、靈敏和微量的優點。氣相層析也能用於分離制備樣品，但需增加將流出氣體通過冷凍將分離物回收的裝置。
◆紙層析
以濾紙為支持物的分配層析。組成濾紙的纖維素是親水物質，能形成水相和展層溶劑的兩相系統，被分離物質在兩相中的分配保持平衡關系。紙層析用於分析簡單的混合物時可做單向層析。對於復雜的混合物，可做雙向層析。1944年A．J．P．馬丁第一次用紙層析分析氨基酸，得到很好的分離效果，開創了近代層析的發展和應用的新局面。70年代以後，紙層析已逐漸為其他分辨力更高、速度更快和更微量化的新方法，如離子交換層析、薄層層析、高效液相層析等所代替。
◆薄層層析
在玻璃片、金屬箔或塑料片上鋪上一層約1～2毫米的支持物，如纖維素、硅膠、離子交換劑、氧化鋁或聚醯胺等，根據需要做不同類型的層析。聚醯胺薄膜是一種特異的薄層，將尼龍溶解於濃甲酸中，塗在滌綸片基上，當甲酸揮發後，在滌綸片基上形成一層多孔的薄膜，其分辨力超過了用尼龍粉鋪成的薄層。薄層層析較紙層析優越在於分辨高，展層時間短。例如用紙層析做氨基酸分析，往往需要兩天時間，而且對層析條件要求嚴格，不易得到滿意的分離效果。如用薄層層析做，一般約需半小時，分離效果更好。薄層層析一般用於定性分析。也能用於定量分析和制備樣品。
◆高效液相層析（又名高壓液相色譜）
70年代新發展的層析法。其特點是：用高壓輸液泵，壓強最高可達5000psi（相當於34個標准大氣壓）。用直徑約3～10微米的超細支持物裝填均勻的不銹鋼柱。常用的支持物是在玻璃小珠上塗一層1～2微米的二氧化硅，經硫醯氯反應生成Si—Cl，進一步連接疏水的烷基，如Si—C18H37，或陽離子交換基團—Si（CH2）n—C6H4SO3H，或陰離子交換基團—Si（CH2）nNH2。這種支持物能承受很高的壓力，化學性能穩定。用不同類型支持物的HPLC，可做吸附層析、離子交換層析和凝膠過濾層析。其分析微量化可達10-10克水平。但用於制備，可以純化上克的樣品。展層時間短，一般需幾分鍾到10餘分鍾。其分析速度、精確度可與氣相層析媲美。HPLC適於分析分離不揮發和極性物質。而氣相層析只適用於揮發性物質，兩者互為補充，都是目前最為理想的層析法。HPLC配有程序控制洗脫溶劑的梯度混合儀，數據處理的積分儀和記錄儀等電子系統，成為一種先進的分析儀器，在生物化學、化學、醫葯學和環境科學的研究中發揮了重要作用。
◆反相層析
在吸附層析中，高極性物質在層析柱上吸附較牢，洗脫時發生拖尾現象和保留時間長的問題。如果在支持物上塗上一層高碳原子的疏水性強的烷烴類，洗脫液用極性強的溶劑，如甲醇和水的混合物。則被分離樣品中的極性強的物質不被吸附，最先洗下來，得到較好的分離效果。這種層析法與普通的吸附層析法相反，故稱為反相層析。目前用HPLC做反相層析常用的ODS柱，即在支持物的表面上連接了C18H37Si—基團。
◆同系層析
在核酸分析中，將樣品經核酸酶部分裂解成不同長度的核苷酸片段，用同位素標記後，在DEAE纖維素薄層上分離，用含有未標記的相同的核苷酸片段作展層溶劑，這樣，未標記的核苷酸把標記過的核苷酸推進，使按分子量大小不同把標記核苷酸片段，按由小到大的次序排列，達到分離的目的。於是把這種層析法稱為同系層析。同系層析和電泳相結合曾用於寡核苷酸的順序分析。
紙層析是層析法的一種,要了解紙層法還得從層析法開始.層析法又稱色層分析法或色譜法（Chromatography），是一種基於被分離物質的物理、化學及生物學特性的不同，使它們在某種基質中移動速度不同而進行分離和分析的方法。例如：我們利用物質在溶解度、吸附能力、立體化學特性及分子的大小、帶電情況及離子交換、親和力的大小及特異的生物學反應等方面的差異，使其在流動相與固定相之間的分配系數（或稱分配常數）不同，達到彼此分離的目的。
層析法的最大特點是分離效率高，它能分離各種性質極相類似的物質。而且它既可以用於少量物質的分析鑒定，又可用於大量物質的分離純化制備。因此，作為一種重要的分析分離手段與方法，它廣泛地應用於科學研究與工業生產上。現在，它在石油、化工、醫葯衛生、生物科學、環境科學、農業科學等領域都發揮著十分重要的作用。
層析根據固定相基質的形式分類，層析可以分為紙層析、薄層層析和柱層析。其中紙層析是指以濾紙作為基質的層析。

