ph對蛋白離子交換層析的影響

㈠ 離子交換層析基本信息

離子交換層析是一種利用物質的電荷特性進行分離和純化的技術。其核心是基質，通常是帶有電荷的樹脂或纖維素。這些基質根據其電荷性質可分為兩類：陰離子交換樹脂，帶有正電荷，和陽離子樹脂，帶有負電荷。

在蛋白質分離純化過程中，離子交換層析的原理基於蛋白質的等電點特性。當蛋白質處於不同的pH環境中，其帶電狀態會發生變化。陰離子交換樹脂會結合帶有負電荷的蛋白質，使得這些蛋白質被吸附在柱子上。要將它們分離出來，可以通過逐步提高洗脫液中的鹽濃度，結合較弱的蛋白質首先會脫落下來。

相反，陽離子交換樹脂結合的是帶有正電荷的蛋白質。這些蛋白質的洗脫則需要採用不同的策略，如增加洗脫液中的鹽濃度或者提高其pH值，這樣結合強度較弱的蛋白質會先被釋放出來。通過這樣的方法，離子交換層析能夠有效地實現蛋白質的分離和純化。

離子交換層析（Ion Exchange Chromatography簡稱為IEC）是以離子交換劑為固定相，依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時的結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法。1

㈡ 離子交換層析蛋白純化

離子交換層析是一種基於不同蛋白質與離子交換樹脂上電荷基團可逆結合力的差異進行分離的技術。離子交換樹脂是帶有電荷基團的高分子聚合物凝膠顆粒，通過這一技術，依據流動相中蛋白質的電荷性質，實現對目標蛋白的分離與純化。

離子交換樹脂主要分為陽離子交換樹脂和陰離子交換樹脂。陽離子交換樹脂帶負電，能與陽離子物質結合，通常分為強酸型、中等酸型和弱酸型；陰離子交換樹脂帶正電，能與陰離子物質結合，分為強鹼型、中等鹼型和弱鹼型。這些樹脂的離子交換特性取決於電荷基團的解離度，強酸型樹脂對H＊的結合力比Na＋小，弱酸型樹脂對H＇的結合力比Na＊大；強鹼型樹脂對OH 的結合力比CI小，而弱酸型樹脂對OH 的結合力比CT大。

離子交換樹脂的交換容量反映了其與溶液中蛋白質進行交換的能力，它不僅與樹脂本身有關，還與實驗條件密切相關。離子交換樹脂的總交換容量用每毫克或每毫升交換劑含有可解離基團的毫克當量數來表示，對分離蛋白質的離子交換樹脂而言，通常用每毫克或每毫升交換劑能夠吸附某種蛋白質的量來表示。

在離子交換層析實驗中，選擇合適的離子交換樹脂對於分離效果至關重要。陽離子交換樹脂在等電點pl＜pH條件下與蛋白結合，等電點pl＞pH的蛋白與之結合。強型離子交換樹脂使用的pH范圍廣，適合制備去離子水和分離在極端pH溶液中解離且較穩定的物質。樹脂基質的疏水性影響蛋白質的穩定性和分離效果，分離生物大分子時，應選擇親水性基質的交換劑，以溫和的方式吸附和洗脫蛋白質，避免破壞生物大分子的活性。

離子交換層析的基本步驟包括離子交換樹脂的選擇、離子交換層析柱的制備、緩沖液的制備、加樣、洗脫以及離子交換柱的再生。在加樣過程中，需注意樣品液的離子強度和pH，上樣量應由交換容量決定。洗脫過程中，採用線性梯度洗脫，通過逐步增大離子強度，使結合在離子交換樹脂上的蛋白質組分依次被洗脫下來。洗脫液的選擇需保證在整個洗脫液梯度范圍內，所有待分離蛋白質組分穩定，並能夠被洗脫下來。洗脫速度需保持恆定，以獲得較好的解析度，但需考慮解析度與洗脫速度之間的關系，以優化分離效果。

在離子交換層析實驗中，影響交換容量的因素主要有樹脂顆粒大小、顆粒內孔隙大小、離子強度和pH。顆粒大小和孔隙大小影響離子交換樹脂與樣品組分作用的有效表面積，pH對弱酸和弱鹼型離子交換樹脂影響較大，而離子強度增大通常導致交換容量下降。通過優化實驗條件和參數，可以實現對目標蛋白質的高效純化。

