㈠ 離子對濃度和出峰時間的關系
是流動相濃度,因為離子交換色譜的分離原理就是利用色譜柱對不同離子的吸附或交換能力不同而完成的,因此這種形式的色譜柱,對流動相的離子濃度和pH都非常敏感
㈡ 如何用液相色譜儀測氨基酸
反相高效液相色譜法測定煙葉中的游離氨基酸
氨基酸是煙草中的一類重要化學物質，在煙草調制、醇化或發酵、加工直至燃燒過程中，游離氨基酸與還原糖之間可發生酶催化及非酶催化的棕色化反應，生成多種具有蒸煮、烤香、爆米花香味特徵的吡喃、吡嗪、吡咯、吡啶類等雜環化合物，某些氨基酸如苯丙氨酸還可自身分解成香味化合物，如苯甲醇、苯乙醇等。氨基酸含量與煙草製品的吃味有著密切的關系，氨基酸在燃燒裂解過程中一般形成具有刺激性的含氮化合物，對煙氣香吃味產生不良影響，個別氨基酸還產生HCN等危害健康的煙氣成分。一般說來，氨基酸含量太高，煙氣辛辣、味苦、刺激性強烈；含量太低時煙氣則平淡無味缺少豐滿度。因此對氨基酸的分析是一項很有意義的工作，二十世紀60年代以來，國內外在這方面做了大量的工作[1-5]。
植物游離氨基酸樣品的制備，國內外採用的提取劑和純化方法各不相同。據文獻報道[6-7]，鹽酸、不同濃度的乙醇溶液均可以用來提取植物組織中的游離氨基酸；提取液純化則有用陽離子交換樹脂、5%磺基水楊酸、活性炭或乙醚等方法。本實驗對不同的提取方式和不同的純化方法進行了對比研究，確定提取煙葉中游離氨基酸的較佳提取劑和純化方法。提取、純化後的樣品，採用OPA、FMOC聯合柱前衍生反相高效液相色譜法對煙葉中的游離氨基酸進行了測定。該方法使帶氨基和亞氨基基團的氨基酸能夠被同時測定，且得到較好的定性定量結果。
1 實驗
1.1 儀器
Agilent公司HP1100型高效液相色譜儀(帶可變波長紫外檢測器和自動進樣器)，PE公司Lambda Bio40 紫外-可見分光光度計。
1.2 試劑
正纈氨酸（Norvaline，內標），OPA ，FMOC，均為色譜純，Agilent公司提供；硼酸緩沖溶液，Agilent公司提供；
醋酸鈉(NaAc)，分析純，中國醫葯（集團）上海化學試劑公司；三乙胺（TEA），四氫呋喃（THF），乙腈（CH3CN），甲醇(MeOH)，均為色譜純，Fisher公司試劑；
氨基酸標樣包括：天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、天冬醯胺（Asn）、谷氨醯胺（Gln）、絲氨酸（Ser）、組氨酸（His）、甘氨酸（Gly）、蘇氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、精氨酸（Arg）、酪氨酸（Tyr）、胱氨酸（Cys）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、苯丙氨酸（Phe）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、脯氨酸（Pro），均為生化試劑，中國醫葯（集團）上海化學試劑公司；
苯乙烯陽離子交換樹脂（732型），天津樹脂廠。
1.3 樣品處理
將煙葉在烘箱中恆溫40℃烘乾至恆重，粉碎，過80目篩，篩下物為實驗用煙樣粉末，置於廣口瓶中備用。准確稱取煙樣粉末1.000g於乾燥的潔凈試管中，用一定濃度的乙醇溶液室溫超聲波提取半小時，過濾，相同濃度的乙醇溶液洗滌，再提取一次，合並後的濾液用陽離子交換柱洗脫，然後用95ml 4mol/L氨水淋洗陽離子交換柱，淋洗液恆溫濃縮至干，最後用3ml 0.1mol/L稀鹽酸溶液溶解濃縮物，將此溶液離心分離20min，0.45μm微孔濾膜過濾，加入濃度為5nmol/μ1的內標10μ1，定容至50ml，HP1100液相色譜儀進行氨基酸分析。
樣品自動柱前衍生化：Agilent公司G1313A自動進樣器進樣。程序為：吸取5μl硼酸緩沖液，再吸取1μ1 OPA試劑，洗針一次，吸取樣品2μl，原位混合6次。吸取1μl FMOC試劑，洗針一次，原位混合3次，進樣。
1.4 色譜條件