⑵ 汪猷的人物成就

汪猷字君謀，1910年6月7日出生於杭州書香門第之家。父親汪知非是清末秀才，年輕時深受西方科學技術和孫中山的革命思想影響，遂棄功名仕途，在浙江從事測量和鹽務等工作。父母先後於1928年和1930年病故。1941年汪猷與協和醫學院兒科助教李季明女士結婚，夫妻感情甚篤。
汪猷聰穎好學，從小深受父親影響，喜愛自然科學。1921年考入浙江省立甲種工業學校（浙江大學前身之一），就讀於應用化學系，從此汪猷與化學結下了不解之緣。1927年考入金陵大學工業化學系。1931年畢業，獲理學士學位。由於他歷年學習成績優秀，獲得斐托飛（φτφ）學會金鑰匙獎的榮譽。畢業後由學校推薦到北平協和醫學院作研究生後轉作研究員。師從我國著名生物化學家吳憲，研究性激素的生物化學。他首先使用了問世不久的瓦堡微量呼吸器測定男性激素對正常鼠和閹鼠的各部器官的影響。在名師指點下，汪猷的研究才華脫穎而出，發表了4篇論文，深得吳憲的器重。1935年8月，汪猷作為中國生理學會代表團成員與吳憲等參加了在莫斯科舉行的第十五屆國際生理學大會。這是汪猷第一次去國外參加大型國際學術會議。他見到了不少仰慕已久的國際生理、生化界大師，如巴甫洛夫和胰島素發現者班丁（F．G．Banting）等。這使他下決心奮發圖強，日後希躋身於國際著名學者之列。大會結束後，汪猷赴德國慕尼黑大學化學研究所，在著名化學家、諾貝爾獎獲得者維蘭德（H．Wieland）指導下當研究生。
在維蘭德及其助手唐納（E．Dane）指導下，汪猷從事不飽和膽酸和甾醇的合成研究。找到了甾環內引進共軛雙烯的改進方法，合成了膽甾雙烯酮和膽甾雙烯醇。1937年冬，汪猷獲慕尼黑大學最優科學博士學位。1938年秋，他又去海德堡威廉皇家科學院醫學研究院化學研究所任客籍研究員。在著名化學家、諾貝爾獎金獲得者庫恩（R．Kuhn）指導下進行藏紅素化學的研究。合成了十四乙醯藏紅素。這是當時分子量最大的有機化合物。在國內外名師和著名學術機構的優良學風的薰陶和嚴格訓練下，汪猷養成了嚴肅、嚴謹的學風和勇於創新的精神，這對他以後的事業產生了深遠的影響。
1939年春，汪猷離開德國轉赴英國。在倫敦密特瑟克斯醫學院考陶爾生化研究所陶慈（E．C．Dodds）的研究室任客籍研究員，從事雌性激素類似物的化學合成研究。當時歐洲戰雲密布，我國正遭受日本法西斯鐵蹄的蹂躪。懷著振興祖國科學事業的強烈願望，汪猷毅然放棄國外優越的研究條件和物質生活，於1939年8月回國。在協和醫學院先後任講師、助教授等職。除講課外，他的大部分時間繼續在吳憲指導下從事甾族性激素的化學研究，包括孕婦尿中甾三醇葡萄糖苷排泄量的測定和中葯當歸有效成分及葯理作用研究等。他在與婦產科醫生合作的一項研究中發現了懷雙胞胎的孕婦尿中甾二醇葡萄糖排泄量特別高。珍珠港事變之後，日本侵略軍於1942年1月佔領協和醫學院，研究設備、資料和研究記錄、樣品全被日本侵略軍搜掠一空。教授、醫生、學生都被迫離開實驗室，離開醫學院。
中國抗生素事業的開拓者
1942年4月，汪猷進入上海丙康葯廠，擔任廠長和研究室主任。這是一家小葯廠，主要生產針劑、止咳潤喉糖之類。當時上海淪陷、視聽閉塞。1944年他偶然獲悉國外發現了一種從黴菌里培養出來的抗生素，激起了他對新學科的研究渴望。他刻苦學習微生物學、發酵等方面的知識，決心在中國開拓抗生素研究的道路。汪猷對霉爛的桔子表面的爛毛發生了興趣。經過幾年研究試驗，克服種種困難，終於分離得到了一種抗菌物質桔黴素。1947年汪猷的論文「桔黴素」發表於美國《科學》雜志。國內「大公報」等報紙報道了他研究成功桔黴素的消息。美國一家通訊社也做了報道。但是汪猷的才華和研究成果並未得到葯廠廠主的賞識，汪猷於1947年8月憤然離開丙康葯廠。
1947年9月汪猷借用中央研究院醫學研究所籌備處的兩間原病理和屍體解剖實驗室，同兩位自願從丙康葯廠退職跟隨他的助手繼續進行桔黴素的研究。當時他本人沒有工資和報酬，汪猷一家的生活十分拮據，但他對清貧甘之如飴，刻苦努力，埋頭研究。在助手的合作下，桔黴素的化學及其抗菌作用的研究未曾中斷。後得到林可勝、馮德培的支持被聘為醫學研究所籌備處的研究員。這一時期汪猷發表了「抗生素桔黴素」、「雙氫桔黴素」、「桔黴素及其衍生物的結構和抗菌活力」等6篇論文。中華人民共和國建立後，成立了中國科學院，汪猷被聘為中國科學院生理生化研究所研究員。1952年底調入有機化學研究所任研究員並擔任副所長。由於黨和政府十分重視科學研究事業的發展，使他得以對桔黴素的結構、合成、生物作用、毒性和葯理等方面進行系統的研究，終於取得了豐碩的成果。發表了「桔黴素」、「桔黴素駢醇」等10餘篇論文。雖然由於桔黴素的毒性，未能用於臨床，但是40年代汪猷在如此簡陋、困難的條件下，對桔黴素開始了系統的研究，成為中國抗生素研究的開拓者。他的這一研究成果獲得中國科學院1956年度科學獎金三等獎。 50年代是抗生素研究的鼎盛時期。