免疫球蛋白陽離子交換

1. 臨床醫學 醫學

急性腎小球腎炎(acute glomerulonephritis)通常指急性鏈球菌感染後腎小球腎炎(acute poststreptococcal glomerulonephritisAPSGN)，是由A組β溶血性鏈球菌感染後，所引起的免疫復合物沉積在腎小球而致的彌漫性腎小球毛細血管內滲出性增生性炎症病變。臨床表現輕重不一，典型表現為水腫尿少、高血壓預後良好，大多數完全恢復，少數(1%～2%)可遷延不愈而轉為慢性。
1、 病因編輯本段 (一)發病原因能引起急性感染後腎小球腎炎的病原有：

1.β溶血性鏈球菌A組

2.非鏈球菌(包括其他的葡萄球菌鏈球菌革蘭陰性桿菌等)病毒(流感病毒柯薩奇病毒B4EB病毒)肺炎支原體及原蟲等在A組β溶血性鏈球菌中由呼吸道感染所致腎炎的菌株以12型為主少數為13462549型引起腎炎的侵襲率約5%由皮膚感染引起的腎炎則以49型為主少數為25557和60型侵襲率可達25%

(二)發病機制

1.發病機制 腎小球疾病的發生機制十分復雜有多種因素參與免疫機制是其中重要的一環免疫發病機制的研究不僅有其理論價值還可指導疾病防治具有重要的臨床意義細菌感染多是通過抗原-抗體復合物在腎小球沉積後激活補體誘發炎症反應而發病而病毒支原體等則是直接侵襲腎組織而致腎炎關於A組β溶血性鏈球菌感染後導致腎炎的機制一般認為機體對鏈球菌的某些抗原成分(如胞壁的M蛋白或胞質中某些抗原成分)產生抗體形成循環免疫復合物隨血流抵達腎臟並沉積於腎小球基膜進而激活補體,造成腎小球局部免疫病理操作而致病但近年還提出了其他機制有人認為鏈球菌中的某些陽離子抗原先植入於腎小球基膜通過原位復合物方式致病：致腎炎鏈球菌株通過分泌神經氨酸酶改變了機體正常的IgG從而使其具有了抗原性導致抗體產生沉積在腎臟而發病還有人認為鏈球菌抗原與腎小球基膜糖蛋白具有交叉抗原性此少數病例屬腎抗體型腎炎沉積在腎臟的鏈球菌抗原一直不甚清楚原以為是其細胞壁抗原(M蛋白)但在腎小球內未發現M蛋白沉積後發現在患者的腎小球內沉積有內鏈球菌素(endosfrcptosin)腎炎菌株協同蛋白和前吸收抗原(preadsorbing antigen)等鏈球菌成分但是否APSGN是由上述抗原所誘發的免疫機制致病尚未完全肯定

2.病理改變 APSGN的早期腎活檢主要為彌漫性毛細血管內增生性腎小球腎炎光鏡下可見腎小球腫大內皮細胞及系膜細胞增生(稱為毛細血管內增生)中性多形核白細胞和單核細胞在腎小球內浸潤使毛細血管壁狹窄乃至閉塞但毛細血管壁通常無壞死沿毛細血管壁基膜外側偶有不連續的蛋白質性沉積物(駝峰)即沉積的免疫復合物在電鏡下表現為上皮側大塊狀的電子緻密沉積物在少數腎小球可見局限性毛細血管外增生(新月體)但很少有彌漫性新月體形成腎小球之外的血管和腎小管間質區一般正常在遠端小管腔內常見紅細胞可形成紅細胞管型免疫熒光檢查可分系膜型星空型花環型三種在毛細血管襻周圍和系膜區可見IgG顆粒樣沉積常伴有C3和備解素沉積但較少見有G1q和C4沉積血清補體成分的改變和腎小球毛細血管襻明顯的C3備解素的沉積表明補體激活可能主要途徑是替代途徑
2、 症狀體征編輯本段1.典型病例

(1)前驅病史：發病前10天左右常有上呼吸道感染扁桃體炎等鏈球菌前驅感染史;以皮膚膿皰瘡為前驅病史者前驅期稍長約2～4周

(2)水腫：常為最先出現的症狀初期以眼瞼及顏面為主漸下行至四肢呈非凹陷性合並腹水及胸腔積液都極為少見

(3)尿量：尿量減少與水腫平行尿量越少水腫越重少尿標准為學齡兒童每天尿量<400ml學齡前兒童<300ml嬰幼兒<200ml或每天尿量少於250ml/m2;無尿標准為每天尿量<50ml/m2

(4)血尿：疾病初期50%～70%患兒可出現肉眼血尿1～2周後轉為鏡下血尿輕症病人多數無肉眼血尿尿的改變是本病必不可少的臨床表現

(5)高血壓：見於70%的病例不同年齡組高血壓的標准不同：學齡兒童≥17.3/12kPa(130/90mmHg);學齡前期兒童≥16/10.7kPa(120/80mmHg);嬰幼兒≥14.7/79.3kPa(110/70mmHg)為高血壓 (6)其他：部分患者可出現腰痛及尿痛症狀高血壓明顯時常伴有頭暈頭痛惡心嘔吐和納差等

2.嚴重病例 見於患病初期(1周內)除上述表現外還可出現下列之一的臨床表現即為嚴重病例

(1)急性腎功能不全：表現為嚴重少尿甚至無尿血肌酐及尿素氮明顯升高血肌酐≥176µmol/L(2mg/dl)出現高鉀血症及代謝性酸中毒患兒惡心嘔吐乏力呼吸增快水腫加重等

(2)嚴重循環充血：高度水鈉瀦留可引起嚴重循環充血及心衰水腫等表現為明顯水腫持續少尿乃至無尿心慌氣促煩躁不能平卧發紺兩肺啰音心音低鈍心率增快奔馬律和肝臟進行性增大 (3)高血壓腦病：血壓急驟升高達21.3/14.7kPa (160/110mmHg)以上超過腦血管代償收縮功能使腦血流灌注過多而出現腦水腫表現如劇烈頭痛頻繁嘔吐視力模糊乃至失明嚴重神志不清昏迷驚厥等 3.非典型病例 (1)腎外症狀性腎炎：又稱尿輕微改變腎炎雖有典型的鏈球菌感染前驅病史水腫高血壓及血清補體的降低有或者無尿少但尿中往往無蛋白紅細胞及白細胞或呈一過性異常

(2)表現為腎病綜合征的急性腎小球腎炎：蛋白尿明顯的急性腎炎可出現低蛋白血症高脂血症和凹陷性水腫通過尿檢動態觀察及血清補體檢測可與腎炎性腎病綜合征相鑒別

1.臨床特點 典型急性腎小球腎炎診斷並不困難鏈球菌感染後經1～3周無症狀間歇期出現水腫高血壓血尿(可伴有不同程度蛋白尿)再加以血C3的動態變化即可明確診斷

2.實驗室檢查 但確診APSGN則需包括下述3點中的2點：

(1)檢出致病菌：在咽部或皮膚病損處檢出致腎炎的β溶血性鏈球菌

(2)檢出抗體：對鏈球菌成分的抗體有一項或多項呈陽性如ASOanti-DNAaseB抗體anti-Hase抗體anti-ADPNase抗體等為了使診斷的准確率達到90%必須進行多種抗體測試值得注意的是早期使用抗生素治療能阻止上述抗體的產生並使咽部細菌培養為陰性但不能阻止APSGN的發生

(3)補體降低：血清補體C3降低
3、 檢查化驗編輯本段1.尿液分析 尿液改變有很大的個體差異一般表現為：

(1)尿量少而比重較高

(2)常見有肉眼血尿尿液外觀為煙霧狀的咖啡色常伴有紅細胞管型尿沉渣中的紅細胞為畸形

(3)常有蛋白尿但程度不一一般24h尿蛋白定量為0.2～3.0g如果蛋白尿明顯並持續時間較長可發生腎病綜合征

(4)尿中有白細胞和白細胞管型早期尤顯著

(5)多種管型尿：除紅細胞管型白細胞管型外還可有透明管型顆粒管型及透明管型等

2.血液檢查

(1)紅細胞計數及血紅蛋白可稍低系因： ①血容量擴大血液稀釋 ②伴腎功能衰竭者出現促紅細胞生成素減少導致腎性貧血 ③溶血性貧血

(2)白細胞計數可正常或增高此與原發感染灶是否繼續存在有關

(3)血沉多增快1～3月內可恢復正常

3.血生化及腎功能檢查 腎小球濾過率(GFR)呈不同程度下降但腎血漿流量仍可正常因而濾過分數常減少與腎小球功能受累相比腎小管功能相對良好腎濃縮功能多能保持臨床常見一過性氮質血症血中尿素氮肌酐輕度增高伴急性腎功能不全時可出現血中尿素氮肌酐的明顯升高不限水量的患兒可有輕度稀釋性低鈉血症此外病兒還可有高血鉀及代謝性酸中毒血漿蛋白可因血液稀釋而輕度下降在尿蛋白達腎病水平者血清白蛋白下降明顯並可伴一定程度的高脂血症

4.鏈球菌感染的證據 可進行皮膚病灶或咽部拭子細菌培養以發現A組β溶血性鏈球菌或者檢查血清中抗鏈球菌溶血素或酶的抗體抗「O」(ASO)升高見於80%以上呼吸道感染為前驅症狀的病人和50%以膿皰瘡為前驅症狀的病人一般在感染後2～3周開始升高3～5周達高峰半年內恢復正常還可檢測抗脫氧核糖核酸酶B(anti-DNAase B)抗玻璃酸酶(anti-Htase)及抗雙磷酸吡啶核苷酸酶(anti-ADPNase)這些酶活性的增高都是鏈球菌感染的證據Anti-Htasc在皮膚感染時陽性率較高Anti-ADPNase則在呼吸道感染時陽性率高而Anti-ADPNase B則在兩種感染時陽性率都>90%

5.免疫學檢查 血清總補體(CH50)和補體3(C3)水平的下降是診斷急性腎小球腎炎的關鍵但下降水平與病變程度及預後無關;血清γ球蛋白和免疫球蛋白IgG水平常增高;血清補體4(C4)水平正常或輕度降低降低的血清補體3多在1～2月內恢復正常但少數3個月才恢復正常

6.腎活體組織檢查 早期表現為毛細血管內滲出性增生性炎症內皮細胞及系膜細胞增生上皮下大量沉積物並且呈駝峰樣後期以輕度系膜增生為主嚴重病人可出現大量新月體

1.ECG 可表現為低電壓T波低平等改變

2.X線 胸片可發現心影輕度增大;發生嚴重循環充血時可發現肺水腫表現 3.超聲波檢查 可見雙腎正常或彌漫性腫大皮質回聲增強;發生嚴重循環充血時肝臟增大
4、 鑒別診斷編輯本段 由於多種腎臟疾病均可表現為急性腎炎綜合征還有一些腎臟病伴有血C3下降因此需要進行鑒別診斷

1.其他病原體感染後的腎小球腎炎 已知多種病原體感染也可引起腎炎並表現為急性腎炎綜合征可引起增殖性腎炎的病原體有細菌(葡萄球菌肺炎球菌等)病毒(流感病毒EB病毒水痘病毒柯薩基病毒腮腺炎病毒ECHO病毒巨細胞包涵體病毒及乙型肝炎病毒等)肺炎支原體及原蟲等參考病史原發感染灶及其各自特點一般均可區別這些感染後腎炎患者往往C3下降不如APSGN顯著

2.其他原發性腎小球疾患

(1)膜增生性腎炎：起病似急性腎炎但常有顯著蛋白尿血補體C3持續低下病程呈慢性過程必要時行腎活檢鑒別

(2)急進性腎炎：起病與急性腎炎相同常在3個月內病情持續進展惡化血尿高血壓急性腎功能衰竭伴少尿持續不緩解病死率高

(3)IgA腎病：多於上呼吸道感染後1～2天內即以血尿起病通常不伴水腫和高血壓一般無血清補體下降有時有既往多次血尿發作史鑒別困難時需行腎活體組織檢查

(4)原發性腎病綜合征腎炎型：腎炎急性期偶有蛋白尿嚴重達腎病水平者與腎炎性腎病綜合征易於混淆經分析病史補體檢測甚至經一階段隨訪觀察可以區別困難時需行腎活體組織檢查

3.繼發性腎臟疾病 也可以急性腎炎綜合征起病如系統性紅斑狼瘡過敏性紫癜溶血尿毒綜合征壞死性小血管炎Goodpasture綜合征據各病之其他表現可以鑒別

4.急性泌尿系感染或腎盂腎炎 在小兒也可表現有血尿但多有發熱尿路刺激症狀尿中以白細胞為主尿細菌培養陽性可以區別

5.慢性腎炎急性發作 兒童病例較少常有既往腎臟病史發作常於感染後1～2天誘發缺乏間歇期且常有較重貧血持續高血壓腎功能不全有時伴心臟眼底變化尿比重固定B超檢查有時見兩腎體積偏小
5、 並發症編輯本段 急性期重症病例常並發嚴重循環充血高血壓腦病和急性腎功能衰竭常致患兒死亡極少數發展成慢性腎炎等
6、 預防保健編輯本段 根本的預防是防治鏈球菌感染平時應加強鍛煉注意皮膚清潔衛生以減少呼吸道及皮膚感染如一旦感染則應及時徹底治療感染後2～3周時應查尿常規以及時發現異常
7、 治療用葯編輯本段(一)治療腎炎的免疫發病過程涉及多個環節如抗原抗體的形成免疫復合物的形成及多種介質的參與等因此腎炎的治療應針對消除或削弱這些環節目前臨床應用的治療措施有些已取得較好療效如腎上腺皮質激素和環磷醯胺治療微小病變型腎病綜合征有些可能有效;如抗凝治療用於某些腎小球疾病;更多方面還需進行深入研究以找出有效的治療方法

