① 離子交換層析與疏水層析有何區別
離子交換層析是利用蛋白質在不同PH帶不同種電荷的方法，利用離子交換的方法分離蛋白的。離子交換內的介質一般是樹脂，陽離子交換型的，使用前樹脂先用鹼處理成鈉型，將氨基酸混合液（pH=2-3)上柱，pH=2-3時，氨基酸主要以陽離子形式存在，與樹脂上的鈉離子發生交換而被「掛」在樹脂上，再用洗脫劑洗脫。不同的氨基酸（帶的電荷不同）與樹脂的親和力不同，要將其分離洗脫下來，需要降低它們之間的親和力，方法是逐步提高洗脫劑的pH和鹽濃度，這樣各種氨基酸將以不同的速度被洗脫下來，反之亦然。不同反荷離子與樹脂親和力是不同的，其強弱關系為陽性競爭離子：Ag+〉CS+〉K+〉NH4+〉Na+〉H+〉Li+陰性競爭離子：I->NO3->(PO4)3->CN-〉HSO3-〉Mg2+〉HCO3-〉HCOO-〉CH3COO-〉OH-〉F-如果某種離子溶液洗脫效果不好，可用另一種親和力強的離子代替之，等電點＞7選擇陽離子交換樹脂，等電點＜7選擇陰離子交換樹脂。
② 在操作方面，凝膠過濾與離子交換層析有何異同處
在原理上都是相通的，區別在於流動相和層析劑之間的作用力的不同。
凝膠過濾又名分子篩層析，利用微孔凝膠，將不同分子量的成分分離。
離子交換是利用被分離物質的電荷與層析劑上的離子基團的靜電作用。
③ 凝膠過濾層析常用介質有哪些凝膠過濾層析技術有何優點與用途
1.凝膠層析操作簡便，所需設備簡單。有時只要有一根層析柱便可進行工作。分離介質—凝膠完全不需要像離子交換劑那樣復雜的再生過程便可重復使用。
2.分離效果較好，重復性高。最突出的是樣品回收率高，接近100%。
3.分離條件緩和。凝膠骨架親水，分離過程又不涉及化學鍵的變化，所以對分離物的活性沒有不良影響。
4.應用廣泛。適用於各種生化物質，如肽類、激素、蛋白質、多糖、核酸的分離純化、脫鹽、濃縮以及分析測定等。分離的分子量范圍也很寬，如SephadexG類為102～105d；Sepharose類為105～108d。
5.解析度不高，分離操作較慢。由於凝膠層析是以物質分子量的不同作為分離依據的，分子量的差異僅表現在流速的差異上，所以分離時流速必須嚴格把握。因而分離操作一般較慢。而且對於分子量相差不多的物質難以達到很好的分離。此外，凝膠層析要求樣品粘度不宜太高。凝膠顆粒有時還有非特異吸附現象。
④ 純化生物產品的得率是如何計算的
生物葯物的提取純化技術
第一節 概述
一、生物葯物的特點及純化方法
許多生物葯物具有生物活性，其穩定性受pH,一溫度、離子強終提取過程所使用的溶劑和表面活性劑、金屬離子等方面的嚴件物葯物對剪切力很敏感，分子量越大，其穩定性就越差，在甘離純化過程中，條件就應當越溫和。一些組分的濃度非常低。但是生物葯物產品的純度卻要求很高，含量要達到95%甚至98%以上。結晶態產品最好，葯物還應具有正常的顏色、穩定性和溶解速率。
生物葯物的制備，如蛋白質制備，涉及物理、化學和生物學知識。其主要原理有兩個方面：一是利用混合物中組分分配率差別，把它們分配於可機械分離的兩個或幾個物相中，如鹽析、有機溶劑提取、層析和結晶等；二是將混合物置於單一物相中，經物理力場作用使各組分分配於不同區域而達分離目的，如電泳、超離心、超濾等。相互分離主要利用蛋白間各種性質的微小差別,諸如分子形狀、分子量大小、帶電性質、溶解度、生物功能專一性等，制備方法可按這些主要因素進行分類。按分子大小和形態分差速離心、超濾、分子篩及透析等方法；按溶解度分為鹽析、溶劑抽提、分配層析、逆流分配及結晶等；按電荷差異分為電泳、電滲析、等電點沉澱、離子交換層析及吸附層析等；按生物功能專一性有親合層析法等。