隨著醫療保健事業的發展，迫切需要大力開展抗生素的研究。汪猷是積極的倡導者和組織者。1952年汪猷在中國科學院領導下曾參加組織召開我國首次抗生素工作會議。以後又參加組織了上海抗生素研究工作委員會和全國抗生素研究工作委員會。1955年在北京主持了國際性的抗生素學術會議。這些活動都為推動我國抗生素的研究和生產起到了一定的作用。與此同時，他與合作者於1953年開始研究鏈黴素及金黴素的分離、提純以及結構和合成化學。曾發表「有關鏈黴素菌株的選育、發酵及提取的研究」、「自L－雙氫鏈糖酸內脂合成L－雙氫鏈糖」、「金黴素的抗生作用機制」等近10篇論文。他和助手們在50年代即合成了幾種性能優良的陽離子交換樹脂，用於提取發酵液中鏈黴素與鹼性抗生素。他們大膽地提出用離子交換樹脂法代替當時使用的活性炭的分離工藝，並多次深入生產現場，指導和幫助解決生產工藝問題，汪猷不僅重視生產中的實際應用課題，也不忽視學科中的基礎理論研究。他和同事們在研究鏈黴素的立體化學中糾正了美國著名碳水化合物專家、鏈黴素結構的測定者沃爾弗浪姆（M．L．Walfrom）等提出的鏈雙糖胺β苷鍵的結論，確證為α苷鍵。這項成果被選入上海1960年科研成果論文集。
中國生物有機化學的先驅者之一
中華人民共和國成立後，由於國家對科學事業的重視，大為激發了汪猷對振興祖國科學事業的熱情，他的研究生涯進入了黃金時期。60年代開始，汪猷先後開展了生命基礎物質——蛋白質、核酸、多糖的研究以及有機催化、生物催化、石油發酵和單細胞蛋白生產，模擬酶化學，生物合成等研究。他的研究活動幾乎包括了這一時期我國生物有機化學的全部內容。這些研究都以出色的成果載入了我國有機化學發展史冊。
1965年9月，我國在世界上首次人工合成了結晶牛胰島素，它是第一個全合成的、與天然產物性質完全相同的、有生物活性的蛋白質。胰島素的分子組成和結構是1955年英國科學家桑格爾（F．Sanger）闡明的。雖然此後各國科學家都開展了胰島素人工合成的探索，但由於胰島素結構復雜、合成工作量繁復浩大，直到1958年英國《自然》雜志還斷言「人工合成胰島素在相當長時間里未必會實現。」可是，在這場世界性的科學競賽中，中國科學家領先了，我國得到了人工合成的結晶的牛胰島素。這一舉世矚目的成果博得了國際科學界的高度評價。結晶牛胰島素的全合成是由中國科學院生物化學研究所、上海有機化學研究所和北京大學部分科學家合作進行的。王應睞、汪猷、邢其毅等負責領導組織這項研究工作。汪猷還直接參加了牛胰島素A鏈和C14標記的牛胰島素的全合成等研究項目。對合成方案、產物的鑒定分析標准都提出了明確具體的要求。汪猷與合作者發表了「肽的研究」、「結晶牛胰島素的全合成」、「牛胰島素A鏈的合成及其與天然B鏈組合成結晶牛胰島素」、「C14標記牛胰島素A鏈和C14標記牛胰島素的合成」等論文。胰島素合成成功，推動了我國多肽激素醫葯工業的建立和生化試劑工業的發展。
自1968年開始至1981年完成的酵母丙氨酸轉移核糖核酸的全合成是繼胰島素全合成以後我國自然科學基礎研究中又一成就，是我國生物化學及有機化學研究史上又一項嶄新的科研成果，也是汪猷科研生涯中耀眼的篇章。1967年4月在北京由當時國家科委主任聶榮臻元帥主持召開有關基礎理論研究的座談會上，汪猷首先提出把核酸化學提到日程上來，作為下一步的攻堅目標。這一建議得到了與會科學家的贊同和聶榮臻元帥的支持。經過醞釀與調查，1968年中國科學院正式下達任務，把「人工合成酵母丙氨酸轉移核糖核酸」列為重大科研項目，組織了中國科學院上海生物化學研究所、上海細胞研究所、上海有機化學研究所、生物物理研究所、北京大學、上海化學試劑二廠等單位，前後100餘位科技人員從事這項研究。酵母丙氨酸轉移核糖核酸分子量在2．6萬道爾頓以上，是由76個核苷酸（其中有4種常見的核苷酸、7種修飾的核苷酸）通過磷酸二酯鍵連接而成的生物大分子。汪猷是協作組副組長，他和協作組組長王應睞及協作組領導成員王德寶等對這項高難度研究進行精心規劃。經過13年的艱苦奮戰，終於在1981年11月完成了酵母丙氨酸轉移核糖核酸的全合成。這是世界上第一個人工合成的含有全部修飾核糖核苷酸的並具有接受丙氨酸、參與蛋白質生物合成等生物活性的丙氨酸轉移核糖核酸。這項研究使我國在生命基礎物質的研究上步入了新的階段，且為國家培養了一支從事核酸化學和核酸生物化學的研究隊伍。為我國的基因工程、核酸的工業生產、核苷類抗癌葯物的研究與生產奠定了基礎。汪猷與合作者發表了「酵母丙氨酸轉移核糖核酸的全合成」、「核酸化學研究」、「酵母丙氨酸轉移核糖核酸3′－半分子（36—76）的合成」、「生物學上有趣的天然大分子的合成研究」、「多核苷酸合成的研究」等多篇論文。汪猷還在國際核酸化學會議、中德核酸蛋白質學術討論會及中美天然產物化學討論會上做了學術報告。盡管他工作繁忙，但對此項工作的指導十分具體、細致。他提出並成功地將羧醯咪唑應用於核糖核酸的醯化反應，使核酸化學合成中單體的保護方法的研究獲得了進展。隨後他又應用31P核磁共振和計算機技術進行羧醯咪唑醯化機制和反應動力學的研究並取得了成果，發表了「在寡聚核糖核苷酸合成中偏磷酸酯在TPS或DCC激活核苷酸的反應中的作用」、「N苯甲醯咪唑與核糖核苷酸的反應機制」、「用31PNMR法研究核糖核酸酶A水解核酸的機制」等論文。
