1. 給出一種酶，如何設計其純化方案
發個實驗給你參考參考！！！
酵母蔗糖酶的分離純化和活力測定
實驗簡介：酶的分離制備在酶學以及生物大分子的結構功能研究種具有重要意義。啤酒酵母中蔗糖酶含量豐富。本實驗用新鮮啤酒酵母作為原料，通過破碎細胞，熱處理，乙醇沉澱，柱層析等步驟提取蔗糖酶。並對其活力進行測定。
實驗原理
蔗糖酶主要存在於酵母中，但工業上通常從酵母中製取。酵母蔗糖酶系胞內酶，提取時細胞破碎或菌體自溶。常用的提純方法有鹽析、有機溶劑沉澱、離子交換和凝膠柱層析。以此可得到較高純度的酶。
蔗糖酶催化下蔗糖水解為等量的葡萄糖和果糖。用測定生成還原糖(葡萄糖和果糖)的量來測定蔗糖水解的速度，本實驗中，蔗糖酶的活力單位指在一定條件下反應5min,每產生l毫克葡萄糖所需酶量。 用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量，比活力為每毫克蛋白質的活力單位數。
實驗操作
1. 提取
(1) 准備一個冰浴，將研缽穩妥放入冰浴中。
(2) 將10g濕啤酒酵母，和適量（5g）二氧化硅一起放入研缽中。二氧化硅要預先研細。
(3) 緩慢加入預冷的30mL去離子水，每次加2mL左右，邊加邊研磨，至少用30分鍾。以便將蔗糖酶充分轉入水相，至酵母細胞大部分研碎，以便將蔗糖酶充分轉入水相中。
(4) （可選項） 研磨時用顯微鏡檢查研磨的效果。
(5) 將混合物轉入兩個離心管中，平衡後，用高速冷離心機，4℃，10000rpm，離心5min。
(6) 用滴管小心地取出水相，轉入另一個清潔的離心管中，4℃，10000rpm，離心15min。
(7) 將清液轉入量筒，量出體積，用廣泛pH試紙檢查上清液pH，用1mol / L 醋酸將pH調至5.0，稱為「粗級分Ⅰ」。留出1.5mL測定酶活力及蛋白含量，剩餘部分轉入清潔的離心管中。
2. 熱處理和乙醇沉澱
(1) 預先將恆溫水浴調到50℃，將盛有粗級分I的離心管穩妥地放入水浴中，45℃下保溫30分鍾，在保溫過程中不斷輕搖離心管。
(2) 取出離心管，於冰浴中迅速冷卻，用4℃，10000rpm，離心10min。
(3) 將上清液轉入小燒杯中，放入冰鹽浴（沒有水的碎冰撒入少量食鹽），逐滴加入等體積預冷至－20℃的95%乙醇，同時輕輕攪拌，共需30分鍾，再在冰鹽浴中放置10分鍾，以沉澱完全。於4℃，10000rpm，離心10min，傾去上清，並滴干，沉澱保存於離心管中，蓋上蓋子或薄膜封口，然後將其放入冰箱中冷凍保存（稱為「級分Ⅱ」）。廢棄上清液之前，要用尿糖試紙檢查其酶活性（於下一個實驗一起做）。
3. DEAE纖維素柱層析純化酶蛋白
(1) 離子交換劑的處理
稱取1.5克DEAE纖維素(DE-32)乾粉，加入0.5mol／L NaOH溶液(約50m1)，輕輕攪拌，浸泡至少0.5小時(不超過1小時)，用玻璃砂漏斗抽濾，並用去離子水洗至近中性，抽干後，放入小燒杯中，加50mL 0.5mol／L HCl，攪勻，浸泡0.5小時，用去離子水洗至。近中性，再用0.5 mol／L NaOH重復處理一次，用去離子水洗至近中性後，抽干備用(因DEAE纖維素昂貴，用後務必回收)。實際操作時，通常纖維素是已浸泡過並回收的，按「鹼一酸」的順序洗即可，因為酸洗後較容易用水洗至中性。鹼洗時因過濾困難，可以先浮選除去細顆粒，抽干後用0.5 mol／L NaOH-0.5 mol／L NaCl溶液處理，然後水洗至中性。
(2) 裝柱與平衡