㈢ 離子交換層析為什麼在低離子強度下進行

離子交換層析是根據蛋白質所帶電荷的差異進行分離純化的一種方法。蛋白質的帶電性是版由蛋白質多肽中帶電權氨基酸決定的。由於蛋白質中氨基酸的電性又取決於介質中的pH，所以蛋白質的帶電性也就依賴於介質的pH。當pH較低時，負電基團被中和，而正電基團就很多; 在pH較高時，蛋白質的電性與低pH時相反。當蛋白質所處的pH，使蛋白質的正負電荷相等，此時的pH稱為等電點。離子交換層析所用的交換劑是經酯化、氧化等化學反應引入陽性或陰性離子基團製成的，可與帶相反電荷的蛋白質進行交換吸附。帶有陽離子基團的交換劑可置換吸附帶負電荷的物質，稱為陰離子交換劑，如DEAE-纖維素樹脂;反之稱為陽離子交換劑，如CM-纖維素樹脂。不同的蛋白質有不同的等電點，在一定的條件下解離後所帶的電荷種類和電荷量都不同，因而可與不同的離子交換劑以不同的親和力相互交換吸附。當緩沖液中的離子基團與結合在離子交換劑上的蛋白質相競爭時，親和力小的蛋白質分子首先被解吸附而洗脫，而親和力大的蛋白質則後被解吸附和洗脫。因此，可通過增加緩沖液的離子強度和/或改變酸鹼度，便可改變蛋白質的吸附狀況，使不同親和力的蛋白質得以分離。