在進行酵母丙氨酸轉移核糖核酸的人工合成研究的同時，汪猷還承擔了另一項重大科研項目——天花粉蛋白的化學研究。天花粉是我國特有的引產中葯，宋代已有記載。1966年底有機化學研究所的科研人員開始從事這方面研究。1972年汪猷在國家科委的一次科研規劃會議上，建議將天花粉的研究列為中國科學院重點課題。他認為這項基礎理論研究，既有重大的學術意義，又有明確的應用前景。自1978年開始，汪猷參加和直接指導了對天花粉有效成分天花粉蛋白的一級結構的測定，並與協作單位共同完成了二級結構與空間結構的初步測定。這是完全由我國化學家和物理化學家完成分離、提純並測定一級及空間結構的第一個蛋白質。當汪猷將這一研究成果在1985年國際純粹與應用化學聯合會（IUPAC）葯用天然產物有機化學討論會上演講時，受到與會科學家的熱烈歡迎和高度評價。他曾與合作者發表了「天花粉的科學評價—歷史，化學與應用」等多篇論文，並主編了《天花粉蛋白》一書。 汪猷在多糖化學研究方面也有建樹，最突出的成就是與屠傳忠等共同研製成功高效、安全的新型代血漿（即血管擴張劑）——羧甲基糖澱粉。這是我國獨創的代血漿，和國際上廣泛應用的代血漿——右旋糖苷比較效果相同，但具有原料易得、工藝簡便等優點，已在臨床上廣泛應用。1979年英國《自然》雜志有一篇評論高分子代血漿的文章中曾提及中國有不少成果是「重復西方專利資料」，但這項成果則是「原始的」（首創性的）。外國學者到上海有機化學所參觀時，至今仍對這個項目很感興趣。值得一提的是，當初代血漿問世後，需進行健康人安全試驗，汪猷是志願受試的首批報名者之一。
60年代初，汪猷提出開展有機催化和生物催化的基礎研究。汪猷和王大琛從事的生物催化研究，迅速取得了成果並顯露了應用前景——石油微生物轉化。汪猷敏銳地意識到這項研究對國民經濟尤其是對農牧業的重要意義，遂不失時機地把這項研究轉向應用基礎研究，把實驗室研究成果擴大到中試和設計試生產，組織協調各項應用試驗。汪猷是我國石油發酵生產單細胞蛋白研究的開創者。曾發表「石蠟油微生物氧化產物支鏈九烷酸和十二烷酸研究的初步報告」、「石蠟油微生物氧化產物羥基羥酸研究的初步報告」、「分枝桿菌石蠟油發酵液中的支鏈脂肪酸」等論文。汪猷還在1973年維也納聯合國工業發展組織會議和1981年巴黎單細胞蛋白國際會議上分別宣讀了「關於石油蛋白作為新飼料的若干問題」和「中國正構烷烴酵母作為食物的進一步研究」等論文。石油發酵生產的單細胞蛋白作為飼料的研究已通過國家鑒定。 汪猷在50年代後期負責並如期完成了國家急需的二個活性染料的剖析任務。在60年代負責完成了對高感光度高空偵察片中片基和增感染料剖析的軍工任務。1985年以來，汪猷領導開展了抗瘧葯青嵩有效成分青嵩素的生物合成研究。發表了論文「青嵩素的二維核磁共振研究」、「青嵩素的生物合成研究」、「青嵩素和青嵩素B生物合成中的關鍵中間體——青蒿酸」。1986年，在蛋白質化學和核酸化學研究的基礎上，汪猷組織人力開展了模擬酸化學的研究，已發表「具有合成核酸活性的多肽I．C－端去四肽和去六肽核糖核酸酶A及其水解和合成活性」等5篇論文。 汪猷的學術成就在國內外學術界享有很高的聲譽，受到了國家的嘉獎。其中有二項獲國家自然科學一等獎：人工全合成牛胰島素（1982年7月）及酵母丙氨酸轉移核糖核酸的人工全合成（1988年8月）；一項獲國家自然科學二等獎：天花粉蛋白的化學（1988年8月）；一項獲中國科學院自然科學三等獎（1956年1月）；以及多項全國科學大會獎（1978年）。
在半個多世紀的研究生涯中，汪猷始終站在有機化學發展的前沿，在生命基礎物質的研究以及其他天然產物化學的研究方面取得多項成就，為我國有機化學的發展做出貢獻。
為中國有機化學事業的發展再做貢獻
汪猷是我國有機化學家的傑出代表。這不僅由於他在有機化學研究工作中取得重大成就，還由於幾十年來他為國家培養、組織了一支訓練有素、學有所成，能承擔重大科研課題的隊伍，建設了有機化學研究基地。自1952年汪猷被調入中科院上海有機化學研究所後，相繼任副所長、代理所長、所長、名譽所長。他把全部精力傾注於有機化學研究所的成長和發展。畢生追求就是振興中國的有機化學事業，進而推向世界先進水平之列。