先將層析柱垂直裝好，在燒杯內用0.02 mol／L，pH7.3 Tris-HCl緩沖液洗纖維素幾次，用滴管吸取燒杯底部大顆粒的纖維素裝柱，然後用此緩沖液洗柱至流出液的pH與緩沖液相同或接近時即可上樣。
(3) 上樣與洗脫
上樣前先准備好梯度混合器，詳見附錄TH-500梯度混合器使用說明。
用5mL 0.02mol／L，pH7.3的Tris-HCl緩沖液充分溶解醇級分Ⅱ(注意玻璃攪棒頭必須燒圓，攪拌溶解時不可將離心管劃傷)，若溶液混濁，則4 000r／min離心除去不溶物。取1.5mL上清液(即醇級分Ⅱ樣品，留待下一個實驗測酶活力及蛋白含量)，將剩餘的3.5mL上清液小心地加到層析柱上，不要擾動柱床，上樣後用約30mL緩沖液洗去柱中未吸附的蛋白質，至A280降到0.1以下，注意從上樣開始使用部分收集器收集，每管2.5～3.0mL／l0min。然後打開梯度混合器，採用30mL，0.02mol／L，pH7.3的Tris-HCl緩沖液和30mL含0.2mol／L濃度NaCl的0.02mol／L，pH7.3的Tris-HCl.緩沖液，進行線性梯度洗脫，連續收集洗脫液，控制流速2.5～3.0mL／10min。測定每管洗脫液的A280光吸收值。
(4) 各管洗脫液酶活力的定性測定
在點滴板上每一孔內，加一滴0.2mol／L，pH4.6的乙酸緩沖液，一滴0.5mol／L蔗糖和一滴洗脫液，反應5min，在每一孔內同時插入一小條尿糖試紙，10～20min後觀察試紙顏色的變化。用「+」號的數目，表示顏色的深淺，即各管酶活力的大小。合並活性最高的2～3管，量出總體積，並將其分成10份，分別倒人10個小試管，用保鮮膜封口，冰凍保存，使用時取出一管，此即「柱級分Ⅲ」。
4. 各級分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ蔗糖酶活力
用0.02mol／L，pH4.6乙酸緩沖液(也可以用pH5～6的去離子水代替)稀釋各級分酶液，測出酶活合適的稀釋倍數：
Ⅰ： 1 000～10 000倍；
Ⅱ： 1 000～10 000倍；
Ⅲ： 100～1 000倍；
以上稀釋倍數僅供參考。
按「表1」的順序在試管中加入各試劑，進行測定，為簡化操作可取消保鮮膜封口，沸水浴加熱改為用90～95℃水浴加熱 8-10min，以5min生成的還原糖的毫克數為縱坐標，以試管中lmL反應混合物中的酶濃度(mg蛋白／m1)為橫坐標，畫出反應速度與酶濃度的關系曲線。
表1 各級分I、Ⅱ、Ⅲ蔗糖酶活性測定
各管名稱 對照 級分Ⅰ 級分Ⅱ 級分Ⅲ 葡萄糖
管數 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
酶液/mL 0.0 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 / / /
H2O/mL 0.6 0.55 0.40 0.10 0.55 0.40 0.10 0.55 0.40 0.10 0.8 0.4 0.2
乙酸緩沖液0.2mol/L,pH4.6 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / /
葡萄糖2mmol/L / / / / / / / / / / 0.2 0.6 0.8
蔗糖0.25mol/L 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / /
加入蔗糖，立即搖勻開始記時，室溫准確反應5min後，立即加1mL 0.1M NaOH中止反應
二硝基水楊酸溶液 mL 1.0
用保鮮膜封口，扎眼，沸水浴加熱5min，立即用水冷卻3分鍾。
H2O/mL 4.0
A520
稀釋後酶活力 /
原始酶活力 /
5. 考馬斯亮蘭法測定各級分蛋白質含量
(1) 蛋白質標准曲線製作
取14支試管，分兩組按下表平行操作。
表2 蛋白質標准曲線製作
試管編號/mL 0 1 2 3 4 5 6
標准蛋白溶液/mL
0.02mol/L Tris-HCl緩沖液/mL
考馬斯亮蘭試劑/mL
搖勻，1h內以0號試管為空白對照，在595nm處比色
A595nm
(2) 各級分蛋白質含量測定
考馬斯亮蘭G-250在酸性溶液時呈茶棕色，最大吸收峰在465nm。當與蛋白質結合後變成深藍色，最大吸收峰轉至595nm，在10~100μg/mL蛋白質濃度范圍內成正比。因此在測定各級分蛋白質含量時應稀釋適當倍數，使其測定值在標准曲線的直線范圍內。根據所測定的A595nm值，在標准曲線上查出相當於標准蛋白的量，從而計算出未知樣品的蛋白質濃度(mg/mL)。
6. 計算各級分的比活力、純化倍數及回收率
為了測定和計算下面表3中的各項數據，對各個級分都必須取樣，每取一次樣，對於下一級分來說會損失一部分量，因而要對下一個級分的體積進行校正，以使回收率的計算不致受到不利的影響。
1活力單位(U)＝酶在室溫，pH＝4.6條件下，每分鍾水解產生1μmol葡萄糖所需酶量。比活力＝活力單位/mg蛋白。
表3 各級分的比活力、純化倍數及回收率
級
分 記錄
體積
(m1) 校正
體積
(m1) 蛋白質
(mg／m1) 總蛋白
(mg) Unit
(s／m1) 總活力
(U) 比活力
(Units
／mg) 純化
倍數 回收率
(％)
Ⅰ 1.0 100
Ⅱ
Ⅲ
下面表4是對假定的各級分記錄體積進行校正計算的方法和結果：
表4 實驗記錄表
級分 記錄體積 (m1) 校正體積計算 取樣體積
(m1) 校正後體積
(m1)
Ⅰ 15 15 1.5 15.00
Ⅱ 5 5×(15／13.5) 1.5 5.5
Ⅲ 6 6×(15／13.5)×(5／3.5) 1.5 9.5
五、 結果
在同一張圖上畫出所有管的酶活力、光吸收值A280的曲線和洗脫梯度線。得出各級分的活力，比活力，提純倍數以及回收率。
六、 注意事項
從上樣開始收集，可能有兩個活性峰，梯度洗脫開始前的第一個峰是未吸附物，本實驗取用梯度洗脫開始後洗下來的活性峰。
七、 作業
1．為什麼酶的提取需要低溫操作？
2．熱處理的根據是什麼？
去除熱敏感蛋白。
參考文獻
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編著者——陳彥，李紹飛
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3. 酶的提取:固液比1:5,20℃提取30分鍾,共提取三次如何操作
發個實驗給你參考參考！！！
酵母蔗糖酶的分離純化和活力測定
實驗簡介：酶的分離制備在酶學以及生物大分子的結構功能研究種具有重要意義。啤酒酵母中蔗糖酶含量豐富。本實驗用新鮮啤酒酵母作為原料，通過破碎細胞，熱處理，乙醇沉澱，柱層析等步驟提取蔗糖酶。並對其活力進行測定。
實驗原理
蔗糖酶主要存在於酵母中，但工業上通常從酵母中製取。酵母蔗糖酶系胞內酶，提取時細胞破碎或菌體自溶。常用的提純方法有鹽析、有機溶劑沉澱、離子交換和凝膠柱層析。以此可得到較高純度的酶。