㈣ 蛋白質分離純化的蛋白質分離純化技術

沉澱法也稱溶解度法。其純化生命大分子物質的基本原理是根據各種物質的結構差異性來改變溶液的某些性質，進而導致有效成分的溶解度發生變化。
1、鹽析法
鹽析法的根據是蛋白質在稀鹽溶液中，溶解度會隨鹽濃度的增高而上升，但當鹽濃度增高到一定數值時，使水活度降低，進而導致蛋白質分子表面電荷逐漸被中和，水化膜逐漸被破壞，最終引起蛋白質分子間互相凝聚並從溶液中析出。
2、有機溶劑沉澱法
有機溶劑能降低蛋白質溶解度的原因有二：其一、與鹽溶液一樣具有脫水作用；其二、有機溶劑的介電常數比水小，導致溶劑的極性減小。
3、蛋白質沉澱劑
蛋白質沉澱劑僅對一類或一種蛋白質沉澱起作用，常見的有鹼性蛋白質、凝集素和重金屬等。
4、聚乙二醇沉澱作用
聚乙二醇和右旋糖酐硫酸鈉等水溶性非離子型聚合物可使蛋白質發生沉澱作用。
5、選擇性沉澱法
根據各種蛋白質在不同物理化學因子作用下穩定性不同的特點，用適當的選擇性沉澱法，即可使雜蛋白變性沉澱，而欲分離的有效成分則存在於溶液中，從而達到純化有效成分的目的。 1、吸附柱層析
吸附柱層析是以固體吸附劑為固定相，以有機溶劑或緩沖液為流動相構成柱的一種層析方法。
2、薄層層析
薄層層析是以塗布於玻板或滌綸片等載體上的基質為固定相，以液體為流動相的一種層析方法。這種層析方法是把吸附劑等物質塗布於載體上形成薄層，然後按紙層析操作進行展層。
3、聚醯胺薄膜層析
聚醯胺對極性物質的吸附作用是由於它能和被分離物之間形成氫鍵。這種氫鍵的強弱就決定了被分離物與聚醯胺薄膜之間吸附能力的大小。層析時，展層劑與被分離物在聚醯胺膜表面競爭形成氫鍵。因此選擇適當的展層劑使分離在聚醯胺膜表面發生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的連續過程，就能導致分離物質達到分離目的。 親和層析的原理與眾所周知的抗原-抗體、激素-受體和酶-底物等特異性反應的機理相類似，每對反應物之間都有一定的親和力。正如在酶與底物的反應中，特異的底物（S）才能和一定的酶（E）結合，產生復合物（E-S）一樣。在親和層析中是特異的配體才能和一定的生命大分子之間具有親和力，並產生復合物。而親和層析與酶-底物反應不同的是，前者進行反應時，配體（類似底物）是固相存在；後者進行反應時，底物呈液相存在。實質上親和層析是把具有識別能力的配體L（對酶的配體可以是類似底物、抑制劑或輔基等）以共價鍵的方式固化到含有活化基團的基質M（如活化瓊脂糖等）上，製成親和吸附劑M-L，或者叫做固相載體。而固化後的配體仍保持束縛特異物質的能力。因此，當把固相載體裝人小層析柱（幾毫升到幾十毫升床體積）後，讓欲分離的樣品液通過該柱。這時樣品中對配體有親和力的物質S就可藉助靜電引力、范德瓦爾力，以及結構互補效應等作用吸附到固相載體上，而無親和力或非特異吸附的物質則被起始緩沖液洗滌出來，並形成了第一個層析峰。然後，恰當地改變起始緩沖液的pH值、或增加離子強度、或加入抑制劑等因子，即可把物質S從固相載體上解離下來，並形成了第M個層析峰。顯然，通過這一操作程序就可把有效成分與雜質滿意地分離開。如果樣品液中存在兩個以上的物質與固相載體具有親和力（其大小有差異）時，採用選擇性緩沖液進行洗脫，也可以將它們分離開。用過的固相載體經再生處理後，可以重復使用。
上面介紹的親和層析法亦稱特異性配體親和層析法。除此之外，還有一種親和層析法叫通用性配體親和層析法。這兩種親和層析法相比，前者的配體一般為復雜的生命大分子物質（如抗體、受體和酶的類似底物等），它具有較強的吸附選擇性和較大的結合力。而後者的配體則一般為簡單的小分子物質（如金屬、染料，以及氨基酸等），它成本低廉、具有較高的吸附容量，通過改善吸附和脫附條件可提高層析的解析度。 聚焦層析也是一種柱層析。因此，它和另外的層析一樣，照例具有流動相，其流動相為多緩沖劑，固定相為多緩沖交換劑。
聚焦層析原理可以從pH梯度溶液的形成、蛋白質的行為和聚焦效應三方面來闡述。
1、PH梯度溶液的形成
在離子交換層析中，pH梯度溶液的形成是靠梯度混合儀實現的。例如，當使用陰離子交換劑進行層析時，制備pH由高到低呈線性變化的梯度溶液的方法是，在梯度儀的混合室中裝高pH溶液，而在另一室裝低pH極限溶液，然後打開層析柱的下端出口，讓洗脫液連續不斷地流過柱體。這時從柱的上部到下部溶液的pH值是由高到低變化的。而在聚焦層析中，當洗脫液流進多緩沖交換劑時，由於交換劑帶具有緩沖能力的電荷基團，故pH梯度溶液可以自動形成。例如，當柱中裝陰離子交換劑PBE94（作固定相）時，先用起始緩沖液平衡到pH9，再用含pH6的多緩沖劑物質（作流動相）的淋洗液通過柱體，這時多緩沖劑中酸性最強的組分與鹼性陰離子交換對結合發生中和作用。隨著淋洗液的不斷加入，柱內每點的pH值從高到低逐漸下降。照此處理J段時間，從層析柱頂部到底部就形成了pH6～9的梯度。聚焦層析柱中的pH梯度溶液是在淋洗過程中自動形成的，但是隨著淋洗的進行，pH梯度會逐漸向下遷移，從底部流出液的pH卻由9逐漸降至6，並最後恆定於此值，這時層析柱的pH梯度也就消失了。