汪猷根據我國有機化學研究的實際狀況和有機化學發展的規律提出有機化學研究所體制、專業設置的「二經二緯二輔助」的方針，二經是有機合成化學和物理有機化學；二緯是天然有機化學和元素及金屬有機化學；二輔助是配合全所研究工作，建立分析化學實驗室和生物化學實驗室。隨著電子計算機技術的迅速發展，1973年汪猷又及時提出建立計算機化學實驗室。有機化學所有著雄厚的有機合成研究力量，但70年代前沒有一個專門的研究室從事物理有機化學的研究。1973年汪猷提出建立物理有機化學研究室，請擅長物理有機化學的蔣錫?出任室主任，組織從事有機化學中理論問題的研究。從研究所的體制上保證了基礎研究的比例。汪猷在執長有機化學所的數十年間，帶領全所人員積極承擔國家下達的應用研究課題的同時，鼓勵科研人員勇於進取，努力開展基礎性研究，勇於開拓新學科、新領域。汪猷先後主持領導了近10項基礎性研究課題，他也親自參加和組織了多項重大應用性課題，甚至是任務性研究。近40年來，有機化學研究所在基礎研究和應用研究方面都取得了豐碩成果，共發表研究論文2600多篇，獲得研究成果達300項。這些成就正是研究所穩定、健康發展的證明。
汪猷十分重視人才的培養。作為主管業務的所長，他深知建設一支具有真才實學、勇於探索的精兵強將對於科學事業的重要性，50年代開始，汪猷親自主持制訂全所科研人員的業務學習計劃，使他們較快地掌握了最新的有機化學基礎理論、分離技術、立體化學、譜學等知識。他還多次親自為本所專業外語及文獻閱讀輔導班、有機化學微量操作短訓班、有機化學實驗班、德文訓練班授課。1955年起招收研究生，至1965年汪猷共培養研究生7名，還培養了一批在職科技人員。汪猷注重培養學生的獨立工作能力、扎實的基礎知識和認真、嚴謹的研究風尚。1978年後，汪猷是國務院和中國科學院學位委員會委員，並親自負責指導研究所的研究生培養工作。80年代末，他不顧自己古稀高齡，兩次去新疆、一次去雲南考察，指導邊遠地區的科學事業，為當地有關研究所的研究方向、人才培養、儀器保養等作詳細指導，幫助他們解決一些研究上的難題。如新疆化學所在天然有機化學方面力量比較薄弱，在汪猷的支持下，有機化學研究所派出周維善、林國強赴疆進行短期工作培訓。汪猷還親自代培了一名維吾爾族女進修生，還為新疆化學所代培研究生。蛋白質的結構分析在我國曾較薄弱，汪猷結合天花粉蛋白一級結構的測定研究課題，於1980年邀請西德B·維特曼·利博特（B．Wittmann－Liebold）和亨辛·埃特曼（A．Henschen－Edman）這二位蛋白質結構化學家到有機化學研究所舉辦蛋白微量順序測定講習班。後由該所再辦學習班，把這一新技術推廣到全國許多單位，為提高我國在這一領域的測試水平做出了貢獻，受到了好評。
改革開放以來，汪猷積極為研究所的業務骨乾的出國進修、留學創造條件。他根據研究所的專業設置方向、學科發展趨向，有計劃有重點地派遣科研人員，讓他們到國外學習先進的科學技術，回國報效祖國。
汪猷受中國化學會委託擔任《化學學報》主編達24年。由於他的不懈努力，學報由復刊時的季刊發展為雙月刊，進而為月刊，篇幅也不斷增加。並且於1983年創辦了《化學學報》的英文版，使國際化學界能及時了解中國同行的研究進展。
汪猷積極為中國與國際學術界的交流和友誼做了許多有益的工作。他是1955年北京抗生素國際會議、1979年中國一前聯邦德國蛋白質和核酸學術討論會、1980年中美天然產物化學會議的主持人之一。他組織並主持有來自五大洲33個國家和地區的400餘名科學家參加的1985年國際純粹與應用化學聯合會（IUPAC）上海葯用天然產物有機化學討論會，其學術水平和組織工作均受到與會科學家的高度評價。50年代以來，他曾到比利時、荷蘭、英國、奧地利、捷克、民主德國、聯邦德國、古巴、澳大利亞、羅馬尼亞、法國、瑞士、瑞典、美國、蘇聯、日本、香港等國家和地區進行參觀訪問、考察、講學和參加國際學術會議。與許多國際著名科學家建立並保持著友好的往來和密切的聯系。汪猷的學術成就受到國外同行的贊譽。他被聘為國際著名的有機化學雜志《四面體》、《四面體通訊》的顧問編委（1982—至今），《四面體計算機化學》和《四面體不對稱合成》的顧問編委（1989—至今）以及《核酸研究》編委（1982—至今）。1984年他被列入美國馬爾基（Marquis）第七版名人錄，1984年3月當選為法蘭西科學院外籍院士，1986年當選為美國生物化學與分子生物學學會名譽會員。1987年11月慕尼黑大學按德國傳統為獲得博士學位50年並取得了突出成就的汪猷舉行了重發博士學位文憑的隆重儀式。這是一種極高的榮譽。1988年他又當選為德國巴伐利亞科學院通訊院士。1990年在他80歲時，《四面體》以其第46卷第9期作為獻給汪猷80壽誕的專刊，輯錄了海內外著名有機化學家專門為他撰寫的學術論文。其中包括美、法、英、德、日、瑞士、香港等地著名有機化學家，這是國際化學界對汪猷的學術成就所給予的殊榮。
求索不息嚴以律己