蔗糖酶催化下蔗糖水解為等量的葡萄糖和果糖。用測定生成還原糖(葡萄糖和果糖)的量來測定蔗糖水解的速度，本實驗中，蔗糖酶的活力單位指在一定條件下反應5min,每產生l毫克葡萄糖所需酶量。 用考馬斯亮藍法測定蛋白質含量，比活力為每毫克蛋白質的活力單位數。
實驗操作
1. 提取
(1) 准備一個冰浴，將研缽穩妥放入冰浴中。
(2) 將10g濕啤酒酵母，和適量（5g）二氧化硅一起放入研缽中。二氧化硅要預先研細。
(3) 緩慢加入預冷的30mL去離子水，每次加2mL左右，邊加邊研磨，至少用30分鍾。以便將蔗糖酶充分轉入水相，至酵母細胞大部分研碎，以便將蔗糖酶充分轉入水相中。
(4) （可選項） 研磨時用顯微鏡檢查研磨的效果。
(5) 將混合物轉入兩個離心管中，平衡後，用高速冷離心機，4℃，10000rpm，離心5min。
(6) 用滴管小心地取出水相，轉入另一個清潔的離心管中，4℃，10000rpm，離心15min。
(7) 將清液轉入量筒，量出體積，用廣泛pH試紙檢查上清液pH，用1mol / L 醋酸將pH調至5.0，稱為「粗級分Ⅰ」。留出1.5mL測定酶活力及蛋白含量，剩餘部分轉入清潔的離心管中。
2. 熱處理和乙醇沉澱
(1) 預先將恆溫水浴調到50℃，將盛有粗級分I的離心管穩妥地放入水浴中，45℃下保溫30分鍾，在保溫過程中不斷輕搖離心管。
(2) 取出離心管，於冰浴中迅速冷卻，用4℃，10000rpm，離心10min。
(3) 將上清液轉入小燒杯中，放入冰鹽浴（沒有水的碎冰撒入少量食鹽），逐滴加入等體積預冷至－20℃的95%乙醇，同時輕輕攪拌，共需30分鍾，再在冰鹽浴中放置10分鍾，以沉澱完全。於4℃，10000rpm，離心10min，傾去上清，並滴干，沉澱保存於離心管中，蓋上蓋子或薄膜封口，然後將其放入冰箱中冷凍保存（稱為「級分Ⅱ」）。廢棄上清液之前，要用尿糖試紙檢查其酶活性（於下一個實驗一起做）。
3. DEAE纖維素柱層析純化酶蛋白
(1) 離子交換劑的處理
稱取1.5克DEAE纖維素(DE-32)乾粉，加入0.5mol／L NaOH溶液(約50m1)，輕輕攪拌，浸泡至少0.5小時(不超過1小時)，用玻璃砂漏斗抽濾，並用去離子水洗至近中性，抽干後，放入小燒杯中，加50mL 0.5mol／L HCl，攪勻，浸泡0.5小時，用去離子水洗至。近中性，再用0.5 mol／L NaOH重復處理一次，用去離子水洗至近中性後，抽干備用(因DEAE纖維素昂貴，用後務必回收)。實際操作時，通常纖維素是已浸泡過並回收的，按「鹼一酸」的順序洗即可，因為酸洗後較容易用水洗至中性。鹼洗時因過濾困難，可以先浮選除去細顆粒，抽干後用0.5 mol／L NaOH-0.5 mol／L NaCl溶液處理，然後水洗至中性。
(2) 裝柱與平衡
先將層析柱垂直裝好，在燒杯內用0.02 mol／L，pH7.3 Tris-HCl緩沖液洗纖維素幾次，用滴管吸取燒杯底部大顆粒的纖維素裝柱，然後用此緩沖液洗柱至流出液的pH與緩沖液相同或接近時即可上樣。
(3) 上樣與洗脫
上樣前先准備好梯度混合器，詳見附錄TH-500梯度混合器使用說明。