蛋白分離純化比較困難。需要研究目的物質的微細特徵，巧妙聯用各種方法並進行嚴密的操作，並有必要了解精製過程的精製程度和回收率。具有活性的蛋白可利用吸收光譜等物理性質或以相當於單位氮活性增加進行追蹤；其他蛋白可用電泳、超離心、層析、擴散及溶解等測定純度；不穩定蛋白，如分離SH-酶時，使用試劑及緩沖液等要確認不含重金屬離子（特級試劑也需檢定）。
蛋白質純化的操作如脫鹽、濃縮乾燥等均與低分子物不同，須經獨特的繁瑣操作。
提純蛋白和酶時常混有核酸或多糖，一般可用專一性酶解、有機溶劑抽取及選擇性部分沉澱等法處理。小分子物質常在制備中經多次液相與固相轉化被分離或最後用透析法除去。而同類物質分離，情況則復雜得多。主要採用鹽析、有機溶劑沉澱，等電點沉澱、吸附、結晶、電泳、超離心及柱層析法等。其中，鹽析、等電點及結晶法用於蛋白質和酶的提純較多；有機溶劑抽提和沉澱用於核酸提純較多；柱層析、梯度離心對蛋白和核酸的提純應用十分廣泛。
蛋白分離純化方法很多。 Bonnerjea 等人對有關蛋白和酶的分離純化方法及其特徵進行了分析，發現主要有10種方法，它們的出現頻率為：
離子交換 75%
親和過程 60%
沉 淀 57%
凝膠過濾 50%
其 它 <33%
目前尚無一種方法可用以純化各種蛋白質，但每種蛋白質都可設法分離純化。選擇純化方法，需要考慮到純度、活性、得率等。
二、提取純化的單元操作和基本工藝流程
生物葯物的提取和純化可分為5個主要步驟：預處理、固液尹離產縮、純化和產品定型（乾燥，制丸，擠壓，造粒，製片）每一步驟都可採用各種單元操作。在提取純化過程中，要盡可能減少操作步驟，因為每一操作步驟都不可避免帶來損失。操作步驟多，總收率就會下降。生物葯物提取工藝流程的基本模式如1-1所示。根據主要分離因素排列的單元分離范圍見圖1-2。
圖1-1 生物葯物提取工藝流程的基本模式
表1-1根據主要分離因素排列的單元分離范圍
三、提取純化單元操作技術的特點
現代生物制葯領域提取純化技術的進步得益於生化分析分離技術開拓性工作的成果汾離純化技術的特點之一是各種技術產互交叉，新型的分離純化方法不斷涌現。如沉澱技術和親和技夢相結合•形成了親和沉澱技術；超濾和親和技術相結合，形成了嚴和超濾技術；萃取與載體膜相結合，形成了液膜載體萃取法。這種新方法取長補短，使分離純化過程更加科學合理、快速有效、經濟實用。盡管有些方法仍處於實驗室的試驗階段，要用於工業規模還需要進一步探索，有的甚至沒有實用價值，但都可為今後的產展提供新的思路。
生物葯物提取純化技術的另一特點是注重新材料的研製開發如膜分離介質，層析介質，親和配基，新型萃取劑等在最近幾年來發展非常快。提取純化設備方面推陳出新，在設備的計算機控制及生產自動化，連續化及GMP規范化等方面取得很大的成就。
膜過濾技術發展很快，分為微濾、超濾和納濾，不僅用於細胞的分離，還用於蛋白質的濃縮。超濾技術的主要特點是節能，對生物大分子類葯物無破壞作用。液一液萃取廣泛應用於抗生素及小分子量葯物的提取。溶劑選擇的餘地大，且易實現大規模生產。高速離心式液體萃取機是目前效率最高，使用最廣的裝置。液一液萃取技術還衍生出許多新的萃取技術，如雙水相萃取，親和萃取，超臨界萃取等。雙水相萃取蛋白質類葯物是大規模提取高純度蛋白質類葯物的有效技術。而超臨界界萃取利用超臨界流體的物理特性，即通過壓力和溫度的改變控制溶質在溶劑中的分子擴散能助，控制溶質的溶解度，從而實現分離。