本病主要治療為清除體內殘余病原對症及保護腎功能,防止並發症

1.一般治療

(1)休息：無論病情輕重早期均應卧床休息直至水腫顯著消退血壓正常及肉眼血尿消失通常需要2～3周血沉正常後可上學但尿Addis計數正常前應控制活動量

(2)飲食：急性期宜限制水鹽及蛋白質攝入量一般採用低鹽或無鹽低蛋白飲食用糖提供熱量鹽攝入量控制在1～2g/d水平伴腎功能不全時用優質蛋白質攝入量以0.5g/(kg·d)為宜水腫重且尿少者限水

2.抗生素 主要目的為清除殘余病菌可用青黴素20萬～30萬U/(kg·d)或紅黴素30mg/(kg·d)靜脈滴注治療2周疑有其他病原時可加用其他抗生素對青黴素過敏者可用紅黴素

3.對症治療 包括利尿消腫降壓等

(1)利尿：輕度水腫者可選用氫氯噻嗪(hydrochlorothiazideDHCT)2～3mg/(kg·d)口服尿量增多後加用螺旋內酯(spironolactoneantisterone)2mg/(kg·d)口服口服利尿劑效果差或重度水腫病人可靜脈滴注或肌注呋塞米(furosemide速尿)每次1～2mg/kg還可採用新型利尿合劑即多巴胺和酚妥拉明各0.3～0.5mg/kg呋塞米2mg/kg一起加入10%葡萄糖100～200ml中靜滴利尿效果優於單用呋塞米

(2)降壓：首選硝苯地平(nifedipine心痛定)每次0.25～0.5mg/kg3～4次/d口服或舌下含服如血壓仍不能控制可用尼卡地平(nieardipine佩爾地平perdipine)每次0.5～1mg/kg2次/d;卡托普利(captopril巰甲丙脯氨酸)1～2mg/(kg·d)2～3次/d;哌唑嗪(prazosin)每次0.02～0.05mg/kg3～4次/d口服

4.重症病例治療

(1)急性腎功能不全：急性腎小球腎炎患者多於起病第1～2周尿量減少可有氮質血症以後隨腎臟病變的好轉而尿量增加BUNCr亦隨之降至正常但有少數患兒病變嚴重腎小球毛細血管內血栓形成纖維素樣壞死或上皮細胞增生纖維蛋白沉積很快形成大面積新月體可在短期內導致嚴重少尿甚至無尿腎功能衰竭亦有可能發展為急進性腎炎

①少尿期：維持水電解質及酸鹼平衡加強利尿

A.嚴格控制水分入量：「量出為入」僅補充不顯性失水按400ml/(m2·d)或[嬰兒20ml/(kg·d)幼兒15ml/(kg·d)兒童10ml/(kg·d)]及前一天尿量和異常失水量

每天液量=尿量+不顯性失水-食物代謝和組織分解所產生的內生水

體溫升高1℃按75ml/(m2·d) 增加水補充不顯性失水用不含鈉液體經末梢輸注可用10%～20%葡萄糖經中心靜脈可用30%～50%葡萄糖內生水按100ml/(m2·d)異常丟失包括嘔吐腹瀉胃腸引流等用1/4～1/2張液體補充

每天應注意評估患者含水狀態臨床有無脫水或水腫;每天測體重如入量控制合適體重每天應減少10～20mg/kg血鈉不低於130mmol/L以下血壓穩定

B.熱量和蛋白質入量：供給足夠熱量以減少蛋白質分解早期只給碳水化合物供給葡萄糖3～5mg/(kg·d)靜滴可減少機體自身蛋白質分解和酮體產生情況好轉能口服時應及早給予基礎代謝熱卡[兒童30kcal/(kg·d)嬰兒50kcal/(kg·d)]飲食可給低蛋白低鹽低鉀和低磷食物蛋白質應限制在0.5～1.0mg/(kg·d)為宜且應以優質蛋白為主如雞蛋肉類奶類蛋白為佳為促進蛋白質合成可用苯丙酸諾龍25mg肌注每周1～2次對有高分解狀態或不能口服者可考慮用靜脈高營養

C.高鉀血症的治療：血鉀>6.5mmol/L為危險界限應積極處理如有明顯EKG改變時可予10%葡萄糖酸鈣0.5～1ml/kg靜脈緩慢注射15～30min;或5%NaHCO3 3～5ml/kg靜注或20%葡萄糖(0.5g/kg)加胰島素(0.2U/g葡萄糖)2h滴注經以上治療無效或血K >6.5mmol/L時應考慮透析治療

a.重碳酸鹽：可糾正酸中毒形成細胞外液輕度鹼中毒使鉀由細胞外轉移至細胞內同時也擴大細胞外體積稀釋血鉀濃度可用5%碳酸氫鈉2ml/kg在5min內靜注如未恢復正常15min後可重復1次鈉溶液作用迅速但持續時間短僅維持30～90min

b.葡萄糖酸鈣：鈣可拮抗鉀對心肌的毒性10%葡萄糖酸鈣10ml靜點5min開始起作用可持續1～2min每天可用2～3次但用洋地黃者宜慎用

c.高滲葡萄糖和胰島素：促進鉀進入細胞內每3～4mg葡萄糖配1U胰島素每次用1.5mg/kg糖可暫時降低血鉀1～2mmol/L15min開始起作用可持續12h或更長必要時可重復

以上三種療法在高鉀急救時可單獨或聯合使用有一定療效但不能持久因此在治療同時可開始准備透析

d.陽離子交換樹脂：經以上搶救EKG趨於正常但血鉀仍在5.5～7mmol/L之間可給陽離子交換樹脂口服或灌腸0.3～1mg/(kg·次)此葯易引起便秘可和10%～20%山梨醇混合口服或灌腸山梨醇有滲透腹瀉作用灌腸後30～60min開始起作用,每天重復2～4次也可放在膠囊內吞服陽離子樹脂每吸收1mmol鉀同時釋放出1mmol其他陽離子如鈉應注意鈉瀦留

e.透析：血透或腹透均有效前者作用較快能在1～2h內使血鉀從7.5～8mmol/L降至正常范圍以內而腹透需4～6h降至正常

防治高血鉀要減少機體蛋白質的高分解代謝供給足夠熱卡限制含鉀較高的飲食和葯物及不輸庫存血等

D.低鈉血症：應區分是稀釋性或低鈉性在少尿期前者多見嚴格控制水分入量利尿,多可糾正一般不用高滲鹽進行糾正這會引起容量過大導致心衰低鈉性者當血鈉<120mmol/L且又出現低鈉綜合征時可適當補充3% NaCl 1.2ml/kg可提高血鈉1mmol/L可先給3～6ml/kg可提高2.5～5mmol/L

E.代謝性酸中毒：輕症多不需治療當血HCO3-<12mmol/L時應給予碳酸氫鈉5%碳酸氫鈉1ml/kg可提高HCO3- 1mmol/L給鹼性液可使血容量擴大和誘發低鈣抽搐

F.高血壓心力衰竭及肺水腫：多與血容量過多水中毒有關治療應嚴格限制水分入量限鹽及利尿利尿可用呋塞米2～3mg/(kg·次)2～3次/d如有高血壓腦病可用硝普鈉靜點可將硝普鈉10～20mg加在5%葡萄糖100ml內根據血壓調節滴數1～8µg/(kg·min)使血壓穩定在一定水平擴張血管可用多巴胺及酚妥拉明各10mg加在10%葡萄糖100ml內靜滴1次/d連用7天兩葯合用可擴張腎小動脈改善腎血流量

G.心力衰竭的治療：由於心肌缺氧水腫及少尿對洋地黃制劑非常敏感即使少量應用也易產生中毒應慎用其主要治療應以利尿限鹽限水及擴張血管為主如出現肺水腫除利尿及擴張血管外應加壓給氧可用嗎啡0.1～0.2mg/kg皮下注射放血或止血帶扎四肢必要時透析

H.低鈣抽搐：可靜脈給10%葡萄糖酸鈣10ml1～2次/d可適當加鎮靜劑如安定

②多尿期治療：

A.低鉀血症的矯治：尿量增多鉀從尿中排出易致低鉀可給2～3mmol/(kg·d)口服如低鉀明顯可靜脈補充其濃度一般不超過0.3%用10% KCl 3ml加在100ml液體中隨時檢測血鉀濃度或心電圖改變防止血鉀過高

B.水和鈉的補充：由於利尿水分大量丟失應注意補充但如尿量過多應適當限制水分入量以尿量1/2～2/3為宜補液過多會延長多尿期

C.控制感染：約1/3病人死於感染應積極控制可選擇敏感抗生素但應注意保護腎功能

D.透析治療：早期透析可降低死亡率根據具體情況可選用血透或腹透透析指征：

a.血生化指標：BUN>28.56mmol/L(80mg/dl);Cr>530.4µmol/L;血鉀>6.5mmol/L或心電圖有高鉀表現;CO2CP<12mmol/L

b.臨床有明顯尿毒症症狀少尿2～3天頻繁嘔吐有周圍神經或精神症狀者

c.明顯水鈉瀦留表現

d.化學毒物或葯物中毒

(2)嚴重循環充血：以利尿劑為主伴明顯高血壓時也可試用血管擴張劑如硝普鈉1～2µg/(kg·min)一般不用洋地黃心力衰竭明顯時可小劑量應用毛花苷C(西地蘭)0.01mg/(kg·次)一般1～2次即可不必維持用葯上述治療無效時可用血液濾過血液透析或腹膜透析治療

嚴重循環充血心力衰竭：應卧床休息嚴格限制水鈉攝入盡快利尿降壓

強力利尿劑：呋塞米(速尿)2mg/kg靜注4～6h後可重復如仍無尿可加大劑量至3～4mg/kg患者多於病程第7～10天開始利尿但若繼續無尿BUN 24h內上升7.2～18mmoL/L(20～50mg/dl)或Cr 24h內上升176.8～265.2µmol/L(2～3mg/dl)或有心臟負荷過重或高鉀血症酸中毒不能糾正者應採用透析療法

明顯肺水腫者可予擴血管葯硝普鈉(用法同高血壓腦病)或酚妥拉明0.1～0.2mg/kg加入5%～10%葡萄糖液10～20ml中靜脈緩慢注射以減輕心臟負荷煩躁不安時予鎮靜劑如哌替啶(度冷丁)(1mg/kg)或嗎啡(0.1～0.2mg/kg)皮下注射經觀察此類患者心排血量不低動靜脈血氧差減少射血分數不低故一般不主張用洋地黃制劑經上述治療仍難控制的循環充血可用腹膜透析或血液濾過治療

(3)高血壓腦病：首選硝普鈉(sodium nitroprusside)靜脈滴注劑量為1～5µg/(kg·min)最大量<8µg/(kg·min)需新鮮配製>4h後不宜使用輸液中需避光主要不良反應有惡心嘔吐頭痛肌痙攣血壓過低等也可用二氮嗪(diazoxide)3～5mg/(kg·次)或尼卡地平(佩爾地平)0.5～6µg/(kg·min)靜脈注射對驚厥者可用地西泮(diazepam;安定valium)0.3mg/(kg·次)靜注或苯巴比妥(phenobarbital)5～8mg/(kg·次)肌注治療

5.腎上腺皮質激素治療 一般病人禁用腎上腺皮質激素以免加重水鈉瀦留及高血壓對於持續大量蛋白尿者或臨床病理有慢性化趨勢的患兒可口服潑尼松(prednisone)治療劑量1～2mg/(kg·d)並逐步減量療程以1～2月為宜對於腎活組織檢查有大量新月體的病人可先以甲潑尼龍(甲基潑尼松龍)20～30mg/(kg·次)沖擊治療然後改為潑尼鬆口服治療

6.恢復期治療 在肉眼血尿水腫高血壓消失後可用中葯如六味地黃丸(6g/次3次/d)或白茅根(20g/次煎服)等治療直至鏡下血尿消失

(二)預後

小兒急性腎小球腎炎預後良好大多數可完全恢復急性期死亡主要與嚴重並發症有關絕大多數患兒2～4周內肉眼血尿消失尿量增多水腫消退血壓逐漸恢復殘余少量蛋白尿及鏡下血尿多於6個月內消失少數重症病人可遷延1～3年甚至發展成慢性腎炎或慢性腎功能不全
以上是給你介紹一些醫學知識，希望你對疾病有一定的了解，我是學醫的，醫生在醫院里可能給你解釋不了那麼多，看完上面的介紹後，或許你會懂一些醫學知識。