色譜柱：Hypersil AA-ODS C18 2.1×200mm
流動相A：1.36±0.025g醋酸鈉，加入500ml純水溶解，加90μl三乙胺，用1%醋酸調pH=7.20±0.05，再加入1.5ml四氫呋喃，混合均勻。
流動相B：1.36±0.025g醋酸鈉，加入100ml純水溶解，用1%醋酸調pH=7.20±0.05，將此溶液加至200ml乙腈和200ml甲醇的混合物中，並混合均勻。
流速：0.45ml/min
柱溫：40℃
紫外檢測波長: 0～16min， 338nm； 16～25min，262nm
淋洗梯度：見表1
表1 流動相的淋洗梯度表
Table 1 The gradient time table of mobile phase
序列 時間（min） 流動相A（%） 流動相B（%） 流速（ml/min）
1 0.00 100.0 0.0 0.450
2 15.50 40.0 60.0 0.450
3 18.00 0.0 100.0 0.450
4 21.00 0.0 100.0 0.800
5 23.90 0.0 100.0 0.800
6 24.00 0.0 100.0 0.450
7 25.00 100.0 0.0 0.450
1.5 氮基酸的定性
用標樣色譜圖、文獻參照和標樣加入的方法，通過對照保留時間進行定性，對氨基酸的出峰順序加以確認。
1.6 內標法定量
准確移取濃度為10 pmol/μ1、25 pmol/μ1、50 pmol/μ1、100 pmol/μ1、250 pmol/μ1、500 pmol/μ1、1000 pmol/μ1的氨基酸混合標樣100μl於帶內襯管的樣品瓶中，再加入250pmol/μ1內標溶液100μl，充分混合，液相色譜分析，儀器自動計算各氨基酸的標准曲線。
2 結果與討論
2.1 萃取溶劑的比較
氨基酸可溶解於水、乙醇、甲醇、稀酸等，因此它們均可作為煙葉中游離氨基酸的萃取溶劑，傳統的方法是用乙醇和0.1mol/L的鹽酸。實驗發現，乙醇和0.1mol/L的鹽酸萃取方法比較，提取出的煙葉中的游離氨基酸的總量變化不大，但用鹽酸提取的樣品分析時RSD%較大，平均8.51%，其中超過10%的有4個，甘氨酸的RSD%最大為20%；而用乙醇提取的樣品分析時RSD%相對較小，平均5.12%，超過10%的只有1個。而且鹽酸提取液過濾速度慢，需要30-40min，而乙醇提取液過濾只需10min左右；因此，本實驗選擇乙醇作為煙葉中游離氨基酸的萃取溶劑。
2.2 乙醇濃度的選擇
選擇五種不同濃度的乙醇溶液進行了煙樣中游離氨基酸的提取，測定不同條件下提取液中游離氨基酸的總量，結果如圖1。圖中顯示，在乙醇溶液濃度為80%時，煙樣中總游離氨基酸的提取量最大。而且不同濃度下游離氨基酸的RSD%沒有明顯的變化，因此，選擇80%的乙醇溶液來進行煙樣中游離氨基酸的提取。
2.3 不同純化方法的確定
在最佳乙醇溶液濃度下，分別用活性炭加入提取液吸附雜質、乙醚加入提取液萃取分離雜質、5%磺基水楊酸加入提取液沉澱去除雜質和陽離子交換樹脂吸附雜質四種方法進行了純化實驗。結果發現，活性炭作為純化劑時其色譜圖中雜質峰較少，但同時氨基酸峰亦有多個消失，主要是因為活性炭對氨基酸也有較強的吸附，它在吸附雜質的同時也吸附了需要檢測的氨基酸，故活性炭不適合作為純化劑使用。乙醚和5%磺基水楊酸作為純化劑時，雜質去除不完全，其色譜圖均表現為雜質峰較多，湮沒了大量氨基酸峰，且基線漂移嚴重，給定性定量工作帶來困難。當用陽離子交換樹脂進行純化時，其色譜圖中雜質峰較少，基線平穩，氨基酸峰分離較好，均可以進行定性和定量分析，故本實驗選擇了陽離子交換樹脂作為純化手段。
2.4 色譜分離
2.5 線性范圍及標准曲線
分別取濃度為10 pmol/μ1、25 pmol/μ1、50 pmol/μ1、100 pmol/μ1、250 pmol/μ1、500 pmol/μ1、1000 pmol/μ1的氨基酸混合標樣加入等體積的250 pmol/μ1的內標溶液，進行HPLC分析，以氨基酸濃度為橫坐標，氨基酸與內標的面積比為縱坐標，得到各個氨基酸的標准曲線，如表2所示。從表中可以看出，各氨基酸在10-1000 pmol/μ1的濃度范圍內均有良好的線性，各氨基酸標准曲線的線性相關系數均大於0.99。
