超濾法測血漿蛋白結合率原理

㈠ 蛋白質分離方法有哪些,它們的特點各是什麼

1.根據分子大小不同進行分離純化
蛋白質是一種大分子物質,並且不同蛋白質的分子大小不同,因此可以利用一些較簡單的方法使蛋白
質和小分子物質分開,並使蛋白質混合物也得到分離.根據蛋白質分子大小不同進行分離的方法主要有透析、超濾、離心和凝膠過濾等.透析和超濾是分離蛋白質時常用的方法.透析是將待分離的混合物放入半透膜製成的透析袋中,再浸入透析液進行分離.超濾是利用離心力或壓力強行使水和其它小分子通過半透膜,而蛋白質被截留在半透膜上的過程.這兩種方法都可以將蛋白質大分子與以無機鹽為主的小分子分開.它們經常和鹽析、鹽溶方法聯合使用,在進行鹽析或鹽溶後可以利用這兩種方法除去引入的無機鹽.由於超濾過程中,濾膜表面容易被吸附的蛋白質堵塞,以致超濾速度減慢,截流物質的分子量也越來越小.所以在使用超濾方法時要選擇合適的濾膜,也可以選擇切向流過濾得到更理想的效果
離心也是經常和其它方法聯合使用的一種分離蛋白質的方法.當蛋白質和雜質的溶解度不同時可以利用離心的方法將它們分開.例如,在從大米渣中提取蛋白質的實驗中,加入纖維素酶和α-澱粉酶進行預處理後,再用離心的方法將有用物質與分解掉的雜質進行初步分離[3].使蛋白質在具有密度梯度的介質中離心的方法稱為密度梯度(區帶)離心.常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度.可以根據所需密度和滲透壓的范圍選擇合適的密度梯度.密度梯度離心曾用於純化蘇雲金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白,得到的產品純度高但產量偏低.蔣辰等[6]通過比較不同密度梯度介質的分離效果,利用溴化鈉密度梯度得到了高純度的蘇雲金芽孢桿菌伴孢晶體蛋白.凝膠過濾也稱凝膠滲透層析,是根據蛋白質分子大小不同分離蛋白質最有效的方法之一.凝膠過濾的原理是當不同蛋白質流經凝膠層析柱時,比凝膠珠孔徑大的分子不能進入珠內網狀結構,而被排阻在凝膠珠之外,隨著溶劑在凝膠珠之間的空隙向下運動並最先流出柱外;反之,比凝膠珠孔徑小的分子後流出柱外.目前常用的凝膠有交聯葡聚糖凝膠、聚丙烯醯胺凝膠和瓊脂糖凝膠等.在甘露糖蛋白提純的過程中使用凝膠過濾方法可以得到很好的效果,純度鑒定證明產品為分子量約為32 kDa、成分是多糖∶蛋白質(88∶12)、多糖為甘露糖的單一均勻糖蛋白[1].凝膠過濾在抗凝血蛋白的提取過程中也被用來除去大多數雜蛋白及小分子的雜質[7].
2.根據溶解度不同進行分離純化
影響蛋白質溶解度的外部條件有很多,比如溶液的pH值、離子強度、介電常數和溫度等.但在同一條件下,不同的蛋白質因其分子結構的不同而有不同的溶解度,根據蛋白質分子結構的特點,適當地改變外部條件,就可以選擇性地控制蛋白質混合物中某一成分的溶解度,達到分離純化蛋白質的目的.常用的方法有等電點沉澱和pH值調節、蛋白質的鹽溶和鹽析、有機溶劑法、雙水相萃取法、反膠團萃取法等.
等電點沉澱和pH值調節是最常用的方法.每種蛋白質都有自己的等電點,而且在等電點時溶解度最
低;相反,有些蛋白質在一定pH值時很容易溶解.因而可以通過調節溶液的pH值來分離純化蛋白質.王洪新等[8]研究茶葉蛋白質提取過程發現,pH值為時茶葉蛋白提取效果最好,提取率達到36·8%,初步純化得率為91·0%.李殿寶[9]在從葵花脫脂粕中提取蛋白質時將蛋白溶液的pH值調到3~4,使目標蛋白於等電點沉澱出來.等電點沉澱法還應用於葡萄籽中蛋白質的提取.李鳳英等[10]測得葡萄籽蛋白質的等電點為3·8.他們利用鹼溶法提取葡萄籽蛋白質,得到了最佳的提取工藝為:以1×10-5mol·L-1的NaOH溶液,按1∶5的料液比,在40℃攪拌40 min,葡萄籽蛋白質提取率達73·78%.另外還可以利用鹼法提取大米蛋白,其持水性、吸油性和起泡性等均優於酶法提取[11].利用酸法提取得到的鰱魚魚肉蛋白質無腥味、色澤潔白,蛋白質產率高達90%[12].
蛋白質的鹽溶和鹽析是中性鹽顯著影響球狀蛋白質溶解度的現象,其中,增加蛋白質溶解度的現象稱鹽溶,反之為鹽析.應當指出,同樣濃度的二價離子中性鹽,如MgCl2、(NH4)2SO4對蛋白質溶解度影響的效果,要比一價離子中性鹽如NaCl、NH4Cl大得多.在葡萄籽蛋白提取工藝中除了可以利用鹼溶法還可以利用鹽溶法來提取蛋白質,其最佳提取工藝是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃攪拌提取30min,蛋白質提取率為57·25%[10].鹽析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸鈉絮凝法、硫酸銨鹽析法,其中硫酸銨鹽析法廣泛應用於生產.由於硫酸銨在水中呈酸性,為防止其對蛋白質的破壞,應用氨水調pH值至中性.為防止不同分子之間產生共沉澱現象,蛋白質樣品的含量一般控制在0·2% ~2·0%.利用鹽溶和鹽析對蛋白質進行提純後,通常要使用透析或者凝膠過濾的方法除去中性鹽[13].