用5mL 0.02mol／L，pH7.3的Tris-HCl緩沖液充分溶解醇級分Ⅱ(注意玻璃攪棒頭必須燒圓，攪拌溶解時不可將離心管劃傷)，若溶液混濁，則4 000r／min離心除去不溶物。取1.5mL上清液(即醇級分Ⅱ樣品，留待下一個實驗測酶活力及蛋白含量)，將剩餘的3.5mL上清液小心地加到層析柱上，不要擾動柱床，上樣後用約30mL緩沖液洗去柱中未吸附的蛋白質，至A280降到0.1以下，注意從上樣開始使用部分收集器收集，每管2.5～3.0mL／l0min。然後打開梯度混合器，採用30mL，0.02mol／L，pH7.3的Tris-HCl緩沖液和30mL含0.2mol／L濃度NaCl的0.02mol／L，pH7.3的Tris-HCl.緩沖液，進行線性梯度洗脫，連續收集洗脫液，控制流速2.5～3.0mL／10min。測定每管洗脫液的A280光吸收值。
(4) 各管洗脫液酶活力的定性測定
在點滴板上每一孔內，加一滴0.2mol／L，pH4.6的乙酸緩沖液，一滴0.5mol／L蔗糖和一滴洗脫液，反應5min，在每一孔內同時插入一小條尿糖試紙，10～20min後觀察試紙顏色的變化。用「 」號的數目，表示顏色的深淺，即各管酶活力的大小。合並活性最高的2～3管，量出總體積，並將其分成10份，分別倒人10個小試管，用保鮮膜封口，冰凍保存，使用時取出一管，此即「柱級分Ⅲ」。
4. 各級分Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ蔗糖酶活力
用0.02mol／L，pH4.6乙酸緩沖液(也可以用pH5～6的去離子水代替)稀釋各級分酶液，測出酶活合適的稀釋倍數：
Ⅰ： 1 000～10 000倍；
Ⅱ： 1 000～10 000倍；
Ⅲ： 100～1 000倍；
以上稀釋倍數僅供參考。
按「表1」的順序在試管中加入各試劑，進行測定，為簡化操作可取消保鮮膜封口，沸水浴加熱改為用90～95℃水浴加熱 8-10min，以5min生成的還原糖的毫克數為縱坐標，以試管中lmL反應混合物中的酶濃度(mg蛋白／m1)為橫坐標，畫出反應速度與酶濃度的關系曲線。
表1 各級分I、Ⅱ、Ⅲ蔗糖酶活性測定
各管名稱 對照 級分Ⅰ 級分Ⅱ 級分Ⅲ 葡萄糖
管數 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
酶液/mL 0.0 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 0.05 0.20 0.50 / / /
H2O/mL 0.6 0.55 0.40 0.10 0.55 0.40 0.10 0.55 0.40 0.10 0.8 0.4 0.2
乙酸緩沖液0.2mol/L,pH4.6 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / /
葡萄糖2mmol/L / / / / / / / / / / 0.2 0.6 0.8
蔗糖0.25mol/L 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 0.2 / / /
加入蔗糖，立即搖勻開始記時，室溫准確反應5min後，立即加1mL 0.1M NaOH中止反應
二硝基水楊酸溶液 mL 1.0
用保鮮膜封口，扎眼，沸水浴加熱5min，立即用水冷卻3分鍾。
H2O/mL 4.0
A520
稀釋後酶活力 /
原始酶活力 /
5. 考馬斯亮蘭法測定各級分蛋白質含量
(1) 蛋白質標准曲線製作
取14支試管，分兩組按下表平行操作。
表2 蛋白質標准曲線製作
試管編號/mL 0 1 2 3 4 5 6
標准蛋白溶液/mL
0.02mol/L Tris-HCl緩沖液/mL
考馬斯亮蘭試劑/mL
搖勻，1h內以0號試管為空白對照，在595nm處比色
A595nm
