離子交換柱填料注意事項

❶ 原核表達常見問題（三）蛋白純化後續的問題分析

1.目的蛋白純化濃縮之後，目的蛋白條帶周圍出現雜帶，據推測可能是插入目的基因後，外源基因的表達刺激大腸桿菌產生了宿主蛋白酶，對異源蛋白進行降解的產物。

樣品緩沖液有相同的 pH 和離子強度。

離子交換純化是利用離子交換劑上的可解離基團(活性基團)對各種離子的親和力不一樣達到分離目的的一種蛋白純化分離技術,離子強度越大，洗脫越好。具體的離子濃度范圍可以很大，0.01mol/l 到 1mol/l，甚至 3.0mol/l，PH值的范圍液很廣。主要根據你的蛋白質的等電點。

1. 蛋白與離子柱得結合太強，換弱陽的瓊脂糖凝膠介質，比如由 sp 的換成 CM

2. 減少離子柱與樣品的結合時間，防止蛋白沉在柱上。

3. 若洗不下來的是雜蛋白直接用 0.1M 氫氧化鈉洗。

1. 離子交換每個梯度都洗下來目標蛋白，最大可能性是上樣量過大，流速太大，建議增加清洗的體積數，減

少上樣量，降低上樣速度。

2. 上樣完洗脫前，清洗的不徹底。

3. 標簽沒有表達出來：1. 可能是因為折疊構象不正確導致標簽在重摺疊時沒有位於蛋白質分子的表面上無法與離子柱結合。2. 標簽在折疊時沒有位於蛋白質分子的表面上。

4. 填料有問題，換填料。

5. PH、離子強度是否合適，平衡緩沖液是否應與樣品緩沖液 pH、離子強度相同。

1. 蛋白質的折疊形態發生了改變隱藏了標簽，而使得蛋白質無法掛柱 。

1. 因臨近的空間的一個或多個氨基酸的空間位阻阻礙了標簽與離子柱形成共價鍵。

2. 環境影響：pH，離子強度，其他蛋白質分子，緩沖溶液類型，有關影響蛋白質分子表面的試劑等。增加所提的蛋白質樣品的溶解度或還可以加大離子型、非離子型或兩性離子表面活性劑的濃度或類型。

2. 柱子沒平衡好，平衡緩沖液沒加咪唑，平衡液 PH 不適合，緩沖液 pH 要與蛋白質 pI +/-1-2。

3. 有比鄰的組氨酸的污染蛋白質與離子柱結合，通過降低洗脫液 pH 值使得標簽質子化而使得污染蛋白質從

層析住上被洗脫。

4. 一些蛋白質或 DNA 與帶有標簽的目的蛋白發生了非特異性相互作用， 可以用低濃度的去污劑 （2%的 Triton

X-100 或濃度不大於 0.5%SDS)洗滌樣品 （上樣洗脫時） 或增加洗脫液的鹽濃度 （氯化鈉溶液低於 2mol/L） 。

5. 填料有問題，換填料。

6. 最後可以考慮一下試劑的問題。

1. 更換緩沖液，可能 pH 與蛋白質 pI 較接近。

2. 填料選擇不對，與蛋白結合力太弱，更換適合改純化蛋白質的填料。

3. 直接收取目的蛋白，再用其他純化方法進一步純化。

1. pH 發生變化，導致蛋白質沉澱。找准蛋白質的一個等電點，溶液環境的ph值不能在蛋白質等電點的附近，如果在等電點的附近的時候，這個時候蛋白非常容易沉澱。可根據軟體計算入VECTOR NTI計算其理論等電點，盡量純化的溶劑在遠離等電點。

2. 離子溶度過高，緩沖液的離子溶度降低。人為配製的溶液環境，不一定真正符合蛋白本身的「生存」的環境要求，所以要從離子濃度和pH去考慮，特別是鹽離子濃度；所謂的鹽濃度，就是鹽析效應。高濃度的鹽破壞蛋白的水化層，使得蛋白質聚集沉澱。常用的就是硫酸銨沉澱。鹽析沉澱通常對蛋白質的高級結構沒有破壞，再溶時活性可以完全恢復。常見的例子就是硫酸銨沉澱純化IgG。同樣，硫酸銨沉澱也常碰到不可逆的情況。例如大腸桿菌(Escherichia coli)表達的重組蛋白往往在硫酸銨沉澱後再溶困難。

3.在Ni純化的過程中，有一部分鎳離子會脫落，脫落的鎳離子屬於重金屬，會對蛋白的凝集和沉積起到一定的作用。

4.蛋白反復凍溶，過程中生成的一些小冰晶會對這個蛋白的結構造成一定的傷害，離子和緩沖液狀態發生較大變化；

5.如果長時間放在4度的情況之下蛋白質，容易滋生微生物，微生物的生長的可能造成蛋白的性質變化或者降解也容易產生一些聚集沉澱；

9.若發生不可逆沉澱，可以選擇離心，過濾等方式去除。

1. 倒入速度不要太快，以防產生泡沫和氣泡。

2. 裝柱的注意事項:

1. 裝柱時應注意液面不能低於樹脂表面。

2. 樹脂懸浮液的溫度要相對恆定或與室溫接近，否則柱床體內易產生氣泡而影響分離效果。

3. 裝好的柱體應該沒有「紋路」、節痕和氣泡，並且柱床體表面平整而均勻。否則需要重新裝柱。

4. 在裝柱的同時應該將其他儀器設備（如：恆流泵等）電源接通，並按實驗要求進行預熱和調試。需

將恆流泵流速調至 0.4ml/min。

3. 應將洗脫液放至液面與樹脂相切時再上樣，且樣品一旦加入就應該立即開始收集流出液。 （第一管，應在

4ml 處做一標記）。 

4. 加樣時要沿柱內壁緩慢地加入柱中，以免沖壞樹脂表面，以及在柱內形成氣泡，影響分離效果。

❷ 以離子交換色譜法為例，簡述濕法裝柱的操作過程和注意事項

先裝部分液體嗎，然後倒入色譜填料（色譜調料配置成懸浮液），倒的時候注意液面在填料上面，防止產生氣泡。色譜柱可以適當放液，增加填料的沉積速度。

❸ 氨基酸分析儀的色譜柱是什麼填料的壽命大概能有多久能自己裝填嗎

您好來，我是德國曼默博爾公司自的工程師。
氨基酸分析的色譜柱填料主要是苯乙烯-二乙烯苯聚合後磺化成的磺酸型強酸性陽離子交換樹脂。
其實，色譜柱壽命主要看自己使用時候保護的怎麼樣：包括樣品前處理是否規范，維護保養是否充分等。一般注意點使用的話，保證柱效的情況下，壽命能保證在1萬-2萬針左右，多的話也有可能，看你怎麼用了。有的廠家會吹噓能到6萬針，簡單計算下氨基酸分析一個樣大概得1小時左右，除去維護時間，一天最多跑個20針，一年也就6000針左右，10年才能跑完6萬針，到時候儀器報廢沒報廢都不知道，別說色譜柱了。
色譜柱的裝填是非常需要經驗和技巧的活兒，而且裝色譜柱得需要非常專業的色譜柱裝柱機。比如裝色譜柱的時候得用恆壓泵裝，一般實驗室儀器都配置的是恆流泵，恆流泵裝出來的柱子填料很容易就塌了。而且前期的填料清洗、勻漿等都非常需要經驗，要是自己裝估計很難，一般得找專業的色譜柱工程師裝填最好。
希望對您有幫助，記得給分

❹ 離子色譜柱淋洗液應該用碳酸鈉用了氫氧化鈉柱子會壞嗎

離子色譜柱淋洗液應該用碳酸鈉用了氫氧化鈉柱子不會壞。
離子色譜柱的填料是離子交換樹脂，離子交換樹脂不怕稀酸稀鹼。一般活化離子交換樹脂都是採用酸鹼交替進行活化，提高離子吸附量。但氫氧化鈉畢竟是強鹼性的，用完後，柱子要沖洗干凈。

❺ 離子交換和凝膠層析裝柱時,出現氣泡,結節怎麼處理

可以用適量的有機溶劑潤洗一下層析柱，柱子體積較小的話就用玻璃棒攪勻排除一內下氣泡。

不管是干柱和容濕柱，都要加層析液，不能要求一開始就沒有氣泡的。要用洗脫劑不停的洗脫，就是用配置好的試劑一邊一邊對柱子進行洗脫，這樣不但可以消除氣泡，還可以使硅膠充分沉降，讓層析效果更好。等柱子沒有氣泡後在上樣用洗脫液進行層析。

若柱中留有氣泡或各部分松緊不勻（更不能有斷層）時，會影響滲透速度和顯色的均勻。去除就是用玻璃棒攪拌，趕走氣泡。

(5)離子交換柱填料注意事項擴展閱讀：

水溶液中的一些陽離子進入反離子層，而原來在反離子層中的陽離子進入水溶液，這種發生在反離子層與正常濃度處水溶液之間的同性離子交換被稱為離子交換作用。

離子交換主要發生在擴散層與正常水溶液之間，由於黏土顆粒表面通常帶的是負電荷，故離子交換以陽離子交換為主，故又稱為陽離子交換。離子交換嚴格服從當量定律，即進入反離子層的陽離子與被置換出反離子層的陽離子的當量相等。

❻ 離子交換和凝膠層析濕法裝柱時，如出現氣泡、結節、表面凹凸不平，該如何處理

把填料倒出來 重新裝柱