有機溶劑提取法的原理是:與水互溶的有機溶劑(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白質在水中的溶解度顯著降低;而且在一定溫度、pH值和離子強度下,引起蛋白質沉澱的有機溶劑的濃度不同,因此,控制有機溶劑的濃度可以分離純化蛋白質.例如,在冰浴中磁力攪拌下,在4℃預冷的培養液中緩慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,從而純化冰核蛋白[14].由於在室溫下,有機溶劑不僅能引起蛋白質的沉澱,而且伴隨著變性.因此,通常要將有機溶劑冷卻,然後在不斷攪拌下加入有機溶劑防止局部濃度過高,蛋白質變性問題就可以很大程度上得到解決.對於一些和脂質結合比較牢固或分子中極性側鏈較多、不溶於水的蛋白質,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有機溶劑提取,它們有一定的親水性和較強的親脂性,是理想的提取液.冷乙醇分離法提取免疫球蛋白最早由Cohn於1949年提出,用於制備丙種球蛋白.冷乙醇法也是目前WHO規程和中國生物製品規程推薦的方法,不僅解析度高、提純效果好、可同時分離多種血漿成分,而且有抑菌、清除和滅病毒的作用[15].
萃取是分離和提純有機化合物常用的一種方法,而雙水相萃取和反膠團萃取可以用來分離蛋白質.雙水相萃取技術(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指親水性聚合物水溶液在一定條件下形成雙水相,由於被分離物在兩相中分配的不同,便可實現分離,被廣泛用於生物化學、細胞生物學和生物化工等領域的產品分離和提取.此方法可以在室溫環境下進行,雙水相中的聚合物還可以提高蛋白質的穩定性,收率較高.對於細胞內的蛋白質,需要先對細胞進行有效破碎.目的蛋白常分布在上相並得到濃縮,細胞碎片等固體物分布在下相中.採用雙水相系統濃縮目的蛋白,受聚合物分子量及濃度、溶液pH值、離子強度、鹽類型及濃度的影響[16].
反膠團萃取法是利用反膠團將蛋白質包裹其中而達到提取蛋白質的目的.反膠團是當表面活性劑
在非極性有機溶劑溶解時自發聚集而形成的一種納米尺寸的聚集體.這種方法的優點是萃取過程中蛋
白質因位於反膠團的內部而受到反膠團的保護.程世賢等[17]就利用反膠團萃取法提取了大豆中的蛋白質.
3.根據電荷不同進行分離純化
根據蛋白質的電荷即酸鹼性質不同分離蛋白質的方法有電泳和離子交換層析兩類.
在外電場的作用下,帶電顆粒(如不處於等電點狀態的蛋白質分子)將向著與其電性相反的電極移動,這
種現象稱為電泳.聚丙烯醯胺電泳是一種以聚丙烯醯胺為介質的區帶電泳,常用於分離蛋白質.它的優點是設備簡單、操作方便、樣品用量少.等電聚焦是一種高解析度的蛋白質分離技術,也可以用於蛋白質的等電點測定.利用等電聚焦技術分離蛋白質混合物是在具有pH梯度的介質中進行的.在外電場作用下各種蛋白質將移向並聚焦在等於其等電點的pH值梯度處形成一個窄條帶.孫臣忠等[18]研究了聚丙烯醯胺電泳、等電聚焦電泳和等速提純電泳在分離純化蛋白質中的應用.結果發現,聚丙烯醯胺電泳的條帶解析度低,加樣量不高;等電聚焦電泳解析度最高,可以分離同種蛋白的亞成分,加樣量最小;等速提純電泳區帶解析度較高,可將樣品分成單一成分,加樣量最大.
離子交換層析(Ion exchange chromatography,IEC)是以離子交換劑為固定相,依據流動相中的組分離子與交換劑上的平衡離子進行可逆交換時結合力大小的差別而進行分離的一種層析方法.離子交換層析中,基質由帶有電荷的樹脂或纖維素組成.帶有正電荷的為陰離子交換樹脂;反之為陽離子交換樹脂.離子交換層析同樣可以用於蛋白質的分離純化.當蛋白質處於不同的pH值條件下,其帶電狀況也不同.陰離子交換基質結合帶有負電荷的蛋白質,被留在層析柱上,通過提高洗脫液中的鹽濃度,將吸附在層析柱上的蛋白質洗脫下來,其中結合較弱的蛋白質首先被洗脫下來.反之陽離子交換基質結合帶有正電荷的蛋白質,結合的蛋白可以通過逐步增加洗脫液中的鹽濃度或是提高洗脫液的pH值洗脫下來.李全宏等[19]將離子交換層析應用於濃縮蘋果汁中蛋白質的提純.另外,離子交換層析還用於抗凝血蛋白的提取[7].
4. 利用對配體的特異親和力進行分離純化
親和層析是利用蛋白質分子對其配體分子特有的識別能力(即生物學親和力)建立起來的一種有效的純化方法.它通常只需一步處理即可將目的蛋白質從復雜的混合物中分離出來,並且純度相當高.應用親和層析須了解純化物質的結構和生物學特性,以便設計出最好的分離條件.近年來,親和層析技術被廣泛應用於靶標蛋白尤其是疫苗的分離純化,特別是在融合蛋白的分離純化上,親和層析更是起到了舉足輕重的作用,因為融合蛋白具有特異性結合能力[20].親和層析在基因工程亞單位疫苗的分離純化中應用也相當廣泛[21].范繼業等[22]利用殼聚糖親和層析提取的抑肽酶比活達到71 428 BAEE·mg-1,純化回收率達到62·5%.該方法成本較低,吸附劑價格低廉、機械強度高、抗污染能力較強、非特異性吸附較小、可反復使用、適用性廣,產品質量穩定.