汪猷有著為祖國科學事業徹底獻身的精神，多少年來，他總是早起晚睡，每天都工作到深夜．科學研究就是他的全部生活．他已發表論文100餘篇，獲獎成果近10項。半個世紀以來，他始終站在學科發展的前列，勇敢地迎接挑戰性的難題。30年代他研究甾體，40年代研究抗生素，以後是合成胰島素和核糖核酸。他對「無涯之知」的求索從未停息。多少次他與同行或學生探討甚至爭論一些科學命題。他反對停滯的觀點，勇於進取。因此當胰島素合成後，他思索在深化蛋白質化學所取得成果的同時，開展另一重要的生命基礎物質——核酸化學的研究。經過國內有關科學家的集思廣益，形成了「人工合成酵母丙氨酸轉移核糖核酸」的課題。歷經13年，前後上百人的艱苦研究，核酸合成的任務完成了。在歡慶這一成就時，汪猷發表了「無涯之知，世代之功」（《紅旗》1982年第4期）的文章。告誡他的同事、助手和學生「學無止境」，不要滿足於已得之功，揭開自然科學的奧秘需要世世代代不懈地努力。汪猷身體力行，盡管當時他已過古稀之年，仍壯心不已，繼續去攻克新的科學堡壘，1985年和1986年他組織人力開展了兩項國內尚屬空白和尚無系統研究的重要學科；生物合成和模擬酶化學，至今已陸續發表多篇論文，取得了可喜結果。
汪猷對研究工作刻意求新、求精的精神是他治學態度的又一特點。他大膽、積極地採用新方法、新技術。在他主管有機化學研究所期間，非常重視大型儀器設備的配置和更新。我國第一台用於有機化學研究的紅外光譜儀和核磁共振儀都率先建立於該所。他總是在自己的研究工作中積極應用新技術。從事抗生素研究時，他率先採用當時還屬先進的技術，如離子交換、層析和電泳等。在胰島素、核酸和模擬酶的研究中，他將同位素技術、核磁共振、計算機等先進技術及時用於檢測、動態跟蹤、機理研究等。他首次應用計算機擬合方法於天花粉的結構測定，取得了可喜的結果。凡是汪猷直接負責的研究課題，從路線設計、合成方法、分析手段、數據處理直到撰寫論文，他都親自指導，嚴格把關，一絲不苟。胰島素的全合成曾開過二次鑒定會。在1965年底的第一次成果鑒定會上，參加會議的大多數專家對研究結果都表示滿意，但汪猷作為這項成果的主要負責者之一，帶頭發難，指出胰島素的合成雖然基本完成，但數據不夠充足，應再補充一些必要的數據再進行鑒定。他的這種嚴謹求實的學風受到與會者的贊賞，使幾個月後召開的第二次鑒定會取得圓滿成功。
汪猷愛護青年，提攜後學。1984年他主動退出了所、室領導崗位，放手讓中青年化學家去挑擔子。他說：「中青年思想敏捷、精力充沛，以中青年更新老年，必然有利於科學技術的開創和發展。當然老的科技工作者有更成熟的經驗，更豐富廣博的學識、見聞、思慮，但體力日衰、反映漸鈍的自然規律是不可抗拒的。老科學工作者應該主動地、有意識地、實事求是地培養青年接班人。」他的行動給該所的老同志起了表率作用，推動了該所體制改革的步伐。
汪猷博聞強記。他能熟練使用英、德兩種語言，能閱讀法、俄、日文獻，諳熟中外科學史中的典故、軼事，他常借這些故事教誨他的助手和學生，指點成才之路。 汪猷酷愛寫詩，藉以敘情記事、抒懷言志。
汪猷為人正直，品德高尚，言行一致，身體力行，寬以待人，嚴以律己，絕不謀一己私利。「文化大革命」中汪猷被誣陷，身處逆境，仍堅持原則，拒不承認強加於他的罪名，也絲毫不說假話。他默默地忍受著「文化大革命」遺留下的巨大創傷，並不鳴冤叫屈。在他復任上海有機化學研究所所長後，他一如既往，寬厚待人，從不計較私怨。粉碎「四人幫」之後，組織上著手解決一部分高研人員的住房問題，有一套較理想的房子，組織上打算讓汪猷搬進去，汪猷婉言相謝說：「我的住房已經可以了，我年紀已大，也住不了多長時間，還是給別的同志。」他把較好的住房讓給了另一位高研。
汪猷克己奉公、公私分明。他每年的外事活動、學術交流、外出開會頻繁。凡是私人用車、復印資料堅持自己付款，外事活動中凡以個人名義請客送禮或郵寄年歷等費用，從不向公家報銷。相反，出國訪問或參加國際會議，他盡可能地節約伙食、交通費用，把省下來的錢包括在國外作學術講演所得酬金為研究所添置打字機、幻燈機，購買急需的試劑等等。實行獎金制度以來，無論是論文稿費、研究成果的獎金、月度獎、年終獎等等，他都分文不受。甚至連《化學學報》的主編費、審稿費也統統交給編輯部。他認為他所有的成果都是依靠大家的努力，功勞是大家的。 近幾年來，汪猷曾推薦多人出國，為研究所的業務骨幹創造了許多留學、進修的條件。但他卻從未為自己學化學的女兒寫過一封推薦信，沒有為她提供出國機會。當有人問他為什麼不安排自己的女兒出國時，他回答：「出國學習要靠自己的努力去爭取，如果我先給她聯系，那在研究所里我還怎麼執行好國家的政策！」汪猷就是這樣一位嚴以律己、不謀私利的優秀學者。
汪猷於1961年加入中國共產黨。他熱愛黨，維護黨的威信，擁護社會主義。他黨性強，時時以共產黨員的高標准嚴格要求自己。自1959年至1987年，他曾被選為第二、三、五、六屆全國人民代表大會的代表。1986年汪猷被評為上海市優秀黨員。他的一言一行，嚴格地履行著他入黨時立下的誓言「我決心爭取做一個光榮的中國共產黨黨員，忠實的馬列主義信徒和實踐者，黨的革命事業的先鋒。」