層析（色譜）技術是最近幾十年來發展最快的純化技術。層析裝置的種類很多，且分離純化機理也各不相同，適應於許多葯物產品的分離純化。離子交換色譜是應用最廣，且易於實現大規模生產的方法。應用於抗生素、氨基酸、核昔酸、蛋白質的提取和純化。分子篩層析根據分子量大小不同的原理，適應於蛋白質類葯物的純化。層析分離技術的最高層次當屬基於分子識別的技術如親和層析。這一技術已衍生出一大批新的技術，如免疫親和層析、染料親和層析、金屬離子鰲合層析。疏水性層析是基於分子的疏水性能來分離純化的。高效液相色譜法本是分析化學的常用手段，現已將其擴展到生物葯物的分離純化的應用中。有些設備僅可進行分析，有的還可用於分離純化，在新葯開發的過程中，縮短了分離純化所需時間。
與層析技術同步發展的各種分離介質是層析分離的技術保障，商品化的預裝柱、緩沖劑、計算機程序控制還使操作變得簡單易學。置換層析與洗脫層析不同，是指吸附在層析柱上的一種組分被另一種置換劑（與層析上的介質的親和力大於原被吸附的組分）置換出層析柱的層析技術。該技術有上樣量高，解析度高的特點。被分離的樣品在分離過程中還有濃縮作用。
總之，隨著科技的發展，新的分離、提取、純化技術還將不斷得到改進。
四、提取純化的工藝論證
我國1992年修訂了GMP,要求從1993年3月1日以後新建或改建的葯廠，均要符合GMP的要求。1994年開始了各項驗證，其中工藝論證是關鍵的一個不可缺少的組成部分．產品的純化是生產過程中關鍵的一步。這涉及到葯物的質量。所謂工藝驗證，就是通過系統的方法得到關於生產工藝的書面材料，證明並保證生產過程能始終如一地生產出特定的高質量的產品。提取純化處理工藝驗證的范圍包括：廠房設施、工程儀表、機械設備、生產環境、工藝條件、計算機軟體、介質、原材料、半成品、成品、操作人員素質和測試方法等。以上各個部分都要有驗證材料或試驗數據，根據這些材料和數據寫出驗證報告。當工藝的某一部分有較大變動時（如大修、工藝條件變化），要進行重新驗證，即再驗證．再驗證是針對某一部分的行動，而不是整個工藝過程的驗證．因此比較簡單、快速、易行。驗證的實施過程包括以下步驟：提出驗證要求，組織驗證小組，制定驗證方案，實施驗證試驗，寫出驗證報告，再驗證等。
現以生物制葯純化最常用的層析工藝為例，說明驗證試驗的過程。首先對層析設備進行安裝驗證，即在不通電源的情況下，根具設備說明書查看安裝是否正確，並對接線、管路連接、安放地點、輸人電壓等逐項檢查，無誤後，再進行運轉試驗．接通電源後，觀察電機、泵、監測器、信號系統、閥、壓力、溫度等是否正常．泵的輸出流量要經過校正，監測波長也要校正，運轉3-5次後，未見漏液、氣泡等，一切正常，方可正式運轉。層析柱是整個層析工藝的關鍵設備，要根據出廠標准，逐項驗證，如載體外觀、顆粒大小（用顯微鏡測量）、柱效率、解析度、回收率、有無污染等．如更變層析柱或層析柱填料，要對新層析柱進行重新驗證。總之，工藝驗證是一項技術性很強，無固定章程可循，既費力，又耗時、耗材的工作．
高科技生物葯物的生產工廠，已有「交鑰匙工程」。所謂交鑰匙工程，就是將整個工廠組裝在高強度的，便於運輸的鋼制建築結構內，整個建築要達到潔凈標准，所有的生產設備和公用設施都安裝到位。在用戶在場的情況下，要對整個工廠進行發貨前的試運轉及鑒定。然後，整個工廠的生產設備和公用設施直接運輸到用戶的廠址，在各車間組裝後，與當地的水、電、下水道等系統及倉庫對接，立即就可以投人生產。
五、生物葯物生產的屏蔽防護技術
(Containment technology)