表2 氨基酸的標准曲線
Table 2 Standard curves of 17 amino acids
氨基酸 線性方程 相關系數
Asp Y=0.007037x+0.004689 0.9972
Glu Y=0.007520x+0.005375 0.9961
Ser Y=0.006903x+0.038212 0.9988
His Y=0.003719x+0.020168 0.9945
Gly Y=0.005851x+0.018235 0.9966
Thr Y=0.006932x+0.021072 0.9978
Ala Y=0.006275x+0.015314 0.9912
Arg Y=0.006088x+0.016113 0.9920
Tyr Y=0.006734x+0.015022 0.9993
Cys Y=0.006004x+0.009876 0.9985
Val Y=0.006432x+0.009932 0.9927
Met Y=0.006574x+0.010346 0.9905
Phe Y=0.005098x+0.019023 0.9962
Ile Y=0.005976x+0.016235 0.9953
Leu Y=0.006044x+0.015332 0.9964
Lys Y=0.006833x+0.010437 0.9969
Pro Y=0.022455x+0.009376 0.9922
2.6 重現性實驗
取雲南C2F99煙樣做平行實驗（n=5），進行煙葉中游離氨基酸含量的檢測，結果發現： Asp和 Glu含量的RSD%分別為8.0%和8.6%，這可能是二者的分離度不高引起的；His的RSD%為9.0%，這可能與其含量較低，分離效果不好有關。其它氨基酸含量的RSD%均處在3%～7%。
2.7 回收率實驗
用標樣加入法進行回收率實驗，結果見表3。 Thr的回收率僅為68.0%，原因可能與其含量較少有關；其它15種氨基酸的回收率在81.0%～110.5%，平均回收率為93.9%，說明該方法的回收率結果令人滿意。
表3 分析方法的回收率
Table 3 Recovery percents of the analytical method
氨基酸 加入量（mg/g煙樣） 樣品含量（mg/g煙樣） 測定值（mg/g煙樣） 差值（mg/g煙樣） 回收率%
Asp 0.200 0.320 0.499 0.179 89.5
Glu 0.200 0.309 0.484 0.175 87.5
Asn 0.200 0.986 1.208 0.222 110.0
Ser 0.200 0.172 0.334 0.162 81.0
Gln 0.200 0.186 0.368 0.182 91.0
His 0.200 0.106 0.297 0.191 95.5
Gly 0.200 0.064 0.279 0.215 107.5
Thr 0.200 0.052 0.188 0.136 68.0
Ala 0.200 0.642 0.835 0.193 96.5
Arg 0.200 0.266 0.463 0.197 98.5
Val 0.200 0.090 0.259 0.169 84.5
Phe 0.200 0.218 0.406 0.188 94.0
Ile 0.200 0.026 0.191 0.165 82.5
Leu 0.200 0.028 0.199 0.171 85.5
Pro 0.200 1.432 1.653 0.221 110.5
Tyr 0.200 0.062 0.245 0.183 91.5
2.8 樣品分析