⑶ 離子交換層析中流出物質順序是什麼

若用離子交換層析分離物質，以蛋白質為例，離子交換層析中，基質是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的稱之陰離子交換樹脂；而帶有負電荷的稱之陽離子樹脂。離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化。

由於蛋白質也有等電點，當蛋白質處於不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質，所以這類蛋白質被留在柱子上，然後通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質洗脫下來。結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。

反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質，結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。

(3)採用陽離子交換樹脂分離核苷酸擴展閱讀：

對於離子交換纖維素要用流水洗去少量碎的不易沉澱的顆粒，以保證有較好的均勻度，對於已溶脹好的產品則不必經這一步驟。

溶脹的交換劑使用前要用稀酸或稀鹼處理，使之成為帶H+或OH-的交換劑型。陰離子交換劑常用「鹼-酸-鹼」處理，使最終轉為-OH-型或鹽型交換劑；對於陽離子交換劑則用「酸-鹼-酸」處理，使最終轉為-H-型交換劑。

梯度不要上升太快，要恰好使移動的區帶在快到柱末端時達到解吸狀態。目的物的過早解吸，會引起區帶擴散；而目的物的過晚解吸會使峰形過寬。

⑷ 高效液相色譜常用什麼色譜法

高效液相色譜法按分離機制的不同分為液固吸附色譜法、液液分配色譜法（正相與反相）、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法。
1．液固色譜法 使用固體吸附劑，被分離組分在色譜柱上分離原理是根據固定相對組分吸附力大小不同而分離。分離過程是一個吸附－解吸附的平衡過程。常用的吸附劑為硅膠或氧化鋁，粒度5~10μm。適用於分離分子量200~1000的組分，大多數用於非離子型化合物，離子型化合物易產生拖尾。常用於分離同分異構體。
2．液液色譜法 使用將特定的液態物質塗於擔體表面，或化學鍵合於擔體表面而形成的固定相，分離原理是根據被分離的組分在流動相和固定相中溶解度不同而分離。分離過程是一個分配平衡過程。
塗布式固定相應具有良好的惰性；流動相必須預先用固定相飽和，以減少固定相從擔體表面流失；溫度的變化和不同批號流動相的區別常引起柱子的變化；另外在流動相中存在的固定相也使樣品的分離和收集復雜化。由於塗布式固定相很難避免固定液流失，現在已很少採用。現在多採用的是化學鍵合固定相，如C18、C8、氨基柱、氰基柱和苯基柱。
液液色譜法按固定相和流動相的極性不同可分為正相色譜法(NPC)和反相色譜法(RPC)。
正相色譜法 採用極性固定相（如聚乙二醇、氨基與腈基鍵合相）；流動相為相對非極性的疏水性溶劑（烷烴類如正已烷、環已烷），常加入乙醇、異丙醇、四氫呋喃、三氯甲烷等以調節組分的保留時間。常用於分離中等極性和極性較強的化合物（如酚類、胺類、羰基類及氨基酸類等）。
反相色譜法 一般用非極性固定相（如C18、C8）；流動相為水或緩沖液，常加入甲醇、乙腈、異丙醇、丙酮、四氫呋喃等與水互溶的有機溶劑以調節保留時間。適用於分離非極性和極性較弱的化合物。RPC在現代液相色譜中應用最為廣泛，據統計，它占整個HPLC應用的80%左右。
隨著柱填料的快速發展，反相色譜法的應用范圍逐漸擴大，現已應用於某些無機樣品或易解離樣品的分析。為控制樣品在分析過程的解離，常用緩沖液控制流動相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常為2.5~7.5（2~8），太高的pH值會使硅膠溶解，太低的pH值會使鍵合的烷基脫落。有報告新商品柱可在pH 1.5~10范圍操作。

正相色譜法與反相色譜法比較表

正相色譜法 反相色譜法
固定相極性 高～中 中～低
流動相極性 低～中 中～高
組分洗脫次序 極性小先洗出 極性大先洗出

從上表可看出，當極性為中等時正相色譜法與反相色譜法沒有明顯的界線（如氨基鍵合固定相）。
3．離子交換色譜法 固定相是離子交換樹脂，常用苯乙烯與二乙烯交聯形成的聚合物骨架，在表面未端芳環上接上羧基、磺酸基（稱陽離子交換樹脂）或季氨基（陰離子交換樹脂）。被分離組分在色譜柱上分離原理是樹脂上可電離離子與流動相中具有相同電荷的離子及被測組分的離子進行可逆交換，根據各離子與離子交換基團具有不同的電荷吸引力而分離。
緩沖液常用作離子交換色譜的流動相。被分離組分在離子交換柱中的保留時間除跟組分離子與樹脂上的離子交換基團作用強弱有關外，它還受流動相的pH值和離子強度影響。pH值可改變化合物的解離程度，進而影響其與固定相的作用。流動相的鹽濃度大，則離子強度高，不利於樣品的解離，導致樣品較快流出。
離子交換色譜法主要用於分析有機酸、氨基酸、多肽及核酸。
4．離子對色譜法 又稱偶離子色譜法，是液液色譜法的分支。它是根據被測組分離子與離子對試劑離子形成中性的離子對化合物後，在非極性固定相中溶解度增大，從而使其分離效果改善。主要用於分析離子強度大的酸鹼物質。
分析鹼性物質常用的離子對試劑為烷基磺酸鹽，如戊烷磺酸鈉、辛烷磺酸鈉等。另外高氯酸、三氟乙酸也可與多種鹼性樣品形成很強的離子對。
分析酸性物質常用四丁基季銨鹽，如四丁基溴化銨、四丁基銨磷酸鹽。
離子對色譜法常用ODS柱（即C18），流動相為甲醇-水或乙腈-水，水中加入3~10 mmol/L的離子對試劑，在一定的pH值范圍內進行分離。被測組分保時間與離子對性質、濃度、流動相組成及其pH值、離子強度有關。
5．排阻色譜法 固定相是有一定孔徑的多孔性填料，流動相是可以溶解樣品的溶劑。小分子量的化合物可以進入孔中，滯留時間長；大分子量的化合物不能進入孔中，直接隨流動相流出。它利用分子篩對分子量大小不同的各組分排阻能力的差異而完成分離。常用於分離高分子化合物，如組織提取物、多肽、蛋白質、核酸等。

色譜法的基本原理
利用樣品混合物中各組分理、化性質的差異，各組分程度不同的分配到互不相溶的兩相中。當兩相相對運動時，各組分在兩相中反復多次重新分配，結果使混合物得到分離。
兩相中，固定不動的一相稱固定相；移動的一相稱流動相。
分類：
根據流動相分—以氣體作流動相—氣相色譜——固定相為液體 氣-液色譜
固定相為固體 氣-固色譜
—以液體作流動相—液相色譜——固定相為液體 液-液色譜
固定相為固體 液-固色譜
—當流動相是在接近它的臨界溫度和壓力下工作的液體時——超臨界色譜