㈡ 外泌體提取策略

外泌體即細胞外囊泡（簡孫納卜稱EVs）是所有細胞主動分泌的納米級囊泡,活細胞釋放不同類型的細胞外囊泡進入細胞外環境進行細胞間交流,細胞外囊泡越來越多地被認為是有希望的液體活檢生物學標志物｡根據相似囊泡的直徑大小可將細胞外囊泡分為三類,直徑在50-150nm的外泌體,直徑在100-1000nm的微囊泡､外粒體和微顆粒,直徑在-100-5000nm的凋亡小體｡目前主要認為,外泌體產生的過程是細胞膜內陷形成內體,再形成多泡體,多泡體與質膜融合導致其管腔內囊泡釋放到細胞外,產生一種稱為外泌體的EV亞型｡

2 外泌體的提取純化方法

2.1 基於密度的分離方法

2.1.1 超速離心法

超速離心法是最常用的外泌體提取方法,首先,施加較低速度的離心力300g以從細胞培養液中去除細胞;然後,對上清液施加較大的離心力(10000-20000g),去除大的細胞碎片和破碎的細胞器;最後,再次進行高速(100000-150000g)離心從 上清液 中收集外泌體,所有離心在4℃下進行｡超速離心法獲得的外泌體不被分離試劑污染,且分離數量多,處理樣本小｡盡管超速離心法是提取外泌體最廣泛的「金標准」,但仍然有很多缺點,如所需的超高速離心儀器比較昂貴､樣品量大､耗時長､電鏡觀察外泌體時仍存在蛋白質污染｡

2.1.2 蔗糖密度梯度離心法

目前已發現,外泌體在蔗糖梯度為1.15-1.19g/mL密度中漂浮,所以根據這個特性,可以將樣品與蔗糖梯度溶液一起超速離心,外泌體沉降到不同的密度區域就可以將其區分出來｡蔗糖密度梯度離心法需要預先配好連續梯度濃度的蔗糖溶液,將蔗糖溶液鋪於離心管底部,再將樣本放於上部,4℃下100000g超速離心｡蔗糖密度梯度離心法獲得的外泌體純度較高,但是前期准備復雜,耗時長,又不能完全將外泌體與蛋白質分離開｡2013年10月ISEV會議一些研究人員表示,通過蔗糖密度梯度離心法分離囊泡時,細胞囊泡的生物功能喪失｡