一些葯物，如抗癌葯，往往對生物活細胞具有毒性，因此必須對中試或大生產的全過程設置屏蔽防護裝置．1984年，Flickinger等就提出了中試和生產規模細胞毒素劑的安全生產裝置的設計概念，其基本要求是：人員進出口要加以控制；在工作場所保持負壓（一級、二級或三級生物密封室）：空氣的排放必須通過HEPA過勝器；對有煙霧產生的設備要有附加的屏蔽防護裝置；有適當的個人防護措施；生產過程中所排放的廢物要有生物學或化學的除污方法；對工作人員進行醫療監測；環境監測。
六、純化工藝過程的質量控制
生物葯物純化工藝技術要求高，應盡可能選用高質量的設備，並要求有清潔的各級GMP廠房。純化方法的設計應考慮到盡可能去除污染病毒、核酸、宿主細胞雜蛋白、糖及其他雜質；要防止純化過程中帶人有害物質．如採用柱層析技術純化，應提供填料的質量認證證明(IS09001證書），並證實從柱上不會掉下有害物質。樣品上樣前應除熱原質等。若用親和層析技術（以單克隆抗體品作為配基），應有檢測可能污染此類外源性物質的方法，不應含有可測出的異種免疫球蛋白，柱層析配製溶液用水一律用超純水(Milli Q水）。
關於純度的要求，可視產品的來源、用途和用法而制定，例如經反復多次使用的真核細胞表達的製品，要求純度達到98％以上；多次使用的原核細胞表達的製品要達95％以上；外用製品的純度可降低要求。用於健康人群或用於重症患者，對純度要求各不相同．
純化工藝的每一步均應測定純度，計算提純倍數收率等。純化工藝過程中應盡量避免加人對人體有害的物質，若不得不加人，應設法除盡；並在最終產品中檢測殘留量，殘留量應遠遠低於危害劑量，還要考慮到多次使用的積蓄作用。
附：基因工程α一型干擾素制備及質，控制要點
干擾素是一組多功能的細胞因子，分為干擾素α、干擾素β、和干擾素γ。干擾素α為多基因產物。分為許多亞型，都是由許多氨基酸殘基組成的多膚。人干擾素γ是一種免疫干擾素，是由100多個氨基酸殘基組成的多肽，天然產品是一種糖蛋白，兩處有糖基化位點．
發酵後可用離心法或其他方法收集菌體，要求盡可能縮小操作的范圍，凡接觸過菌液的用具，如離心杯、轉頭和玻璃器皿等應浸泡新潔爾滅殺菌1h以上，才可清洗。離心後的廢棄液經殺菌後才能倒人下水道。收獲的菌種如在24h內破菌裂解，可放在4-80C,否則應凍存於_30'C以下的冰箱中，在一300C保存的菌體可使用6個月。將收獲的菌體用適當的緩沖液做成所需濃度的均勻懸液，可用物理、化學或生物學方法進行裂解，裂解後的菌液，可用高速離心沉澱或其他適當方法分離，上清液即為粗製干擾素。不得用對人體有害的化學試劑裂解菌體，用加酶或其他蛋白裂解菌體時，應在半成品內證明此種蛋白的含量在允許的范圍內，對製品安全及效果沒有影響，並提供檢測方法．
濃縮與純化方法應能去除絕大部分非干擾素物質。一般要用不同原理多步驟的純化方法，並使干擾素濃縮至一定程度，應詳細說明濃縮純化的全過程。在純化過程中不得加人對人體有害的物質，加入的物質應能在以後的純化過程中被去除或證明其濃度在允許的范圍內，不得影響製品的安全與效果。如用異種抗體親和層析純化，應說明其來源及純度，並提供此種抗體微量IgG的檢測方法，在半成品檢定中應測定IgG的含量，並確定允許濃度。制備注射用製品時濃縮純化過程應特別注意去除熱原質，並採取措施防止溶液、試劑和容器污染，而造成製品熱原質增加。