(2) 各級分蛋白質含量測定
考馬斯亮蘭G-250在酸性溶液時呈茶棕色，最大吸收峰在465nm。當與蛋白質結合後變成深藍色，最大吸收峰轉至595nm，在10~100μg/mL蛋白質濃度范圍內成正比。因此在測定各級分蛋白質含量時應稀釋適當倍數，使其測定值在標准曲線的直線范圍內。根據所測定的A595nm值，在標准曲線上查出相當於標准蛋白的量，從而計算出未知樣品的蛋白質濃度(mg/mL)。
6. 計算各級分的比活力、純化倍數及回收率
為了測定和計算下面表3中的各項數據，對各個級分都必須取樣，每取一次樣，對於下一級分來說會損失一部分量，因而要對下一個級分的體積進行校正，以使回收率的計算不致受到不利的影響。
1活力單位(U)＝酶在室溫，pH＝4.6條件下，每分鍾水解產生1μmol葡萄糖所需酶量。比活力＝活力單位/mg蛋白。
表3 各級分的比活力、純化倍數及回收率
級
分 記錄
體積
(m1) 校正
體積
(m1) 蛋白質
(mg／m1) 總蛋白
(mg) Unit
(s／m1) 總活力
(U) 比活力
(Units
／mg) 純化
倍數 回收率
(％)
Ⅰ 1.0 100
Ⅱ
Ⅲ
下面表4是對假定的各級分記錄體積進行校正計算的方法和結果：
表4 實驗記錄表
級分 記錄體積 (m1) 校正體積計算 取樣體積
(m1) 校正後體積
(m1)
Ⅰ 15 15 1.5 15.00
Ⅱ 5 5×(15／13.5) 1.5 5.5
Ⅲ 6 6×(15／13.5)×(5／3.5) 1.5 9.5
五、 結果
在同一張圖上畫出所有管的酶活力、光吸收值A280的曲線和洗脫梯度線。得出各級分的活力，比活力，提純倍數以及回收率。
六、 注意事項
從上樣開始收集，可能有兩個活性峰，梯度洗脫開始前的第一個峰是未吸附物，本實驗取用梯度洗脫開始後洗下來的活性峰。
七、 作業
1．為什麼酶的提取需要低溫操作？
2．熱處理的根據是什麼？
去除熱敏感蛋白。
參考文獻
1．邵雪玲，毛歆，郭一清．生物化學與分子生物學實驗指導．武漢：武漢大學出版社，2003
2．張龍翔．高級生物化學實驗選編．北京：高等教育出版社，1989
3．許培雅，邱樂泉．離子交換柱層析純化蔗糖酶實驗方法改進研究．實驗室研究與探索，2002，21(3):82~84
編著者——陳彥，李紹飛
4. 蛋白質洗脫曲線的分析
從曲線中可以看出，幾個蛋白質的峰值出現在11管、30管、37管、41管、76管，其版中76管的峰值最權大，而這幾個峰值對應的NaCl的濃度在0.6-0.8之間，76管對應的是0.8.所謂出峰，就是蛋白含量相對較高。這個曲線告訴你，在NaCl的濃度在0.6-0.8時，蛋白質的含量較高，你可在對應的試管數收取你的目的蛋白，然後在通道蛋白電泳等手段檢測你的目的蛋白。
我以前做過蛋白的純化，但是對於洗脫曲線的分析不是很在行，但我想原理是差不多的，希望可以幫助到你。
5. 酵母蔗糖酶的分離純化為什麼用陰離子交換劑
因使用陰離子交換劑進行酵母蔗糖酶的分離純化，可以高效地將帶有負電荷的酵母蔗糖酶從混合物中分離出來，並得到高純度的酵母游廳蔗糖酶。根據查詢相關信息顯示，酵母蔗糖酶是一種帶有負電荷的蛋白質，在分離純化過程中可以利神首隱用陰離子交換劑實現。陰離子交換劑是一種具有固定負電荷的樹脂，可以芹拿吸附帶有正電荷的離子或化合物，同時排斥帶有負電荷的離子或化合物。因此，陰離子交換劑可以將帶有負電荷的酵母蔗糖酶從混合物中分離出來。
6. 怎樣從酵母中提取蔗糖酶
菌體自溶法/機械破碎法/超聲波破碎法