2. 蛋白質的分離純化技術有哪些

蛋白質的分離純化方法很多，主要有：
（一）根據蛋白質溶解度不同的分離方法
1、蛋白質的鹽析
中性鹽對蛋白質的溶解度有顯著影響，一般在低鹽濃度下隨著鹽濃度升高，蛋白質的溶解度增加，此稱鹽溶；當鹽濃度繼續升高時，蛋白質的溶解度不同程度下降並先後析出，這種現象稱鹽析，將大量鹽加到蛋白質溶液中，高濃度的鹽離子（如硫酸銨的 SO4 和 NH4)有很強的水化力，可奪取蛋白質分子的水化層，使之「失水」，於是蛋白質膠粒凝結並沉澱析出。鹽析時若溶液 pH 在蛋白質等電點則效果更好。由於各種蛋白質分子顆粒大小、親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，因此調節混合蛋白質溶液中的中性鹽濃度可使各種蛋白質分段沉澱。
影響鹽析的因素有：（1）溫度：除對溫度敏感的蛋白質在低溫（4 度）操作外，一般可在室溫中進行。一般溫度低蛋白質溶介度降低。但有的蛋白質（如血紅蛋白、肌紅蛋白、清蛋白）在較高的溫度（25 度）比 0 度時溶解度低，更容易鹽析。（2）pH 值：大多數蛋白質在等電點時在濃鹽溶液中的溶介度最低。（3）蛋白質濃度：蛋白質濃度高時，欲分離的蛋白質常常夾雜著其他蛋白質地一起沉澱出來（共沉現象）。因此在鹽析前血清要加等量生理鹽水稀釋，使蛋白質含量在 2.5-3.0%。蛋白質鹽析常用的中性鹽，主要有硫酸銨、硫酸鎂、硫酸鈉、氯化鈉、磷酸鈉等。 其中應用最多的硫酸銨，它的優點是溫度系數小而溶解度大（25 度時飽和溶液為 4.1M，即 767 克/升；0 度時飽和溶解度為 3.9M，即 676 克/升），在這一溶解度范圍內，許多蛋白質和酶都可以鹽析出來；另外硫酸銨分段鹽析效果也比其他鹽好，不易引起蛋白質變性。硫酸銨溶液的 pH 常在 4.5-5.5 之間，當用其他 pH 值進行鹽析時，需用硫酸或氨水調節。蛋白質在用鹽析沉澱分離後，需要將蛋白質中的鹽除去，常用的辦法是透析，即把蛋白質溶液裝入秀析袋內（常
用的是玻璃紙），用緩沖液進行透析，並不斷的更換緩沖液，因透析所需時間較長，所以最好在低溫中進行。此外也可用葡萄糖凝膠 G-25 或 G-50 過柱的辦法除鹽，所用的時間就比較短。
2、等電點沉澱法
蛋白質在靜電狀態時顆粒之間的靜電斥力最小，因而溶解度也最小，各種蛋白質的等電點有差別，可利用調節溶液的 pH 達到某一蛋白質的等電點使之沉澱，但此法很少單獨使用，可與鹽析法結合用。
3、低溫有機溶劑沉澱法
用與水可混溶的有機溶劑，甲醇，乙醇或丙酮，可使多數蛋白質溶解度降低並析出，此法分辨力比鹽析高，但蛋白質較易變性，應在低溫下進行。
（二）根據蛋白質分子大小的差別的分離方法
1、透析與超濾
透析法是利用半透膜將分子大小不同的蛋白質分開。超濾法是利用高壓力或離心力，強使水和其他小的溶質分子通過半透膜，而蛋白質留在膜上，可選擇不同孔徑的瀘膜截留不同分子量的蛋白質。
2、凝膠過濾法
也稱分子排阻層析或分子篩層析，這是根據分子大小分離蛋白質混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝膠（Sephadex ged）和瓊脂糖凝膠（agarose gel）。
（三）根據蛋白質帶電性質進行分離
蛋白質在不同 pH 環境中帶電性質和電荷數量不同，可將其分開。
1、電泳法
各種蛋白質在同一 pH 條件下，因分子量和電荷數量不同而在電場中的遷移率不同而得以分開。值得重視的是等電聚焦電泳，這是利用一種兩性電解質作為載體，電泳時兩性電解質形成一個由正極到負極逐漸增加的 pH 梯度，當帶一定電荷的蛋白質在其中泳動時，到達各自等電點的 pH 位置就停止，此法可用於分析和制備各種蛋白質。
2、離子交換層析法
離子交換劑有陽離子交換劑（如：羧甲基纖維素；CM-纖維素）和陰離子交換劑（二乙氨基乙基纖維素；DEAE?FONT FACE="宋體" LANG="ZH-CN">纖維素），當被分離的蛋白質溶液流經離子交換層析柱時，帶有與離子交換劑相反電荷的蛋白質被吸附在離子交換劑上，隨後用改變 pH 或離子強度辦法將吸附的蛋白質洗脫下來。
（四）根據配體特異性的分離方法－親和色譜法
親和層析法（aflinity chromatography）是分離蛋白質的一種極為有效的方法，它經常只需經過一步處理即可使某種待提純的蛋白質從很復雜的蛋白質混合物中分離出來，而且純度很高。這種方法是根據某些蛋白質與另一種稱為配體(Ligand）的分子能特異而非共價地結合。其基本原理：蛋白質在組織或細胞中是以復雜的混合物形式存在，每種類型的細胞都含有上千種不同的蛋白質，因此蛋白質的分離（Separation），提純（Purification）和鑒定（Characterization）是生物化學中的重要的一部分，至今還沒的單獨或一套現成的方法能移把任何一種蛋白質
從復雜的混合蛋白質中提取出來，因此往往採取幾種方法聯合使用。

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3. 蛋白質分離方法有哪些，它們的特點各是什麼

1.根據分子大小不同進行分離純化
蛋白質是一種大分子物質,並且不同蛋白質的分子大小不同,因此可以利用一些較簡單的方法使蛋白
質和小分子物質分開,並使蛋白質混合物也得到分離。根據蛋白質分子大小不同進行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等。透析和超濾是分離蛋白質時常用的方法。透析是將待分離的混合物放入半透膜製成的透析袋中,再浸入透析液進行分離。超濾是利用離心力或壓力強行使水和其它小分子通過半透膜,而蛋白質被截留在半透膜上的過程。這兩種方法都可以將蛋白質大分子與以無機鹽為主的小分子分開。它們經常和鹽析、鹽溶方法聯合使用,在進行鹽析或鹽溶後可以利用這兩種方法除去引入的無機鹽。由於超濾過程中,濾膜表面容易被吸附的蛋白質堵塞,以致超濾速度減慢,截流物質的分子量也越來越小。所以在使用超濾方法時要選擇合適的濾膜,也可以選擇切向流過濾得到更理想的效果
離心也是經常和其它方法聯合使用的一種分離蛋白質的方法。當蛋白質和雜質的溶解度不同時可以利用離心的方法將它們分開。例如,在從大米渣中提取蛋白質的實驗中,加入纖維素酶和α-澱粉酶進行預處理後,再用離心的方法將有用物質與分解掉的雜質進行初步分離[3]。使蛋白質在具有密度梯度的介質中離心的方法稱為密度梯度(區帶)離心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根據所需密度和滲透壓的范圍選擇合適的密度梯度。密度梯度離心曾用於純化蘇雲金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白,得到的產品純度高但產量偏低。蔣辰等[6]通過比較不同密度梯度介質的分離效果,利用溴化鈉密度梯度得到了高純度的蘇雲金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白。凝膠過濾也稱凝膠滲透層析,是根據蛋白質分子大小不同分離蛋白質最有效的方法之一。凝膠過濾的原理是當不同蛋白質流經凝膠層析柱時,比凝膠珠孔徑大的分子不能進入珠內網狀結構,而被排阻在凝膠珠之外,隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下運動並最先流出柱外;反之,比凝膠珠孔徑小的分子後流出柱外。目前常用的凝膠有交聯葡聚糖凝膠、聚丙烯醯胺凝膠和瓊脂糖凝膠等。在甘露糖蛋白提純的過程中使用凝膠過濾方法可以得到很好的效果,純度鑒定證明產品為分子量約為32 kDa、成分是多糖∶蛋白質(88∶12)、多糖為甘露糖的單一均勻糖蛋白[1]。凝膠過濾在抗凝血蛋白的提取過程中也被用來除去大多數雜蛋白及小分子的雜質[7]。
2.根據溶解度不同進行分離純化

影響蛋白質溶解度的外部條件有很多,比如溶液的pH值、離子強度、介電常數和溫度等。但在同一條件下,不同的蛋白質因其分子結構的不同而有不同的溶解度,根據蛋白質分子結構的特點,適當地改變外部條件,就可以選擇性地控制蛋白質混合物中某一成分的溶解度,達到分離純化蛋白質的目的。常用的方法有等電點沉澱和pH值調節、蛋白質的鹽溶和鹽析、有機溶劑法、雙水相萃取法、反膠團萃取法等。

等電點沉澱和pH值調節是最常用的方法。每種蛋白質都有自己的等電點,而且在等電點時溶解度最
低;相反,有些蛋白質在一定pH值時很容易溶解。因而可以通過調節溶液的pH值來分離純化蛋白質。王洪新等[8]研究茶葉蛋白質提取過程發現,pH值為時茶葉蛋白提取效果最好,提取率達到36·8%,初步純化得率為91·0%。李殿寶[9]在從葵花脫脂粕中提取蛋白質時將蛋白溶液的pH值調到3~4,使目標蛋白於等電點沉澱出來。等電點沉澱法還應用於葡萄籽中蛋白質的提取。李鳳英等[10]測得葡萄籽蛋白質的等電點為3·8。他們利用鹼溶法提取葡萄籽蛋白質,得到了最佳的提取工藝為:以1×10-5mol·L-1的NaOH溶液,按1∶5的料液比,在40℃攪拌40 min,葡萄籽蛋白質提取率達73·78%。另外還可以利用鹼法提取大米蛋白,其持水性、吸油性和起泡性等均優於酶法提取[11]。利用酸法提取得到的鰱魚魚肉蛋白質無腥味、色澤潔白,蛋白質產率高達90%[12]。
蛋白質的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質溶解度的現象,其中,增加蛋白質溶解度的現象稱鹽溶,反之為鹽析。應當指出,同樣濃度的二價離子中性鹽,如MgCl2、(NH4)2SO4對蛋白質溶解度影響的效果,要比一價離子中性鹽如NaCl、NH4Cl大得多。在葡萄籽蛋白提取工藝中除了可以利用鹼溶法還可以利用鹽溶法來提取蛋白質,其最佳提取工藝是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃攪拌提取30min,蛋白質提取率為57·25%[10]。鹽析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸銨鹽析法,其中硫酸銨鹽析法廣泛應用於生產。由於硫酸銨在水中呈酸性,為防止其對蛋白質的破壞,應用氨水調pH值至中性。為防止不同分子之間產生共沉澱現象,蛋白質樣品的含量一般控制在0·2% ~2·0%。利用鹽溶和鹽析對蛋白質進行提純後,通常要使用透析或者凝膠過濾的方法除去中性鹽[13]。

有機溶劑提取法的原理是:與水互溶的有機溶劑(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白質在水中的溶解度顯著降低;而且在一定溫度、pH值和離子強度下,引起蛋白質沉澱的有機溶劑的濃度不同,因此,控制有機溶劑的濃度可以分離純化蛋白質。例如,在冰浴中磁力攪拌下,在4℃預冷的培養液中緩慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,從而純化冰核蛋白[14]。由於在室溫下,有機溶劑不僅能引起蛋白質的沉澱,而且伴隨著變性。因此,通常要將有機溶劑冷卻,然後在不斷攪拌下加入有機溶劑防止局部濃度過高,蛋白質變性問題就可以很大程度上得到解決。對於一些和脂質結合比較牢固或分子中極性側鏈較多、不溶於水的蛋白質,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑提取,它們有一定的親水性和較強的親脂性,是理想的提取液。冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由Cohn於1949年提出,用於制備丙種球蛋白。冷乙醇法也是目前WHO規程和中國生物製品規程推薦的方法,不僅解析度高、提純效果好、可同時分離多種血漿成分,而且有抑菌、清除和滅病毒的作用[15]。

萃取是分離和提純有機化合物常用的一種方法,而雙水相萃取和反膠團萃取可以用來分離蛋白質。雙水相萃取技術(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指親水性聚合物水溶液在一定條件下形成雙水相,由於被分離物在兩相中分配的不同,便可實現分離,被廣泛用於生物化學、細胞生物學和生物化工等領域的產品分離和提取。此方法可以在室溫環境下進行,雙水相中的聚合物還可以提高蛋白質的穩定性,收率較高。對於細胞內的蛋白質,需要先對細胞進行有效破碎。目的蛋白常分布在上相並得到濃縮,細胞碎片等固體物分布在下相中。採用雙水相系統濃縮目的蛋白,受聚合物分子量及濃度、溶液pH值、離子強度、鹽類型及濃度的影響[16]。