濃縮純化最後所得的純化干擾素即為「半成品原液」，取樣供作純度檢定後，立即加人人白蛋白，使其最終含量為2％，稱為加「白蛋白半成品」，取樣測定干擾素效價，保存在一300C,應盡量避免凍融，直到制劑配製時才取出融化、合並、離心、除菌過濾、制備成品，「加白蛋白半成品」在一300C下保存不得超過半年。
制劑配製：除菌過濾採用0.3μm薄膜，過濾後樣品應做無菌試驗，並取樣測定干擾素效價，根據除菌樣品的效價測定結果，將讓述無菌試驗合格的「加白蛋白半成品」用無菌的2 %白蛋白緩沖液稀釋至所需濃度，不得加防腐劑，稀釋後的「加白蛋白半成品」需做熱原測定、效價測定和無菌試驗。
冷凍乾燥：凍干工藝應不損害干擾素的活性，並使凍干後製品的水分達到一定的標准。
基因工程干擾素分注射用和外用兩種．其質量標准不同，應分別予以規定。每種製品又分為半成品和成品檢定．
⑤ 層析幾種常用的層析
吸附層析：吸附劑的吸附力，由電子特性及氫的活性決定，如活性炭吸附力最強，活化處理後主要用於有機化合物，常用溶劑按順序解析能力減弱。
分配層析：形成水-有機溶劑兩相系統，如硅膠、纖維素，根據分配比率分離物質，形成不同速度移動的區帶。
離子交換層析：基於離子交換劑吸附和解離，適用於水溶性化合物，如蛋白質、核酸，洗脫通過改變離子強度進行。
凝膠過濾層析：交聯高聚物形成網狀結構，按分子量大小分離物質，選擇不同規格的凝膠，如葡聚糖、聚丙烯醯胺等。
親和層析：專一性相互作用分離一對物質，如酶-抑制劑、抗原-抗體，支持物如瓊脂糖或纖維素。
氣相層析：用於揮發性和低揮發性物質，快速、靈敏，如硅油、高沸點石蠟固定相，分析時間短，適合微量分析。
紙層析：濾紙為基礎的分配層析，適合簡單混合物，1944年開創了層析新紀元，後來被高效方法取代。
薄層層析：分辨力高、時間短，常用於定性和定量分析，優於紙層析。
高效液相層析：高壓液相色譜，用於不揮發和極性物質，分析精確度高，速度快，是理想分離法。
反相層析：解決吸附層析中拖尾現象，用極性強溶劑洗脫高極性物質，與普通吸附層析相反。
同系層析：核酸分析中，利用核苷酸片段長度差異，結合電泳進行寡核苷酸順序分析。
層析（chromatography）是「色層分析」的簡稱。利用各組分物理性質的不同，將多組分混合物進行分離及測定的方法。有吸附層析、分配層析兩種。一般用於有機化合物、金屬離子、氨基酸等的分析。層析利用物質在固定相與流動相之間不同的分配比例，達到分離目的的技術。層析對生物大分子如蛋白質和核酸等復雜的有機物的混合物的分離分析有極高的分辨力。
⑥ 離子交換層析常用的離子交換介質有哪些
離子交換層析常用的離子交換介質有離子交換纖維素、離子交換葡聚糖和離子交換樹脂。離子交換層析中，基質是由帶有電荷的樹脂或纖維素組成。帶有負電荷的稱之陽離子交換樹脂。而帶有正電荷的稱之陰離子樹脂。離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化。由於蛋白質也有等電點，當蛋白質處於不同的pH條件下，其帶電狀況也不同。陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質，這類蛋白質被留在柱子上，通過提高洗脫液中的鹽濃度等措施，將吸附在柱子上的蛋白質洗脫下來。結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來。反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質，結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來。