2、蛋白質的行為
蛋白質所帶電荷取決於它的等電點（PI）和層析柱中的pH值。當柱中的pH低於蛋白質的PI時，蛋白質帶正電荷，且不與陰離於交換劑結合。而隨著洗脫劑向前移動，固定相中的pH值是隨著淋洗時間延長而變化的。當蛋白質移動至環境pH高於其PI時，蛋白質由帶正電行變為帶負電荷，並與陰離子交換劑結合。由於洗脫劑的通過，蛋白質周圍的環境pH 再次低於PI時，它又帶正電荷，並從交換劑解吸下來。隨著洗脫液向柱底的遷移，上述過程將反復進行，於是各種蛋白質就在各自的等電點被洗下來，從而達到了分離的目的。
不同蛋白質具有不同的等電點，它們在被離子交換劑結合以前，移動之距離是不同的，洗脫出來的先後次序是按等電點排列的。
3、聚焦效應
蛋白質按其等電點在pH梯度環境中進行排列的過程叫做聚焦效應。pH梯度的形成是聚焦效應的先決條件。如果一種蛋白質是加到已形成pH梯度的層析柱上時，由於洗脫液的連續流動，它將迅速地遷移到與它等電點相同的pH處。從此位置開始，其蛋白質將以緩慢的速度進行吸附、解吸附，直到在等電點pH時被洗出。若在此蛋白質樣品被洗出前，再加入第二份同種蛋白質樣品時，後者將在洗脫液的作用下以同樣的速度向前移動，而不被固定相吸附，直到其遷移至近似本身等電點的環境處（即第一個作品的緩慢遷移處）。然後兩份樣品以同樣的速度遷移，最後同時從柱底洗出。事實上，在聚焦層析過程中，一種樣品分次加入時，只要先加入者尚未洗出，並且有一定的時間進行聚焦，剩餘樣品還可再加到柱上，其聚焦過程都能順利完成，得到的結果也是滿意的。 多種組分的混合樣品進入色譜儀的氣化室氣化後呈氣態。當載氣流入時，氣化的物質被帶人色譜柱內，在固定相和流動相中不斷地進行分配．在理想狀態下，溶質於氣-液兩相間的分配可用分配系數Kg描述。當分配系數小時，溶質在柱中就停留時間短，也即滯留因子（Rf）大，所以它將首先從色譜柱流出而進入鑒定器，經放大系統放大後，輸出訊號便在記錄儀中自動記錄下來，這時呈現的圖形為色譜圖，亦稱色譜峰；當分配系數大時，溶質在柱中停留時間就長，其色譜圖在記錄儀上後出現。由於不同物質有不同的分配系數，所以將一混合樣品通過氣-液色譜柱時，其所含組分就可得到分離。
氣相色譜柱效率高、解析度強的重要原因是，理論塔板數（N）大。毛細管氣相色譜的N可達105~6。增加理論塔板數和降低樣品組分的不同分子在展層中擴展程度（速率理論），就可明顯地提高柱效。以下將討論塔板理論和速率理論對柱效的影響：
1、塔板理論
塔板理論是將色譜假設為一個蒸餾塔，塔內存在許多塊塔板，樣品各組分在每塊塔板的液相和氣相間進行分配，在柱內塔板間高度H（即理論塔板高度）一定時，在有效范圍內，柱子越長，N也就越大，樣品各組分分配次數也就越多，解析度自然提高；若柱長一定時，塔板理論高度H越小，就越能增加樣品各組分的分配次數，進而提高其解析度。因此 N=L/H 在線性分配和忽略塔板間縱向擴散的條件下，根據樣品組分的保留時間tr、峰寬W或半峰高寬度2ΔXi，Martin導出了計算N的公式，樣品組分峰寬度值越小，理論塔板數越高。實際上，進行色譜分析時，峰寬度值的大小是衡量解析度高低的一個尺度。
2、速率理論
根據塔板理論，在H（塔板理論高度）一定時，增加柱長可以提高柱效。但是，柱子過長，將會延長分析時間，降低檢測的靈敏度。所以實踐中應設法降低H，提高柱效。
速率理論主要是分析同一樣品的不同分子，在色譜柱中遷移速度差異所引起色譜峰的擴張程度。而渦流擴散、縱向分子擴散和質量傳遞（包括流動相傳質和固定相傳質）等因子與速率理論值（H）的密切關系可用下面的公式表示：
H=A+B/U+C
渦流擴散（A）是由於樣品組分隨著流動相的移動通過固定相顆粒不均勻的色譜柱時，引起同一組分的不同分子在流動相中形成不規則的"渦流"，致使色譜峰變寬、柱效降低。如固定相顆粒均勻、直徑小時，則可降低"渦流"現象發生。
縱向擴散（B/U）亦稱分子擴散項。縱向擴散與樣品分子在色譜柱中的流暢程度（有無阻礙）、流動相的速度（U）等因子有關。因此，降低溶質在流動相中擴散系數和縮短溶質在流動相中停留時間，均可降低縱向擴散。