反膠團萃取法是利用反膠團將蛋白質包裹其中而達到提取蛋白質的目的。反膠團是當表面活性劑
在非極性有機溶劑溶解時自發聚集而形成的一種納米尺寸的聚集體。這種方法的優點是萃取過程中蛋
白質因位於反膠團的內部而受到反膠團的保護。程世賢等[17]就利用反膠團萃取法提取了大豆中的蛋白質。

3.根據電荷不同進行分離純化
根據蛋白質的電荷即酸鹼性質不同分離蛋白質的方法有電泳和離子交換層析兩類。
在外電場的作用下,帶電顆粒(如不處於等電點狀態的蛋白質分子)將向著與其電性相反的電極移動,這
種現象稱為電泳。聚丙烯醯胺電泳是一種以聚丙烯醯胺為介質的區帶電泳,常用於分離蛋白質。它的優點是設備簡單、操作方便、樣品用量少。等電聚焦是一種高解析度的蛋白質分離技術,也可以用於蛋白質的等電點測定。利用等電聚焦技術分離蛋白質混合物是在具有pH梯度的介質中進行的。在外電場作用下各種蛋白質將移向並聚焦在等於其等電點的pH值梯度處形成一個窄條帶。孫臣忠等[18]研究了聚丙烯醯胺電泳、等電聚焦電泳和等速提純電泳在分離純化蛋白質中的應用。結果發現,聚丙烯醯胺電泳的條帶解析度低,加樣量不高;等電聚焦電泳解析度最高,可以分離同種蛋白的亞成分,加樣量最小;等速提純電泳區帶解析度較高,可將樣品分成單一成分,加樣量最大。

離子交換層析(Ion exchange chromatography,IEC)是以離子交換劑為固定相,依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。離子交換層析中,基質由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的為陰離子交換樹脂;反之為陽離子交換樹脂。離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化。當蛋白質處於不同的pH值條件下,其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質,被留在層析柱上,通過提高洗脫液中的鹽濃度,將吸附在層析柱上的蛋白質洗脫下來,其中結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質,結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。李全宏等[19]將離子交換層析應用於濃縮蘋果汁中蛋白質的提純。另外,離子交換層析還用於抗凝血蛋白的提取[7]。

4. 利用對配體的特異親和力進行分離純化
親和層析是利用蛋白質分子對其配體分子特有的識別能力(即生物學親和力)建立起來的一種有效的純化方法。它通常只需一步處理即可將目的蛋白質從復雜的混合物中分離出來,並且純度相當高。應用親和層析須了解純化物質的結構和生物學特性,以便設計出最好的分離條件。近年來,親和層析技術被廣泛應用於靶標蛋白尤其是疫苗的分離純化,特別是在融合蛋白的分離純化上,親和層析更是起到了舉足輕重的作用,因為融合蛋白具有特異性結合能力[20]。親和層析在基因工程亞單位疫苗的分離純化中應用也相當廣泛[21]。范繼業等[22]利用殼聚糖親和層析提取的抑肽酶比活達到71 428 BAEE·mg-1,純化回收率達到62·5%。該方法成本較低,吸附劑價格低廉、機械強度高、抗污染能力較強、非特異性吸附較小、可反復使用、適用性廣,產品質量穩定。

4. 做蛋白純化的人主要去哪工作

蛋白質的分離純化方法
2.1根據分子大小不同進行分離純化
蛋白質是一種大分子物質,並且不同蛋白質的分子大小不同,因此可以利用一些較簡單的方法使蛋白
質和小分子物質分開,並使蛋白質混合物也得到分離。根據蛋白質分子大小不同進行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等。透析和超濾是分離蛋白質時常用的方法。透析是將待分離的混合物放入半透膜製成的透析袋中,再浸入透析液進行分離。超濾是利用離心力或壓力強行使水和其它小分子通過半透膜,而蛋白質被截留在半透膜上的過程。這兩種方法都可以將蛋白質大分子與以無機鹽為主的小分子分開。它們經常和鹽析、鹽溶方法聯合使用,在進行鹽析或鹽溶後可以利用這兩種方法除去引入的無機鹽。由於超濾過程中,濾膜表面容易被吸附的蛋白質堵塞,以致超濾速度減慢,截流物質的分子量也越來越小。所以在使用超濾方法時要選擇合適的濾膜,也可以選擇切向流過濾得到更理想的效果
離心也是經常和其它方法聯合使用的一種分離蛋白質的方法。當蛋白質和雜質的溶解度不同時可以利用離心的方法將它們分開。例如,在從大米渣中提取蛋白質的實驗中,加入纖維素酶和α-澱粉酶進行預處理後,再用離心的方法將有用物質與分解掉的雜質進行初步分離[3]。使蛋白質在具有密度梯度的介質中離心的方法稱為密度梯度(區帶)離心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根據所需密度和滲透壓的范圍選擇合適的密度梯度。密度梯度離心曾用於純化蘇雲金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白,得到的產品純度高但產量偏低。蔣辰等[6]通過比較不同密度梯度介質的分離效果,利用溴化鈉密度梯度得到了高純度的蘇雲金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白。凝膠過濾也稱凝膠滲透層析,是根據蛋白質分子大小不同分離蛋白質最有效的方法之一。凝膠過濾的原理是當不同蛋白質流經凝膠層析柱時,比凝膠珠孔徑大的分子不能進入珠內網狀結構,而被排阻在凝膠珠之外,隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下運動並最先流出柱外;反之,比凝膠珠孔徑小的分子後流出柱外。目前常用的凝膠有交聯葡聚糖凝膠、聚丙烯醯胺凝膠和瓊脂糖凝膠等。在甘露糖蛋白提純的過程中使用凝膠過濾方法可以得到很好的效果,純度鑒定證明產品為分子量約為32 kDa、成分是多糖∶蛋白質(88∶12)、多糖為甘露糖的單一均勻糖蛋白[1]。凝膠過濾在抗凝血蛋白的提取過程中也被用來除去大多數雜蛋白及小分子的雜質[7]。
2.2 根據溶解度不同進行分離純化

影響蛋白質溶解度的外部條件有很多,比如溶液的pH值、離子強度、介電常數和溫度等。但在同一條件下,不同的蛋白質因其分子結構的不同而有不同的溶解度,根據蛋白質分子結構的特點,適當地改變外部條件,就可以選擇性地控制蛋白質混合物中某一成分的溶解度,達到分離純化蛋白質的目的。常用的方法有等電點沉澱和pH值調節、蛋白質的鹽溶和鹽析、有機溶劑法、雙水相萃取法、反膠團萃取法等。

等電點沉澱和pH值調節是最常用的方法。每種蛋白質都有自己的等電點,而且在等電點時溶解度最
低;相反,有些蛋白質在一定pH值時很容易溶解。因而可以通過調節溶液的pH值來分離純化蛋白質。王洪新等[8]研究茶葉蛋白質提取過程發現,pH值為時茶葉蛋白提取效果最好,提取率達到36·8%,初步純化得率為91·0%。李殿寶[9]在從葵花脫脂粕中提取蛋白質時將蛋白溶液的pH值調到3~4,使目標蛋白於等電點沉澱出來。等電點沉澱法還應用於葡萄籽中蛋白質的提取。李鳳英等[10]測得葡萄籽蛋白質的等電點為3·8。他們利用鹼溶法提取葡萄籽蛋白質,得到了最佳的提取工藝為:以1×10-5mol·L-1的NaOH溶液,按1∶5的料液比,在40℃攪拌40 min,葡萄籽蛋白質提取率達73·78%。另外還可以利用鹼法提取大米蛋白,其持水性、吸油性和起泡性等均優於酶法提取[11]。利用酸法提取得到的鰱魚魚肉蛋白質無腥味、色澤潔白,蛋白質產率高達90%[12]。
蛋白質的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質溶解度的現象,其中,增加蛋白質溶解度的現象稱鹽溶,反之為鹽析。應當指出,同樣濃度的二價離子中性鹽,如MgCl2、(NH4)2SO4對蛋白質溶解度影響的效果,要比一價離子中性鹽如NaCl、NH4Cl大得多。在葡萄籽蛋白提取工藝中除了可以利用鹼溶法還可以利用鹽溶法來提取蛋白質,其最佳提取工藝是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃攪拌提取30min,蛋白質提取率為57·25%[10]。鹽析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸銨鹽析法,其中硫酸銨鹽析法廣泛應用於生產。由於硫酸銨在水中呈酸性,為防止其對蛋白質的破壞,應用氨水調pH值至中性。為防止不同分子之間產生共沉澱現象,蛋白質樣品的含量一般控制在0·2% ~2·0%。利用鹽溶和鹽析對蛋白質進行提純後,通常要使用透析或者凝膠過濾的方法除去中性鹽[13]。

有機溶劑提取法的原理是:與水互溶的有機溶劑(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白質在水中的溶解度顯著降低;而且在一定溫度、pH值和離子強度下,引起蛋白質沉澱的有機溶劑的濃度不同,因此,控制有機溶劑的濃度可以分離純化蛋白質。例如,在冰浴中磁力攪拌下,在4℃預冷的培養液中緩慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,從而純化冰核蛋白[14]。由於在室溫下,有機溶劑不僅能引起蛋白質的沉澱,而且伴隨著變性。因此,通常要將有機溶劑冷卻,然後在不斷攪拌下加入有機溶劑防止局部濃度過高,蛋白質變性問題就可以很大程度上得到解決。對於一些和脂質結合比較牢固或分子中極性側鏈較多、不溶於水的蛋白質,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑提取,它們有一定的親水性和較強的親脂性,是理想的提取液。冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由Cohn於1949年提出,用於制備丙種球蛋白。冷乙醇法也是目前WHO規程和中國生物製品規程推薦的方法,不僅解析度高、提純效果好、可同時分離多種血漿成分,而且有抑菌、清除和滅病毒的作用[15]。

萃取是分離和提純有機化合物常用的一種方法,而雙水相萃取和反膠團萃取可以用來分離蛋白質。雙水相萃取技術(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指親水性聚合物水溶液在一定條件下形成雙水相,由於被分離物在兩相中分配的不同,便可實現分離,被廣泛用於生物化學、細胞生物學和生物化工等領域的產品分離和提取。此方法可以在室溫環境下進行,雙水相中的聚合物還可以提高蛋白質的穩定性,收率較高。對於細胞內的蛋白質,需要先對細胞進行有效破碎。目的蛋白常分布在上相並得到濃縮,細胞碎片等固體物分布在下相中。採用雙水相系統濃縮目的蛋白,受聚合物分子量及濃度、溶液pH值、離子強度、鹽類型及濃度的影響[16]。

反膠團萃取法是利用反膠團將蛋白質包裹其中而達到提取蛋白質的目的。反膠團是當表面活性劑
在非極性有機溶劑溶解時自發聚集而形成的一種納米尺寸的聚集體。這種方法的優點是萃取過程中蛋
白質因位於反膠團的內部而受到反膠團的保護。程世賢等[17]就利用反膠團萃取法提取了大豆中的蛋白質。

2.3 根據電荷不同進行分離純化
根據蛋白質的電荷即酸鹼性質不同分離蛋白質的方法有電泳和離子交換層析兩類。
在外電場的作用下,帶電顆粒(如不處於等電點狀態的蛋白質分子)將向著與其電性相反的電極移動,這
種現象稱為電泳。聚丙烯醯胺電泳是一種以聚丙烯醯胺為介質的區帶電泳,常用於分離蛋白質。它的優點是設備簡單、操作方便、樣品用量少。等電聚焦是一種高解析度的蛋白質分離技術,也可以用於蛋白質的等電點測定。利用等電聚焦技術分離蛋白質混合物是在具有pH梯度的介質中進行的。在外電場作用下各種蛋白質將移向並聚焦在等於其等電點的pH值梯度處形成一個窄條帶。孫臣忠等[18]研究了聚丙烯醯胺電泳、等電聚焦電泳和等速提純電泳在分離純化蛋白質中的應用。結果發現,聚丙烯醯胺電泳的條帶解析度低,加樣量不高;等電聚焦電泳解析度最高,可以分離同種蛋白的亞成分,加樣量最小;等速提純電泳區帶解析度較高,可將樣品分成單一成分,加樣量最大。

離子交換層析(Ion exchange chromatography,IEC)是以離子交換劑為固定相,依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。離子交換層析中,基質由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的為陰離子交換樹脂;反之為陽離子交換樹脂。離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化。當蛋白質處於不同的pH值條件下,其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質,被留在層析柱上,通過提高洗脫液中的鹽濃度,將吸附在層析柱上的蛋白質洗脫下來,其中結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質,結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。李全宏等[19]將離子交換層析應用於濃縮蘋果汁中蛋白質的提純。另外,離子交換層析還用於抗凝血蛋白的提取[7]。