根據固定相的附著方式
—固定相裝在圓柱管中—柱色譜
—固定相塗敷在玻璃或金屬板上—薄膜色譜（平板色譜）
—液體固定相塗在紙上—紙色譜（平板色譜）

根據分離機理
—分配色譜—樣品組分的分配系數不同
—吸附色譜— 樣品組分對固定相表面吸附力不同
—體積排阻色譜—利用固定相孔徑不同，把樣品組分按分子大小分開
—離子交換色譜—不同離子與固定相商相反電荷間的作用力大小不同

根據極性
—流動相極性＞固定相極性-反相色譜
—流動相極性＜固定相極性-正相色譜

氣相色譜只適合分析較易揮發、且化學性質穩定的有機化合物，而HPLC則適合於分析那些用氣相色譜難以分析的物質，如揮發性差、極性強、具有生物活性、熱穩定性差的物質。所以，HPLC的應用范圍已經遠遠超過氣相色譜。

一、吸附色譜（adsorption chromatography）
又叫液固色譜法：流動相是液體，固定相是固體。

分離原理：固定相是固體吸附劑，吸附劑是多孔性微粒物質表面有吸附中心。樣品組分與流動相競爭吸附中 心。各組分的吸附能力不同，使組分在固定相中產生保留時間不同和實現分離。

固定相： 固定相通常是強極性的硅膠、氧化鋁、活性炭、聚乙烯、聚醯胺等固體吸附劑。活性硅膠最常用。

流動相： 弱極性有機溶劑或非極性溶劑與極性溶劑的混合物，如正構烷烴（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲 烷/甲醇、乙酸乙酯/乙腈等。
應用： 對於極性，結構異構體分離和族分離仍是最有效的方法，如農葯異構體分離、石油中烷、烯、芳烴的 分離。 缺點是容易產生不對稱峰和拖尾現象。

二、分配色譜
原理： 固定液機械的吸附在惰性載體上，樣品分子依據他們在流動相和固定相間的溶解度不同，分別進入兩相分配而實現分離。
固定相：將一種極性或非極性固定液吸附在惰性固相載體上。如全多孔微粒硅膠吸附劑。
根據極性不同分類：正相分配色譜—固定相載體上塗布的是極性固定液；
流動相是非極性溶劑；
可分立極性較強的水溶性樣品；
弱極性組分先洗脫出來。

反相分配色譜—固定相載體上塗布的是非極性或弱極性固定液；
流動相是極性溶劑；
強極性組分先洗脫出來。
液-液分配色譜固定相中的固定液體往往容易溶解到流動相中去，所以重現性很差，且不能進行梯度洗脫，已經不大為人們所採用。

三、鍵合相色譜

考慮分配色譜法中固定液的缺點，因此將各種不同的有機關能團通過化學反應共價結合到固定相惰性載體上，固定相就不會溶解到流動相中去了。
鍵合固定相優點：○ 對極性有機溶劑有良好的化學穩定性
○使色譜柱的柱效高、壽命長
○實驗重現性好
○幾乎適於各種類相的有機化合物的分離，尤其是k』寬范圍的樣品
○可以梯度洗脫
根據極性不同分類：正相鍵合相色譜—固定相極性＞流動相極性
固定相：二醇基、醚基、氰基、氨基等極性基團的有機分子。
適於分離脂榮、水溶性的極性、強極性化合物

反相鍵合相色譜—固定相極性＜流動相極性
固定相：烷基、苯基等非極性有機分子。如最常用的ODS柱或C18柱就 是最典型的代表，其極性很小。
適於分離非機性、弱極性離子型樣品，
是當今液相色譜的最主要分離模式。
正相HPLC（normal phase HPLC）：
是由極性固定相和非極性（或弱極性）流動相所組成的HPLC體系。其代表性的固定相是改性硅膠、氰基柱等，代表性的流動相是正己烷。吸附色譜也屬正相HPLC。

反相HPLC（reversed phase HPLC）：
由非極性固定相和極性流動相所組成的液相色譜體系，與正相HPLC體系正好相反。其代表性的固定相是十八烷基鍵合硅膠(ODS柱，Octa Decyltrichloro Silane)，代表性的流動相是甲醇和乙腈。

四、體積排阻色譜（SEC，size exclusion chromatograghy）
（又稱凝膠色譜和分子篩色譜）
原理： 以多孔凝膠（如葡萄糖，瓊脂糖，硅膠，聚丙烯醯胺等）作固定相，依據樣品分子量大小達到分離目 的。大分子不進入凝膠孔洞，沿多孔凝膠膠粒間隙流出，先被洗脫；小分子進入大部分凝膠孔洞， 在柱中被強滯留，後被洗脫。

根據樣品性質分類：凝膠過濾（GFC）—用於分析水溶性樣品，如多肽、蛋白、生物酶、寡聚核苷酸、多聚核 苷酸、多糖。
凝膠滲透（GPC）—用於分析脂溶性樣品，如測定高聚物的分子量。

SEC主要依據分子量大小進行分離，因此與樣品、流動相間的相互作用無關。因此不採用改變流動相的組成來改善分離度。

五、離子交換色譜
（ion exchange chromatography, IEC）
分離原理：使用表面有離子交換基團的離子交換劑作為固定相。帶負電荷的交換基團（如磺酸基和羧酸基）可以用於陽離子的分離；帶正電荷的交換基團（如季胺鹽）可以用於陰離子的分離。不同離子與交換基的作用力大小不同，在樹脂中的保留時間長短不同，從而被相互分離