傳質阻力（C）：溶質分子在氣相與氣液界面進行交換所受的阻力，以及在進入固定相液膜傳遞的差異性統稱傳質阻力。傳質阻力分別與固定相顆粒直徑的平方和固定相液膜厚度成正比關系。 高效液相色譜按其固定相的性質可分為高效凝膠色譜、疏水性高效液相色譜、反相高效液相色譜、高效離子交換液相色譜、高效親和液相色譜以及高效聚焦液相色譜等類型。用不同類型的高效液相色譜分離或分析各種化合物的原理基本上與相對應的普通液相層析的原理相似。其不同之處是高效液相色譜靈敏、快速、解析度高、重復性好，且須在色譜儀中進行。
高效液相色譜儀主要有進樣系統、輸液系統、分離系統、檢測系統和數據處理系統，下面將分別敘述其各自的組成與特點。
1、進樣系統
一般採用隔膜注射進樣器或高壓進樣器完成進樣操作，進樣量是恆定的。這對提高分析樣品的重復性是有益的。
2、輸液系統
該系統包括高壓泵、流動相貯存器和梯度儀三部分。高壓泵的一般壓強為l.47~4.4×107Pa，流速可調且穩定，當高壓流動相通過層析柱時，可降低樣品在柱中的擴散效應，可加快其在柱中的移動速度，這對提高解析度、回收樣品、保持樣品的生物活性等都是有利的。流動相貯存和梯度儀，可使流動相隨固定相和樣品的性質而改變，包括改變洗脫液的極性、離子強度、pH值，或改用競爭性抑制劑或變性劑等。這就可使各種物質（即使僅有一個基團的差別或是同分異構體）都能獲得有效分離。
3、分離系統
該系統包括色譜柱、連接管和恆溫器等。色譜柱一般長度為10～50cm（需要兩根連用時，可在二者之間加一連接管），內徑為2～5mm，由"優質不銹鋼或厚壁玻璃管或鈦合金等材料製成，住內裝有直徑為5～10μm粒度的固定相（由基質和固定液構成）。固定相中的基質是由機械強度高的樹脂或硅膠構成，它們都有惰性（如硅膠表面的硅酸基團基本已除去）、多孔性（孔徑可達1000?）和比表面積大的特點，加之其表面經過機械塗漬（與氣相色譜中固定相的制備一樣），或者用化學法偶聯各種基團（如磷酸基、季胺基、羥甲基、苯基、氨基或各種長度碳鏈的烷基等）或配體的有機化合物。因此，這類固定相對結構不同的物質有良好的選擇性。例如，在多孔性硅膠表面偶聯豌豆凝集素（PSA）後，就可以把成纖維細胞中的一種糖蛋白分離出來。
另外，固定相基質粒小，柱床極易達到均勻、緻密狀態，極易降低渦流擴散效應。基質粒度小，微孔淺，樣品在微孔區內傳質短。這些對縮小譜帶寬度、提高解析度是有益的。根據柱效理論分析，基質粒度小，塔板理論數N就越大。這也進一步證明基質粒度小，會提高解析度的道理。
再者，高效液相色譜的恆溫器可使溫度從室溫調到60C，通過改善傳質速度，縮短分析時間，就可增加層析柱的效率。
4、檢測系統
高效液相色譜常用的檢測器有紫外檢測器、示差折光檢測器和熒光檢測器三種。
（1）紫外檢測器
該檢測器適用於對紫外光（或可見光）有吸收性能樣品的檢測。其特點：使用面廣（如蛋白質、核酸、氨基酸、核苷酸、多肽、激素等均可使用）；靈敏度高（檢測下限為10-10?g/ml）；線性范圍寬；對溫度和流速變化不敏感；可檢測梯度溶液洗脫的樣品。
（2）示差折光檢測器
凡具有與流動相折光率不同的樣品組分，均可使用示差折光檢測器檢測。目前，糖類化合物的檢測大多使用此檢測系統。這一系統通用性強、操作簡單，但靈敏度低（檢測下限為10-7?g/ml），流動相的變化會引起折光率的變化，因此，它既不適用於痕量分析，也不適用於梯度洗脫樣品的檢測。
（3）熒光檢測器
凡具有熒光的物質，在一定條件下，其發射光的熒光強度與物質的濃度成正比。因此，這一檢測器只適用於具有熒光的有機化合物（如多環芳烴、氨基酸、胺類、維生素和某些蛋白質等）的測定，其靈敏度很高（檢測下限為10-12～10-14?g/ml），痕量分析和梯度洗脫作品的檢測均可採用。
（5）數據處理系統
該系統可對測試數據進行採集、貯存、顯示、列印和處理等操作，使樣品的分離、制備或鑒定工作能正確開展。

㈤ 建立離子交換法純化蛋白質的方法需要摸索哪些條件

1. pH值，緩沖液的pH值對於蛋白結合離子交換層析有非常大的影響，需要先摸索出合適的版pH值，既能權保證蛋白結合上離子交換層析，又不會出現不穩定沉澱的情況。

2. 鹽濃度，鹽濃度是離子交換層析洗脫的關鍵，需要摸索出蛋白能在什麼樣的鹽濃度下被洗脫，且洗脫後純度能夠達到最初的要求。

3. 柱體積，盡管各種離子交換層析均有理論結合蛋白量，但各種蛋白情況不一樣，需要摸索出能夠完全結合目的蛋白合適的柱體積。既不會太大造成洗脫濃度過稀，也不會太小造成目標蛋白過載。

4. 溫度，溫度可能會造成蛋白變性等等。