2.4 利用對配體的特異親和力進行分離純化
親和層析是利用蛋白質分子對其配體分子特有的識別能力(即生物學親和力)建立起來的一種有效的純化方法。它通常只需一步處理即可將目的蛋白質從復雜的混合物中分離出來,並且純度相當高。應用親和層析須了解純化物質的結構和生物學特性,以便設計出最好的分離條件。近年來,親和層析技術被廣泛應用於靶標蛋白尤其是疫苗的分離純化,特別是在融合蛋白的分離純化上,親和層析更是起到了舉足輕重的作用,因為融合蛋白具有特異性結合能力[20]。親和層析在基因工程亞單位疫苗的分離純化中應用也相當廣泛[21]。范繼業等[22]利用殼聚糖親和層析提取的抑肽酶比活達到71 428 BAEE·mg-1,純化回收率達到62·5%。該方法成本較低,吸附劑價格低廉、機械強度高、抗污染能力較強、非特異性吸附較小、可反復使用、適用性廣,產品質量穩定。
3 展望
在實際工作中,很難用單一方法實現蛋白質的分離純化,往往要綜合幾種方法才能提純出一種蛋白質。
理想的蛋白質分離提純方法,要求產品純度和總回收率越高越好,但實際上兩者難以兼顧,因此,考慮分離
提純的條件和方法時,不得不在兩者之間作適當的選擇;一般情況下,科研上更多地選擇前者,工業生產上
更多地選擇後者。因此,每當需要提純某種蛋白質時,首先要明確分離純化的目的和蛋白質的性質,以便選擇最佳的分離純化方法,從而得到理想的效果。今後,蛋白質提純技術的發展將不斷促進對蛋白質性質的研究,同時對蛋白質性質的研究也將反過來提高蛋白質分離純化技術,兩者的互相促進終將會對生命科學的進步作出重大貢獻。

5. 必慧龍的主要產品系列

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多位學者、名師慎選材料精心調配，更配合先進科技製造，確保營養素組織不流失的絕佳方法。領先國際技術,利用果膠軟糖糖心，外表覆上薄薄的脆皮糖衣，光滑的表麵包裹膏單位營養素，讓脆皮軟糖同時擁有皮脆心軟的特殊口感，，以及果膠軟糖的柔軟滑潤。全程12天18道手續，能將多種營養素包覆在脆皮糖衣中，不僅可以高單位膏比例添加營養素，更可以保持營養素在生產過程中，不會因高溫高熱的生產過程而被破壞。 酵素也叫做酶，是催化劑，一種特殊的蛋白質，具有催化作用。代謝的合成、分解需籍由酵素的參與才能完成。本產品可催化分解食物，有利於人體對食物進行消化和吸收，補充營養，增強機體的抗病能力。
木瓜酵素功效：
其含特殊木瓜酵素,幫助代謝分解腸內蛋白質,促進排便. 酵素與細胞代謝極為密切，它有神奇的催化活力，可以把糖轉變為酒精。生命體借著酵素的催化作用與調節，有效地完成生理活動，若人體細胞內缺少酵素，則生命體則出現異狀。 木瓜酵素可分解蛋白質、糖類、及脂肪，其分解脂肪的能力可以說是木瓜最大的特色。細菌或黴菌等原始生命也都無法分解脂肪。 木瓜酵素不論是在酸性、鹼性、甚至是中性的環境中發揮作用，不像其他的酵素僅能在單一環境中發生作用與活性。 木瓜酵素能強力分解食物或體內衰敗的細胞組織或老廢物，就象是感應器一樣，有強力的選擇性來分辨出老舊、壞死、受傷、異常的細胞蛋白質加以分解，但不會對體內正常細胞產生任何作用。換而言之，它對癌症有效。 木瓜酵素可以幫助消化，可消化比本身重 35 倍的蛋白質。現代食物因過度烹煮、化學農葯、油炸食物和微波所造成較難消化的情況，而木瓜中其他的成分都有助於改善此缺失。 木瓜酵素具有解毒，根據法國研究，它可化解白喉或破傷風的毒，甚至可以將化膿症的膿液溶解，再逐漸排出體外。對燒燙傷、褥瘡及頑固的異位性皮膚炎均可發揮療效。 日本醫學博士中川菜一指出木瓜酵素可改善平衡失調的機能，抑制過剩、補充不足、改善體質。它有分解脂肪的作用亦可分解血管內的中性脂肪和膽固醇。此外，分解糖的作用能夠提高糖的代謝，它可重建血管、健康血液，使全身血液循環順暢，恢復青春。 乳酸菌之王就是比菲德氏菌，可以平衡腸道內菌種生態，促進食慾與維持消化道機能，並可以排便順暢。源自美國活性菌種：穩定性佳，高度保存乳酸菌活性。
益生菌的作用
1、維持腸道菌群的平衡
益生菌中的雙歧桿菌特有的F6PPK酶（果糖-6-磷酸解酮酶）,在代謝途徑中可把葡萄糖分解為醋酸和乳酸，降低腸道中的PH，抑制一些腐敗菌和致病菌的生長，從而維持腸道菌群的平衡。
2、提高免疫力
它通過免疫刺激和免疫調節作用促進巨噬細胞活力;通過增強T、B淋巴細胞對抗原刺激的反應性,發揮特異性免疫作用;活化腸黏膜內的相關淋巴組織,使sIgA (分泌性免疫球蛋白)生物合成增加,提高消化道黏膜免疫功能;誘導淋巴細胞和巨噬細胞產生細胞因子,發揮免疫調節作用,從而增強機體免疫功能。
3、抗腫瘤作用
乾酪乳桿菌、乳酸乳桿菌、奶油鏈球菌及各種雙歧桿菌的菌體或酸奶上清液均具有相當強的抗腫瘤活性。研究人員在給處理組大鼠同時皮下注射氧化偶氮基甲烷(AOM)及喂飼雙歧桿菌的凍干培養物後發現，與僅注射AOM 不喂飼雙歧桿菌的對照組相比，處理組大鼠結腸癌的發生率、腫瘤生長時結腸腫瘤的體積以及癌組織的多形性明顯減少。
4、延緩機體衰老
嗜酸乳桿菌、乳酸菌等益生菌代謝產生的乳酸可抑制腸內有害細菌產生的腐敗物，使機體衰老的過程變得緩慢。益生菌可調節宿主免疫系統而起到一定的抗衰老作用,包括腸道黏膜免疫系統、體液免疫系統及細胞免疫系統。此外，在衰老過程中機體的氧化應激明顯增強,氧化應激不僅會造成大分子物質如蛋白質、核酸等氧化損傷,還會對免疫系統產生有害的影響。而益生菌的抗氧化作用可能有利於維持機體免疫系統的平衡,提高免疫調控能力從而延長壽命。
5、預防心血管疾病
膽固醇含量的增加是誘發冠狀動脈硬化,冠心病的重要原因。益生菌能有效減低血清中膽固醇的含量,從而預防和減少了心血管疾病的發生。益生菌主要是通過同化作用來降低膽固醇的含量,乳酸菌還有抑制膽固醇合成酶的活性,從而減少體內膽固醇的合成的作用,雙歧桿菌則可減少膽固醇的體內再吸收。此外肥胖也會增加心血管疾病發生的風險，美國的肥胖率在持續增長，從1980年的15%增長到2006年的68.6%，肥胖嚴重威脅到了人類的健康。益生菌能通過改變腸道細菌的組成來影響減肥，增加重量的減少。以此來有效預防心血管疾病的發生。 木寡糖主要由木二糖、木三糖組成，具有低熱、穩定、安全無毒的理化性能，不能被動物本身的消化酶所消化，但到達腸道後可作為有益微生物雙歧桿菌的食 物，但卻不能被病原微生物利用，從而促進有益微生物的繁殖和抑制有害微生物的生長。
木寡糖的作用
1、減少有毒發酵產物及有害細菌酶的產生
人體體內和活體外糞便培養試驗表明，攝入3周內，機體內即可減少44.6%有毒發酵產物和40.9%的有害細菌酶的產生。
2、抑制病原菌和腹瀉
低聚木糖對病原菌有較強的吸附力，如大腸桿菌、腸炎門氏菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜水氣單胞菌等都能吸附到低聚木糖上，由於低聚木糖不被腸道中的消化酶所降解，可攜帶附著的病原菌通過腸道排出體外，從而防止疾病在腸道中集群，達到防止腹瀉的目的。
3、防止便秘
雙歧桿菌利用低聚木糖，產生大量的短鏈脂肪酸；能刺激腸道蠕動，增加糞便濕潤度，並保持一定的滲透壓，從而防止便秘發生。
4、保護肝臟功能
攝入低聚木糖，可減少有毒代謝產物形成，大大減少了肝臟分解毒素的負擔。
5、降低血清膽固醇
攝入低聚木糖，持續2周至3個月，總血清膽固醇可降低20—50dl。還可提高女性血清中多密度脂蛋白膽固醇占總膽固醇的比率。
6、降低血壓
研究表明，46個高血脂患者攝入低聚木糖持續5周後，其心臟舒張壓平均下降了799.8Pa（6mmHg）。結果顯示，人的心臟舒張壓的高低與其糞便中雙歧桿菌占總菌數的比率呈明顯的負相關關系。
7、能增強機體免疫力，抗癌。
經大量試驗結果表明，雙歧桿菌在腸道內大量繁殖能夠起到抗癌作用。這種抗癌作用歸功於雙歧桿菌的細胞、細胞壁成分和胞外分泌物，使機體免疫力提高。
8、具有良好的配伍性
研究表明，日常飲食中攝取少量的低聚木糖，便能體現出保健效果，當低聚木糖與鈣同時攝入時，它不但不會影響機體對鈣的吸收，反而能起促進作用，試驗結果表明，任意攝取2%低聚木糖水溶液，7日後機體對Ca的保留率提高了21%。
9、能促使機體生成多種營養物質，包括維生素B1、B2、B6、B12、煙酸和葉酸。
10、預防和保護牙齒齲變，抑制口腔病菌的滋生。
齲齒是由於口腔微生物特別是鏈球菌侵蝕而引起的，低聚木糖不是這些口腔微生物的合適作用底物，因此不會引起牙齒齲變，從而抑制口腔病菌的生長。 純植物提取膳食纖維，是一種不能被人體消化的碳水化合物，具有吸水、粘滯、結合有機化合物、陽離子交換、細菌發酵等多種作用。促進腸道蠕動，減少脹氣 改善便秘。
兒童天然酵素的主要成份膳食纖維，是一種不易被消化的食物營養素，主要來自於植物的細胞壁，包含纖維素、半纖維素、樹脂、果膠及木質素等。
膳食纖維的主要特性：1.吸水作用。膳食纖維有很強的吸水能力或與水結合的能力。此作用可使腸道中糞便的體積增大，加快其轉運速度，減少其中有害物質接觸腸壁的時間。 2.粘滯作用。一些膳食纖維具有很強的黏滯性，能形成粘液型溶液，包括果膠、樹膠、海藻多糖等。 結合有機化合物作用。膳食纖維具有結合膽酸和膽固醇的作用。 陽離子交換作用。其作用與糖醛酸的羧基有關，可在胃腸內結合無機鹽，如鉀、鈉、鐵等陽離子形成膳食纖維復合物，影響其吸收。 細菌發酵作用。膳食纖維在腸道易被細菌酵解，其中可溶性纖維可完全被細菌酵解，而不溶性膳食纖維則不易被酵解。而酵解後產生的短鏈脂肪酸如乙酯酸、丙酯酸和丁酯酸均可作為腸道細胞和細菌的能量來源。 膳食纖維的主要功效： 防治便秘：膳食纖維體積大，可促進腸蠕動、減少食物在腸道中停留時間，其中的水份不容易被吸收。另一方面，膳食纖維在大腸內經細菌發酵，直接吸收纖維中的水份，使大便變軟，產生通便作用。 利於減肥：一般肥胖人大都與食物中熱能攝入增加或體力活動減少有關。而提高膳食纖維含量，可使攝入的熱能減少，在腸道內營養的消化吸收也下降，最終使體內脂肪消耗而起減肥作用。橘寒天中的膳食纖維遇水膨脹200-250倍既可以使人產生輕微的飽腹感，減少過多熱量的吸收。又可以包覆多餘糖分和油脂隨同腸道內的老舊沉積廢物一同排出體外。可以說是目前較有效的最安全的減肥方法。蔬菜中含大量膳食纖維。 預防結腸和直腸癌：這兩種癌的發生主要與致癌物質在腸道內停留時間長，和腸壁長期接觸有關。增加膳食中纖維含量，使致癌物質濃度相對降低，加上膳食纖維有刺激腸蠕動作用，致癌物質與腸壁接觸時間大大縮短。四、防治痔瘡：痔瘡的發生是因為大便秘結而使血液長期阻滯與瘀積所引 起的。由於膳食纖維的通便作用，可降低肛門周圍的壓力，使血流通暢，從而起防治痔瘡的作用。 降低血脂，預防冠心病：由於膳食纖維中有些成分如果膠可結合膽固醇，木質素可結合膽酸，使其直接從糞便中排出，從而消耗體內的膽固醇來補充膽汁中被消耗的膽固醇，由此降低了膽固醇，從而有預防冠心病的作用。 改善糖尿病症狀：膳食纖維中的果膠可延長食物在腸內的停留時間、降低葡萄糖的吸收速度，使進餐後血糖不會急劇上升，有利於糖尿病病情的改善。 改善口腔及牙齒功能：現代人由於食物越來越精，越柔軟，使用口腔肌肉牙齒的機會越來越少，因此，牙齒脫落，齲齒出現的情況越來越多。而增加膳食纖維素，自然增加了使用口腔肌肉牙齒咀嚼的機會，長期下去則會使口腔得到保健，功能得以改善。 防治膽結石：膽結石的形成與膽汁膽固醇含量過高有關，由於膳食纖維可結合膽固醇，促進膽汁的分泌、循環。因而可預防膽結石的形成。有人每天給病人增加20－30克的穀皮纖維，一月後即可發現膽結石縮小，這與膽汁流動通暢有關。 預防婦女乳腺癌：據流行病學發現，乳腺癌的發生與膳食中高脂肪、高糖、高肉類及低膳食纖維攝入有關。因為體內過多的脂肪促進某些激素的合成，形成激素之間的不平衡，使乳房內激素水平上升所造成。所以酵素纖維可以預防和改善婦女乳泉癌。 從5,000毫升的新鮮生牛乳萃取出最接近母乳成分的乳漿蛋白10克。萃取出富含多種活性免疫因子，以確保在人體內的高吸收率以及功效，在短期內可重啟免疫系統。有效預防及保護嬰幼兒，減少生病機會，提高嬰幼兒抵抗疾病的能力。有效改善過敏，體質虛弱。
黃金乳漿蛋白與母乳有九成相同萃取自天然無污染的新鮮乳漿，以專利技術去除酪蛋白、乳糖、脂肪、灰質、水分後，從5,000毫升的新鮮生牛乳萃取出最接近母乳成分的乳漿蛋白10克。萃取出來的是具有生物活性(bio-active)的蛋白質，以確保在人體內的高吸收率以及功效。這些特殊挑選的蛋白質是人體內重要物質GSH榖胱甘肽(榖胱甘肽/乳鐵蛋白/乳球蛋白/乳白蛋白/免疫球蛋白)的最佳來源，能快速補充每日流失的GSH，維持理想濃度。 根據研究結果顯示，黃金乳漿一個月，可增加體內GSH濃度高達35.5%，對於免疫機能差的人，如：嬰幼兒、老年人、身體虛弱的人，效果尤其明顯。
黃金乳漿的重要物質：榖胱甘肽/乳鐵蛋白/乳白蛋白/血清白蛋白/免疫球蛋白
榖胱甘肽：存在於幾乎身體的每一個細胞。谷胱甘肽能幫助保持正常的免疫系統的功能，並具有抗氧化作用和整合解毒作用。不僅能消除人體自由基，還可以提高人體免疫力。谷胱甘肽維護健康，抗衰老，在老人遲緩化的細胞上所發揮的功效比年輕人大。還可以保護血紅蛋白不受過氧化氫氧化、自由基等氧化從而使它持續正常發揮運輸氧的能力。紅細胞中部分血紅蛋白在過氧化氫等氧化劑的作用下，其中二價鐵氧化為三價鐵，使血紅蛋白轉變為高鐵血紅蛋白，從而失去了帶氧能力。
乳鐵蛋白：母乳中極重要的成份，可調節鐵的吸收，抑制細菌的生長，促進有益菌如雙歧桿菌的生長，幫助嬰幼兒建立良好的消化道微生物環境，以及治療嬰幼兒腹瀉等的問題，此外對於抵抗發炎、抵抗病毒，對數種癌症有治療作用。
乳白蛋白：乳漿蛋白中含量第二高的蛋白質。含有許多的必須胺基酸，能結合鈣質，並能幫助睡眠。其很強的抗病毒能力，已經被廣泛用於預防手足口病中。
血清白蛋白：亦含有大量的必須胺基酸，能夠保護細胞預防氧化，減少自體免疫疾病的發生，減少突變的機率，約占乳漿蛋白的5-10%。
免疫球蛋白：對初生兒提供免疫促進效果，經過公認對新生兒有防病作用，約占乳漿蛋白的10-15%。
乳漿蛋白是GSH(榖胱甘肽)的重要來源
乳漿蛋白除了含有以上諸種優質蛋白，讓嬰幼兒在生長過程中得到豐富的營養以及保護外，更重要的，乳漿蛋白也是細胞內GSH的主要來源。GSH這個分子是所有的孩子出生時細胞內就有的免疫物質，後來因為環境的污染、葯物的殘留、或細菌的感染，而造成GSH的消耗。母乳中的乳漿蛋白是GSH最佳的來源，幫助孩童在生長過程中得到應有的補充，不至於缺乏而造成疾病。
在經過特殊技術濃縮後，使嬰幼兒容易吸收，得到像喝母乳一般的益處！乳漿蛋白濃縮物與一般嬰幼兒乳品不同在於第一，兩者所含的蛋白質種類、蛋白質含量，皆與實際的母乳類似；其次，它的蛋白質有著最原始的型態。因為母乳是未經加工的天然食物，有著人體容易吸收的特性，這樣的特性往往會在乳製品的加工中被破壞，造成不易吸收的缺點。但是乳漿蛋白濃縮物是以特殊的專利技術製造，保留了最原始的蛋白質型態，容易被腸胃吸收，就像母乳一樣具有腸胃吸收的特性。 吸收率最高的天然植物鈣粉
海藻鈣產於愛爾蘭西南沿海的大西洋，為純凈無污染的海域海藻，富含鈣質及人體必需74種礦物質與微量元素，利用歐洲先進的技術提取，粉沫細度達3000目以上，溶解度高易吸收。
① 由於海藻鈣的蜂窩型多孔狀結構，緩沖效果極佳。並提高人體消化吸收能力而且中和胃酸的效果顯著。
② 海藻鈣的蜂窩型多孔狀結構，容易在腸胃中迅速溶解和離子化，因此消化吸收率與生體利用率較高。鈣在胃中溶解離子化後，主要在小腸中被吸收，因此胃部pH環境中的離子化機率越高，鈣的吸收率也就越高。(空腹狀態下，胃的pH值為1.5-2，吸收食物後達到2.5左右)。
③ 胃部的pH值在1.5的情況下，海藻鈣離子化率最高可達到96%此時，消化吸收率與生體利用率亦最高。
④ 富含天然鎂(Mg)：可提高鈣的體內吸收率。維他命D3： 提高在小腸內鈣的吸收率。酪蛋白磷酸肽(CPP)：使小腸下部的鈣維持可溶性狀態進而促進吸收。
腦黃金 聰明的脂肪酸－DHA / ARA海藻DHA是屬於植物性脂肪酸，天然無污染、腥味比較淡，口感較好；EPA含量無或極低。海藻油也是唯一獲得美國食品與葯品管理局認可的兒童DHA補充劑來源。所以在嬰幼兒、孕婦選擇海藻DHA產品為好。
增進大腦細胞之發育在大腦皮質中，DHA是神經傳導細胞的主要成份，亦是細胞膜形成的主要成份。
DHA與胎兒發育
胎兒在母體中即開始累積DHA於大腦中，其中以產前三個月及出生後三個月中累積速度最快，而胎兒之DHA是來自母體所供給的營養，而出生後，嬰兒則需由飲食中攝取，新生兒若喂予母乳則會比喂予嬰兒奶粉者得到更多的DHA，使得寶寶更聰明。充分地提高記憶及學習能力。
消炎抗過敏
由於DHA抑制發炎前驅物質的形成，所以有消炎及抗過敏作用。降低血脂肪、預防心臟血管疾病。
玉米黃素
玉米黃素是維生素A的前軀物，同樣對人體眼睛的水晶體、視網膜及黃斑部有重要功能，它一樣能過濾紫外線的藍光譜，避免自由基的傷害。我們常聽人說多吃枸杞有明目的功效，正因枸杞子中含有大量的玉米黃素，可集中在黃斑部，達成護眼效果。達到預防假性近視跟維持眼部的視力效果。
藍莓
提煉出豐富的花青素，研究上發現這些花青素可以減緩視力的喪失，預防或是延緩眼睛相關的疾病，像是視網膜黃斑變性疾病、白內障、近視、遠視、眼睛乾燥和感染，特別是和視網膜相關的疾病。藍莓含有特別的抗氧化劑，稱類胡蘿卜素(黃體素、玉米黃素等)，黃酮類化合物(像是蘆丁、槲皮素等等)，也含有像是維他命C、維他命E和維他命A、硒、鋅、磷，這些都是有益於眼睛視力的健康。