利用該方法對不同等級的煙葉中游離氨基酸的含量進行了分析，結果見表4。從表中可以看出，在所分析的樣品中，烤煙煙葉中含量最高的氨基酸是Pro，白肋煙煙葉中含量最高的氨基酸是Asp和Asn；白肋煙煙葉中氨基酸的含量高於烤煙煙葉；相同等級的烤煙煙葉，雲南煙葉中的氨基酸含量高於其它產區。
表4 不同等級煙葉中游離氨基酸的含量（mg/g煙樣）
Table 4 Amounts of free amino acids in different
grade tobacco leaves（mg/g tobacco leaves）
氨基酸 雲南烤煙C1F 雲南烤煙C2F 雲南烤煙C1L 雲南烤煙B1F 雲南烤煙B2F 福建烤煙B1F 福建烤煙C1F 四川烤煙C1F 四川烤煙B1F 貴州烤煙C1F 貴州烤煙B1F 貴州烤煙C1L 鄂西白肋中一 鄂西白肋中二
Asp 0.24 0.31 0.60 0.40 0.38 0.37 0.26 0.37 0.26 0.26 0.32 0.35 1.73 1.59
Glu 0.36 0.32 0.21 0.17 0.16 0.11 0.15 0.20 0.30 0.32 0.29 0.25 0.54 0.61
Asn 0.91 0.34 1.50 0.95 0.38 0.18 0.25 0.35 0.32 0.44 0.55 0.48 7.70 7.62
Ser 0.16 0.10 0.18 0.16 0.10 0.12 0.24 0.21 0.19 0.20 0.19 0.15 0.62 0.58
Gln 0.19 0.05 0.22 0.17 0.04 0.06 0.10 0.11 0.10 0.11 0.15 0.10 0.18 0.20
His 0.11 0.02 0.14 0.10 0.06 0.06 0.11 0.09 0.07 0.09 0.08 0.09 0.20 0.22
Gly 0.10 0.09 0.19 0.17 0.07 0.08 0.12 0.15 0.12 0.15 0.13 0.12 0.16 0.19
Thr 0.05 0.05 0.08 0.06 0.05 0.04 0.08 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.19 0.16
Ala 0.65 0.55 0.84 0.69 0.54 0.51 0.65 0.59 0.55 0.48 0.53 0.70 0.57 0.55
Arg 0.29 0.21 0.32 0.28 0.18 0.26 0.32 0.28 0.25 0.33 0.29 0.33 0.48 0.42
Tyr 0.06 0.07 0.06 0.07 0.06 0.05 0.07 0.05 0.06 0.06 0.07 0.06 0.10 0.15
Val 0.10 0.10 0.12 0.11 0.10 0.14 0.15 0.13 0.12 0.15 0.14 0.13 0.21 0.25
Met 0.07 0.07 0.09 0.08 0.06 0.06 0.08 0.08 0.08 0.07 0.09 0.08 0.12 0.13
Phe 0.26 0.12 0.28 0.23 0.10 0.21 0.25 0.21 0.25 0.28 0.30 0.33 0.44 0.59
Pro 1.14 0.83 2.13 1.51 0.69 0.66 1.03 1.23 1.11 1.32 1.18 1.09 0.25 0.35
總量 4.69 3.23 6.96 5.15 2.97 2.91 3.86 4.14 3.86 4.33 4.37 4.31 13.49 13.61
3 結論
本煙葉中游離氨基酸的分析方法採用80%的乙醇作為萃取溶劑，陽離子交換樹脂對提取液進行純化，能夠最大程度地提取煙葉中的游離氨基酸並較好地去除了影響氨基酸測定的雜質，使色譜圖中雜質峰較少；OPA、FMOC聯和柱前衍生使帶氨基和亞氨基基團的氨基酸同時得到測定；良好的梯度洗脫使各個氨基酸峰得到較好的分離，並使定量結果更加可靠。