6. 對生物制葯工藝這門課的評價。100字左右。謝謝各位！

名詞解釋：
1， 錯流過濾與親和錯流過濾
2， 多級錯流萃取與多級逆流萃取
3， 萃取與反萃取
4， 萃取因素與分離因素
5， 鹽析
6， 全排阻，全滲入
7， 類分離與分級分離
8， 吸附分離
9， 親和純化
10， 凝聚與絮凝
11， 重結晶
問答題：
為什麼要進行生物材料預處理
萃取溶劑的原則
陰離子交換樹脂的平衡與再生方法
單級，多級萃取過程（課本P136~137）

一、 蛋白質分離方法
1.根據分子大小不同進行分離純化
蛋白質是一種大分子物質,並且不同蛋白質的分子大小不同,因此可以利用一些較簡單的方法使蛋白質和小分子物質分開,並使蛋白質混合物也得到分離。根據蛋白質分子大小不同進行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等。透析和超濾是分離蛋白質時常用的方法。透析是將待分離的混合物放入半透膜製成的透析袋中,再浸入透析液進行分離。超濾是利用離心力或壓力強行使水和其它小分子通過半透膜,而蛋白質被截留在半透膜上的過程。這兩種方法都可以將蛋白質大分子與以無機鹽為主的小分子分開。它們經常和鹽析、鹽溶方法聯合使用,在進行鹽析或鹽溶後可以利用這兩種方法除去引入的無機鹽。由於超濾過程中,濾膜表面容易被吸附的蛋白質堵塞,以致超濾速度減慢,截流物質的分子量也越來越小。所以在使用超濾方法時要選擇合適的濾膜,也可以選擇切向流過濾得到更理想的效果
離心也是經常和其它方法聯合使用的一種分離蛋白質的方法。當蛋白質和雜質的溶解度不同時可以利用離心的方法將它們分開。
2.根據溶解度不同進行分離純化
影響蛋白質溶解度的外部條件有很多,比如溶液的pH值、離子強度、介電常數和溫度等。但在同一條件下,不同的蛋白質因其分子結構的不同而有不同的溶解度,根據蛋白質分子結構的特點,適當地改變外部條件,就可以選擇性地控制蛋白質混合物中某一成分的溶解度,達到分離純化蛋白質的目的。常用的方法有等電點沉澱和pH值調節、蛋白質的鹽溶和鹽析、有機溶劑法、雙水相萃取法、反膠團萃取法等。

等電點沉澱和pH值調節是最常用的方法。每種蛋白質都有自己的等電點,而且在等電點時溶解度最低;相反,有些蛋白質在一定pH值時很容易溶解。因而可以通過調節溶液的pH值來分離純化蛋白質。王洪新等[8]研究茶葉蛋白質提取過程發現,pH值為時茶葉蛋白提取效果最好,提取率達到36•8%,初步純化得率為91•0%。李殿寶[9]在從葵花脫脂粕中提取蛋白質時將蛋白溶液的pH值調到3~4,使目標蛋白於等電點沉澱出來。等電點沉澱法還應用於葡萄籽中蛋白質的提取。李鳳英等[10]測得葡萄籽蛋白質的等電點為3•8。他們利用鹼溶法提取葡萄籽蛋白質,得到了最佳的提取工藝為:以1×10-5mol•L-1的NaOH溶液,按1∶5的料液比,在40℃攪拌40 min,葡萄籽蛋白質提取率達73•78%。另外還可以利用鹼法提取大米蛋白,其持水性、吸油性和起泡性等均優於酶法提取[11]。利用酸法提取得到的鰱魚魚肉蛋白質無腥味、色澤潔白,蛋白質產率高達90%[12]。
蛋白質的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質溶解度的現象,其中,增加蛋白質溶解度的現象稱鹽溶,反之為鹽析。應當指出,同樣濃度的二價離子中性鹽,如MgCl2、(NH4)2SO4對蛋白質溶解度影響的效果,要比一價離子中性鹽如NaCl、NH4Cl大得多。在葡萄籽蛋白提取工藝中除了可以利用鹼溶法還可以利用鹽溶法來提取蛋白質,其最佳提取工藝是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃攪拌提取30min,蛋白質提取率為57•25%[10]。鹽析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸銨鹽析法,其中硫酸銨鹽析法廣泛應用於生產。由於硫酸銨在水中呈酸性,為防止其對蛋白質的破壞,應用氨水調pH值至中性。為防止不同分子之間產生共沉澱現象,蛋白質樣品的含量一般控制在0•2% ~2•0%。利用鹽溶和鹽析對蛋白質進行提純後,通常要使用透析或者凝膠過濾的方法除去中性鹽[13]。

有機溶劑提取法的原理是:與水互溶的有機溶劑(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白質在水中的溶解度顯著降低;而且在一定溫度、pH值和離子強度下,引起蛋白質沉澱的有機溶劑的濃度不同,因此,控制有機溶劑的濃度可以分離純化蛋白質。例如,在冰浴中磁力攪拌下,在4℃預冷的培養液中緩慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,從而純化冰核蛋白[14]。由於在室溫下,有機溶劑不僅能引起蛋白質的沉澱,而且伴隨著變性。因此,通常要將有機溶劑冷卻,然後在不斷攪拌下加入有機溶劑防止局部濃度過高,蛋白質變性問題就可以很大程度上得到解決。對於一些和脂質結合比較牢固或分子中極性側鏈較多、不溶於水的蛋白質,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑提取,它們有一定的親水性和較強的親脂性,是理想的提取液。冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由Cohn於1949年提出,用於制備丙種球蛋白。冷乙醇法也是目前WHO規程和中國生物製品規程推薦的方法,不僅解析度高、提純效果好、可同時分離多種血漿成分,而且有抑菌、清除和滅病毒的作用[15]。

萃取是分離和提純有機化合物常用的一種方法,而雙水相萃取和反膠團萃取可以用來分離蛋白質。雙水相萃取技術(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指親水性聚合物水溶液在一定條件下形成雙水相,由於被分離物在兩相中分配的不同,便可實現分離,被廣泛用於生物化學、細胞生物學和生物化工等領域的產品分離和提取。此方法可以在室溫環境下進行,雙水相中的聚合物還可以提高蛋白質的穩定性,收率較高。對於細胞內的蛋白質,需要先對細胞進行有效破碎。目的蛋白常分布在上相並得到濃縮,細胞碎片等固體物分布在下相中。採用雙水相系統濃縮目的蛋白,受聚合物分子量及濃度、溶液pH值、離子強度、鹽類型及濃度的影響[16]。

反膠團萃取法是利用反膠團將蛋白質包裹其中而達到提取蛋白質的目的。反膠團是當表面活性劑在非極性有機溶劑溶解時自發聚集而形成的一種納米尺寸的聚集體。這種方法的優點是萃取過程中蛋白質因位於反膠團的內部而受到反膠團的保護。程世賢等[17]就利用反膠團萃取法提取了大豆中的蛋白質。

3.根據電荷不同進行分離純化
根據蛋白質的電荷即酸鹼性質不同分離蛋白質的方法有電泳和離子交換層析兩類。
在外電場的作用下,帶電顆粒(如不處於等電點狀態的蛋白質分子)將向著與其電性相反的電極移動,這種現象稱為電泳。聚丙烯醯胺電泳是一種以聚丙烯醯胺為介質的區帶電泳,常用於分離蛋白質。它的優點是設備簡單、操作方便、樣品用量少。等電聚焦是一種高解析度的蛋白質分離技術,也可以用於蛋白質的等電點測定。利用等電聚焦技術分離蛋白質混合物是在具有pH梯度的介質中進行的。在外電場作用下各種蛋白質將移向並聚焦在等於其等電點的pH值梯度處形成一個窄條帶。孫臣忠等[18]研究了聚丙烯醯胺電泳、等電聚焦電泳和等速提純電泳在分離純化蛋白質中的應用。結果發現,聚丙烯醯胺電泳的條帶解析度低,加樣量不高;等電聚焦電泳解析度最高,可以分離同種蛋白的亞成分,加樣量最小;等速提純電泳區帶解析度較高,可將樣品分成單一成分,加樣量最大。

離子交換層析(Ion exchange chromatography,IEC)是以離子交換劑為固定相,依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。離子交換層析中,基質由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的為陰離子交換樹脂;反之為陽離子交換樹脂。離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化。當蛋白質處於不同的pH值條件下,其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質,被留在層析柱上,通過提高洗脫液中的鹽濃度,將吸附在層析柱上的蛋白質洗脫下來,其中結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質,結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。李全宏等[19]將離子交換層析應用於濃縮蘋果汁中蛋白質的提純。另外,離子交換層析還用於抗凝血蛋白的提取[7]。

4. 利用對配體的特異親和力進行分離純化
親和層析是利用蛋白質分子對其配體分子特有的識別能力(即生物學親和力)建立起來的一種有效的純化方法。它通常只需一步處理即可將目的蛋白質從復雜的混合物中分離出來,並且純度相當高。應用親和層析須了解純化物質的結構和生物學特性,以便設計出最好的分離條件。近年來,親和層析技術被廣泛應用於靶標蛋白尤其是疫苗的分離純化,特別是在融合蛋白的分離純化上,親和層析更是起到了舉足輕重的作用,因為融合蛋白具有特異性結合能力[20]。親和層析在基因工程亞單位疫苗的分離純化中應用也相當廣泛[21]。范繼業等[22]利用殼聚糖親和層析提取的抑肽酶比活達到71 428 BAEE•mg-1,純化回收率達到62•5%。該方法成本較低,吸附劑價格低廉、機械強度高、抗污染能力較強、非特異性吸附較小、可反復使用、適用性廣,產品質量穩定。

7. 蛋白質的分離方法

1.根據分子大小不同進行分離純化
蛋白質是一種大分子物質,並且不同蛋白質的分子大小不同,因此可以利用一些較簡單的方法使蛋白質和小分子物質分開,並使蛋白質混合物也得到分離。根據蛋白質分子大小不同進行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等。透析和超濾是分離蛋白質時常用的方法。透析是將待分離的混合物放入半透膜製成的透析袋中,再浸入透析液進行分離。超濾是利用離心力或壓力強行使水和其它小分子通過半透膜,而蛋白質被截留在半透膜上的過程。這兩種方法都可以將蛋白質大分子與以無機鹽為主的小分子分開。它們經常和鹽析、鹽溶方法聯合使用,在進行鹽析或鹽溶後可以利用這兩種方法除去引入的無機鹽。由於超濾過程中,濾膜表面容易被吸附的蛋白質堵塞,以致超濾速度減慢,截流物質的分子量也越來越小。所以在使用超濾方法時要選擇合適的濾膜,也可以選擇切向流過濾得到更理想的效果
離心也是經常和其它方法聯合使用的一種分離蛋白質的方法。當蛋白質和雜質的溶解度不同時可以利用離心的方法將它們分開。例如,在從大米渣中提取蛋白質的實驗中,加入纖維素酶和α-澱粉酶進行預處理後,再用離心的方法將有用物質與分解掉的雜質進行初步分離[3]。使蛋白質在具有密度梯度的介質中離心的方法稱為密度梯度(區帶)離心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根據所需密度和滲透壓的范圍選擇合適的密度梯度。密度梯度離心曾用於純化蘇雲金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白,得到的產品純度高但產量偏低。蔣辰等[6]通過比較不同密度梯度介質的分離效果,利用溴化鈉密度梯度得到了高純度的蘇雲金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白。凝膠過濾也稱凝膠滲透層析,是根據蛋白質分子大小不同分離蛋白質最有效的方法之一。凝膠過濾的原理是當不同蛋白質流經凝膠層析柱時,比凝膠珠孔徑大的分子不能進入珠內網狀結構,而被排阻在凝膠珠之外,隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下運動並最先流出柱外;反之,比凝膠珠孔徑小的分子後流出柱外。目前常用的凝膠有交聯葡聚糖凝膠、聚丙烯醯胺凝膠和瓊脂糖凝膠等。在甘露糖蛋白提純的過程中使用凝膠過濾方法可以得到很好的效果,純度鑒定證明產品為分子量約為32 kDa、成分是多糖∶蛋白質(88∶12)、多糖為甘露糖的單一均勻糖蛋白[1]。凝膠過濾在抗凝血蛋白的提取過程中也被用來除去大多數雜蛋白及小分子的雜質[7]。

2.根據溶解度不同進行分離純化
影響蛋白質溶解度的外部條件有很多,比如溶液的pH值、離子強度、介電常數和溫度等。但在同一條件下,不同的蛋白質因其分子結構的不同而有不同的溶解度,根據蛋白質分子結構的特點,適當地改變外部條件,就可以選擇性地控制蛋白質混合物中某一成分的溶解度,達到分離純化蛋白質的目的。常用的方法有等電點沉澱和pH值調節、蛋白質的鹽溶和鹽析、有機溶劑法、雙水相萃取法、反膠團萃取法等。

等電點沉澱和pH值調節是最常用的方法。每種蛋白質都有自己的等電點,而且在等電點時溶解度最低;相反,有些蛋白質在一定pH值時很容易溶解。因而可以通過調節溶液的pH值來分離純化蛋白質。王洪新等[8]研究茶葉蛋白質提取過程發現,pH值為時茶葉蛋白提取效果最好,提取率達到36·8%,初步純化得率為91·0%。李殿寶[9]在從葵花脫脂粕中提取蛋白質時將蛋白溶液的pH值調到3~4,使目標蛋白於等電點沉澱出來。等電點沉澱法還應用於葡萄籽中蛋白質的提取。李鳳英等[10]測得葡萄籽蛋白質的等電點為3·8。他們利用鹼溶法提取葡萄籽蛋白質,得到了最佳的提取工藝為:以1×10-5mol·L-1的NaOH溶液,按1∶5的料液比,在40℃攪拌40 min,葡萄籽蛋白質提取率達73·78%。另外還可以利用鹼法提取大米蛋白,其持水性、吸油性和起泡性等均優於酶法提取[11]。利用酸法提取得到的鰱魚魚肉蛋白質無腥味、色澤潔白,蛋白質產率高達90%[12]。
蛋白質的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質溶解度的現象,其中,增加蛋白質溶解度的現象稱鹽溶,反之為鹽析。應當指出,同樣濃度的二價離子中性鹽,如MgCl2、(NH4)2SO4對蛋白質溶解度影響的效果,要比一價離子中性鹽如NaCl、NH4Cl大得多。在葡萄籽蛋白提取工藝中除了可以利用鹼溶法還可以利用鹽溶法來提取蛋白質,其最佳提取工藝是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃攪拌提取30min,蛋白質提取率為57·25%[10]。鹽析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸銨鹽析法,其中硫酸銨鹽析法廣泛應用於生產。由於硫酸銨在水中呈酸性,為防止其對蛋白質的破壞,應用氨水調pH值至中性。為防止不同分子之間產生共沉澱現象,蛋白質樣品的含量一般控制在0·2% ~2·0%。利用鹽溶和鹽析對蛋白質進行提純後,通常要使用透析或者凝膠過濾的方法除去中性鹽[13]。

有機溶劑提取法的原理是:與水互溶的有機溶劑(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白質在水中的溶解度顯著降低;而且在一定溫度、pH值和離子強度下,引起蛋白質沉澱的有機溶劑的濃度不同,因此,控制有機溶劑的濃度可以分離純化蛋白質。例如,在冰浴中磁力攪拌下,在4℃預冷的培養液中緩慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,從而純化冰核蛋白[14]。由於在室溫下,有機溶劑不僅能引起蛋白質的沉澱,而且伴隨著變性。因此,通常要將有機溶劑冷卻,然後在不斷攪拌下加入有機溶劑防止局部濃度過高,蛋白質變性問題就可以很大程度上得到解決。對於一些和脂質結合比較牢固或分子中極性側鏈較多、不溶於水的蛋白質,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑提取,它們有一定的親水性和較強的親脂性,是理想的提取液。冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由Cohn於1949年提出,用於制備丙種球蛋白。冷乙醇法也是目前WHO規程和中國生物製品規程推薦的方法,不僅解析度高、提純效果好、可同時分離多種血漿成分,而且有抑菌、清除和滅病毒的作用[15]。

萃取是分離和提純有機化合物常用的一種方法,而雙水相萃取和反膠團萃取可以用來分離蛋白質。雙水相萃取技術(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指親水性聚合物水溶液在一定條件下形成雙水相,由於被分離物在兩相中分配的不同,便可實現分離,被廣泛用於生物化學、細胞生物學和生物化工等領域的產品分離和提取。此方法可以在室溫環境下進行,雙水相中的聚合物還可以提高蛋白質的穩定性,收率較高。對於細胞內的蛋白質,需要先對細胞進行有效破碎。目的蛋白常分布在上相並得到濃縮,細胞碎片等固體物分布在下相中。採用雙水相系統濃縮目的蛋白,受聚合物分子量及濃度、溶液pH值、離子強度、鹽類型及濃度的影響[16]。

反膠團萃取法是利用反膠團將蛋白質包裹其中而達到提取蛋白質的目的。反膠團是當表面活性劑在非極性有機溶劑溶解時自發聚集而形成的一種納米尺寸的聚集體。這種方法的優點是萃取過程中蛋白質因位於反膠團的內部而受到反膠團的保護。程世賢等[17]就利用反膠團萃取法提取了大豆中的蛋白質。

3.根據電荷不同進行分離純化
根據蛋白質的電荷即酸鹼性質不同分離蛋白質的方法有電泳和離子交換層析兩類。
在外電場的作用下,帶電顆粒(如不處於等電點狀態的蛋白質分子)將向著與其電性相反的電極移動,這種現象稱為電泳。聚丙烯醯胺電泳是一種以聚丙烯醯胺為介質的區帶電泳,常用於分離蛋白質。它的優點是設備簡單、操作方便、樣品用量少。等電聚焦是一種高解析度的蛋白質分離技術,也可以用於蛋白質的等電點測定。利用等電聚焦技術分離蛋白質混合物是在具有pH梯度的介質中進行的。在外電場作用下各種蛋白質將移向並聚焦在等於其等電點的pH值梯度處形成一個窄條帶。孫臣忠等[18]研究了聚丙烯醯胺電泳、等電聚焦電泳和等速提純電泳在分離純化蛋白質中的應用。結果發現,聚丙烯醯胺電泳的條帶解析度低,加樣量不高;等電聚焦電泳解析度最高,可以分離同種蛋白的亞成分,加樣量最小;等速提純電泳區帶解析度較高,可將樣品分成單一成分,加樣量最大。

離子交換層析(Ion exchange chromatography,IEC)是以離子交換劑為固定相,依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。離子交換層析中,基質由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有正電荷的為陰離子交換樹脂;反之為陽離子交換樹脂。離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化。當蛋白質處於不同的pH值條件下,其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質,被留在層析柱上,通過提高洗脫液中的鹽濃度,將吸附在層析柱上的蛋白質洗脫下來,其中結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質,結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。李全宏等[19]將離子交換層析應用於濃縮蘋果汁中蛋白質的提純。另外,離子交換層析還用於抗凝血蛋白的提取[7]。

4. 利用對配體的特異親和力進行分離純化
親和層析是利用蛋白質分子對其配體分子特有的識別能力(即生物學親和力)建立起來的一種有效的純化方法。它通常只需一步處理即可將目的蛋白質從復雜的混合物中分離出來,並且純度相當高。應用親和層析須了解純化物質的結構和生物學特性,以便設計出最好的分離條件。近年來,親和層析技術被廣泛應用於靶標蛋白尤其是疫苗的分離純化,特別是在融合蛋白的分離純化上,親和層析更是起到了舉足輕重的作用,因為融合蛋白具有特異性結合能力[20]。親和層析在基因工程亞單位疫苗的分離純化中應用也相當廣泛[21]。范繼業等[22]利用殼聚糖親和層析提取的抑肽酶比活達到71 428 BAEE·mg-1,純化回收率達到62·5%。該方法成本較低,吸附劑價格低廉、機械強度高、抗污染能力較強、非特異性吸附較小、可反復使用、適用性廣,產品質量穩定。

8. 蛋白質分離方法有哪些，它們的特點各是什麼

1.根據分子大小不同進行分離純化 蛋白質是一種大分子物質,並且不同蛋白質的分子大小不同,因此可以利用一些較簡單的方法使蛋白 質和小分子物質分開,並使蛋白質混合物也得到分離.根據蛋白質分子大小不同進行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等.透析和超濾是分離蛋白質時常用的方法.透析是將待分離的混合物放入半透膜製成的透析袋中,再浸入透析液進行分離.超濾是利用離心力或壓力強行使水和其它小分子通過半透膜,而蛋白質被截留在半透膜上的過程.這兩種方法都可以將蛋白質大分子與以無機鹽為主的小分子分開.它們經常和鹽析、鹽溶方法聯合使用,在進行鹽析或鹽溶後可以利用這兩種方法除去引入的無機鹽.由於超濾過程中,濾膜表面容易被吸附的蛋白質堵塞,以致超濾速度減慢,截流物質的分子量也越來越小.所以在使用超濾方法時要選擇合適的濾膜,也可以選擇切向流過濾得到更理想的效果 離心也是經常和其它方法聯合使用的一種分離蛋白質的方法.當蛋白質和雜質的溶解度不同時可以利用離心的方法將它們分開.例如,在從大米渣中提取蛋白質的實驗中,加入纖維素酶和α-澱粉酶進行預處理後,再用離心的方法將有用物質與分解掉的雜質進行初步分離[3].使蛋白質在具有密度梯度的介質中離心的方法稱為密度梯度(區帶)離心.常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度.可以根據所需密度和滲透壓的范圍選擇合適的密度梯度.密度梯度離心曾用於純化蘇雲金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白,得到的產品純度高但產量偏低.蔣辰等[6]通過比較不同密度梯度介質的分離效果,利用溴化鈉密度梯度得到了高純度的蘇雲金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白.凝膠過濾也稱凝膠滲透層析,是根據蛋白質分子大小不同分離蛋白質最有效的方法之一.凝膠過濾的原理是當不同蛋白質流經凝膠層析柱時,比凝膠珠孔徑大的分子不能進入珠內網狀結構,而被排阻在凝膠珠之外,隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下運動並最先流出柱外;反之,比凝膠珠孔徑小的分子後流出柱外.目前常用的凝膠有交聯葡聚糖凝膠、聚丙烯醯胺凝膠和瓊脂糖凝膠等.在甘露糖蛋白提純的過程中使用凝膠過濾方法可以得到很好的效果,純度鑒定證明產品為分子量約為32 kDa、成分是多糖∶蛋白質(88∶12)、多糖為甘露糖的單一均勻糖蛋白[1].凝膠過濾在抗凝血蛋白的提取過程中也被用來除去大多數雜蛋白及小分子的雜質[7]. 2.根據溶解度不同進行分離純化 影響蛋白質溶解度的外部條件有很多,比如溶液的pH值、離子強度、介電常數和溫度等.但在同一條件下,不同的蛋白質因其分子結構的不同而有不同的溶解度,根據蛋白質分子結構的特點,適當地改變外部條件,就可以選擇性地控制蛋白質混合物中某一成分的溶解度,達到分離純化蛋白質的目的.常用的方法有等電點沉澱和pH值調節、蛋白質的鹽溶和鹽析、有機溶劑法、雙水相萃取法、反膠團萃取法等. 等電點沉澱和pH值調節是最常用的方法.每種蛋白質都有自己的等電點,而且在等電點時溶解度最 低;相反,有些蛋白質在一定pH值時很容易溶解.因而可以通過調節溶液的pH值來分離純化蛋白質.王洪新等[8]研究茶葉蛋白質提取過程發現,pH值為時茶葉蛋白提取效果最好,提取率達到36·8%,初步純化得率為91·0%.李殿寶[9]在從葵花脫脂粕中提取蛋白質時將蛋白溶液的pH值調到3~4,使目標蛋白於等電點沉澱出來.等電點沉澱法還應用於葡萄籽中蛋白質的提取.李鳳英等[10]測得葡萄籽蛋白質的等電點為3·8.他們利用鹼溶法提取葡萄籽蛋白質,得到了最佳的提取工藝為:以1×10-5mol·L-1的NaOH溶液,按1∶5的料液比,在40℃攪拌40 min,葡萄籽蛋白質提取率達73·78%.另外還可以利用鹼法提取大米蛋白,其持水性、吸油性和起泡性等均優於酶法提取[11].利用酸法提取得到的鰱魚魚肉蛋白質無腥味、色澤潔白,蛋白質產率高達90%[12]. 蛋白質的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質溶解度的現象,其中,增加蛋白質溶解度的現象稱鹽溶,反之為鹽析.應當指出,同樣濃度的二價離子中性鹽,如MgCl2、(NH4)2SO4對蛋白質溶解度影響的效果,要比一價離子中性鹽如NaCl、NH4Cl大得多.在葡萄籽蛋白提取工藝中除了可以利用鹼溶法還可以利用鹽溶法來提取蛋白質,其最佳提取工藝是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃攪拌提取30min,蛋白質提取率為57·25%[10].鹽析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸銨鹽析法,其中硫酸銨鹽析法廣泛應用於生產.由於硫酸銨在水中呈酸性,為防止其對蛋白質的破壞,應用氨水調pH值至中性.為防止不同分子之間產生共沉澱現象,蛋白質樣品的含量一般控制在0·2% ~2·0%.利用鹽溶和鹽析對蛋白質進行提純後,通常要使用透析或者凝膠過濾的方法除去中性鹽[13]. 有機溶劑提取法的原理是:與水互溶的有機溶劑(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白質在水中的溶解度顯著降低;而且在一定溫度、pH值和離子強度下,引起蛋白質沉澱的有機溶劑的濃度不同,因此,控制有機溶劑的濃度可以分離純化蛋白質.例如,在冰浴中磁力攪拌下,在4℃預冷的培養液中緩慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,從而純化冰核蛋白[14].由於在室溫下,有機溶劑不僅能引起蛋白質的沉澱,而且伴隨著變性.因此,通常要將有機溶劑冷卻,然後在不斷攪拌下加入有機溶劑防止局部濃度過高,蛋白質變性問題就可以很大程度上得到解決.對於一些和脂質結合比較牢固或分子中極性側鏈較多、不溶於水的蛋白質,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑提取,它們有一定的親水性和較強的親脂性,是理想的提取液.冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由Cohn於1949年提出,用於制備丙種球蛋白.冷乙醇法也是目前WHO規程和中國生物製品規程推薦的方法,不僅解析度高、提純效果好、可同時分離多種血漿成分,而且有抑菌、清除和滅病毒的作用[15]. 萃取是分離和提純有機化合物常用的一種方法,而雙水相萃取和反膠團萃取可以用來分離蛋白質.雙水相萃取技術(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指親水性聚合物水溶液在一定條件下形成雙水相,由於被分離物在兩相中分配的不同,便可實現分離,被廣泛用於生物化學、細胞生物學和生物化工等領域的產品分離和提取.此方法可以在室溫環境下進行,雙水相中的聚合物還可以提高蛋白質的穩定性,收率較高.對於細胞內的蛋白質,需要先對細胞進行有效破碎.目的蛋白常分布在上相並得到濃縮,細胞碎片等固體物分布在下相中.採用雙水相系統濃縮目的蛋白,受聚合物分子量及濃度、溶液pH值、離子強度、鹽類型及濃度的影響[16]. 反膠團萃取法是利用反膠團將蛋白質包裹其中而達到提取蛋白質的目的.反膠團是當表面活性劑 在非極性有機溶劑溶解時自發聚集而形成的一種納米尺寸的聚集體.這種方法的優點是萃取過程中蛋 白質因位於反膠團的內部而受到反膠團的保護.程世賢等[17]就利用反膠團萃取法提取了大豆中的蛋白質. 3.根據電荷不同進行分離純化 根據蛋白質的電荷即酸鹼性質不同分離蛋白質的方法有電泳和離子交換層析兩類. 在外電場的作用下,帶電顆粒(如不處於等電點狀態的蛋白質分子)將向著與其電性相反的電極移動,這 種現象稱為電泳.聚丙烯醯胺電泳是一種以聚丙烯醯胺為介質的區帶電泳,常用於分離蛋白質.它的優點是設備簡單、操作方便、樣品用量少.等電聚焦是一種高解析度的蛋白質分離技術,也可以用於蛋白質的等電點測定.利用等電聚焦技術分離蛋白質混合物是在具有pH梯度的介質中進行的.在外電場作用下各種蛋白質將移向並聚焦在等於其等電點的pH值梯度處形成一個窄條帶.孫臣忠等[18]研究了聚丙烯醯胺電泳、等電聚焦電泳和等速提純電泳在分離純化蛋白質中的應用.結果發現,聚丙烯醯胺電泳的條帶解析度低,加樣量不高;等電聚焦電泳解析度最高,可以分離同種蛋白的亞成分,加樣量最小;等速提純電泳區帶解析度較高,可將樣品分成單一成分,加樣量最大. 離子交換層析(Ion exchange chromatography,IEC)是以離子交換劑為固定相,依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法.離子交換層析中,基質由帶有電荷的樹脂或纖維素組成.帶有正電荷的為陰離子交換樹脂;反之為陽離子交換樹脂.離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化.當蛋白質處於不同的pH值條件下,其帶電狀況也不同.陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質,被留在層析柱上,通過提高洗脫液中的鹽濃度,將吸附在層析柱上的蛋白質洗脫下來,其中結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來.反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質,結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來.李全宏等[19]將離子交換層析應用於濃縮蘋果汁中蛋白質的提純.另外,離子交換層析還用於抗凝血蛋白的提取[7]. 4. 利用對配體的特異親和力進行分離純化 親和層析是利用蛋白質分子對其配體分子特有的識別能力(即生物學親和力)建立起來的一種有效的純化方法.它通常只需一步處理即可將目的蛋白質從復雜的混合物中分離出來,並且純度相當高.應用親和層析須了解純化物質的結構和生物學特性,以便設計出最好的分離條件.近年來,親和層析技術被廣泛應用於靶標蛋白尤其是疫苗的分離純化,特別是在融合蛋白的分離純化上,親和層析更是起到了舉足輕重的作用,因為融合蛋白具有特異性結合能力[20].親和層析在基因工程亞單位疫苗的分離純化中應用也相當廣泛[21].范繼業等[22]利用殼聚糖親和層析提取的抑肽酶比活達到71 428 BAEE·mg-1,純化回收率達到62·5%.該方法成本較低,吸附劑價格低廉、機械強度高、抗污染能力較強、非特異性吸附較小、可反復使用、適用性廣,產品質量穩定.