2.2 沉澱法

2.2.1  聚乙二醇 (PEG)

PEG 是一種水溶性非離子化合物,具有極強的親水性,可以與疏水的脂質雙分子層結合,從而改變外泌體的溶解度而使外泌體沉澱｡RIDER等研究發現,PEG水平會影響外泌體的產率,且從外泌體中獲得的總蛋白和RNA在數量和質量上足以用於蛋白質組學和測序分析｡沉澱法操作簡單,不需要特殊設備,更經濟,外泌體產量高,但是會沉澱一些非外泌體的疏水性物質而導致外泌體純度不夠｡

2.2.2 試劑盒法

最近已經開發出基於聚合物共沉澱的試劑盒,如ExoQuick､TEI等,可用於提取多種體液中的外泌體｡聚合物沉澱劑ExoQuick與樣品4℃共孵育30min,然後室溫1500g離心30min,即可獲得外泌體沉澱｡與超速離心法比較,試劑盒法更簡便､耗時短,且能獲得更高的外泌體產量｡試劑盒法獲得外泌體沉澱含有的雜質較多,不同來源的樣本需要使用不同的試劑盒來進行提取,且試劑盒價格較貴｡

2.3 基於大小的分離方法

2.3.1 SEC SEC

主要根據外泌體的大小對外泌體進行分離和純化｡樣品中大分子物質不能進入凝膠孔而被流動相快速洗脫出來,尺寸小於孔徑的物質可進入多孔材料,需要較長時間被洗脫出來,即可通過不同的洗脫時間分離外泌體｡BING等證明了瓊脂糖凝膠可以從無血小板上清液中純化出外泌體,通過這種方法茄吵,外泌體很容易從蛋白質和高密度脂蛋白中分離出來｡HONG等通過改編和使用mini-SEC方法能夠有效分離出外泌體,與漫長而復雜的超速離心法不同,它可在30min內完成外泌體分離｡通過SEC分離的外泌體純度較高,分離出結構上完整且功能活躍的囊泡是基於微型SEC分離的重要優勢,但數量較少,而且需要特殊設備,故應用不廣泛｡

2.3.2超濾法

超濾法是根據外泌體的大小使用相應孔徑的濾膜,將樣品中小分子物質過濾到膜的另一側,而將大分子物質滯留在膜上來達到分離的目的｡超慮法簡單､省時､成本低｡LIU等改則穗良了簡單的超濾法,通過將不同孔徑的膜(200､100､80､50､30nm)串聯在一起,實現了不同大小外泌體的快速分離,且捕獲效率明顯高於超速離心法｡然而,過濾器很容易被囊泡和其他大分子物質堵塞,這種情況很容易導致膜壓力過大而破碎｡

2.4 基於表面成分親和力的分離法

2.4.1 蛋白質

外泌體表面含有豐富的蛋白質,所以基於其表面成分的親和力特別適合於分離外泌體｡CD63是外泌體中發現的最豐富的蛋白質之一,因此,常用抗CD63免疫吸附外泌體｡ZHAO等通過使用抗CD63包裹的磁珠與血液樣品不斷混合,將外泌體捕獲到磁珠上後,加 緩沖液 沖洗5min,然後引入3種不同熒光染料標記的抗體[抗CD24､抗上皮細胞黏附分子(抗EpCAM)､抗糖類抗原-125(抗CA-125)],通過觀察不同熒光強度可以量化卵巢癌中不同腫瘤標志物的表達水平｡

2.4.2 膜磷脂

雖然大部分基於表面成分的親和方法是基於外泌體表面的蛋白質,但是脂質雙層也是一種很好的檢測目標｡XU等利用外泌體膜上表達的磷脂醯 絲氨酸 (PS)可以被PS結合受體Tim4很好地結合,用Tim4固定化的磁珠與樣品反應進行外泌體捕獲,並且觀察到洗脫的外泌體保持著完整的形態,與商業外泌體提取試劑盒相比,表現出更高的捕獲率｡CHEN等利用外泌體將帶負電荷的PS暴露在膜上的特點,使用帶正電荷基團的離子交換樹脂的磁珠與血漿樣品反應,血漿中的外泌體就能與磁珠結合,通過這種方法分離的外泌體具有比超速離心法更高的回收率和更少的雜質蛋白｡

2.5   ACE分離法

ACE微陣列產生的介電泳(DEP)分離力是通過施加交流電場產生的,納米級的粒子和其他納米級實體物質被吸引到圓形微電極邊緣周圍的DEP高場區域,細胞和大的實體物質被吸引到DEP低場區域｡ IBS EN等的ACE裝置需要30-50μL血漿樣品就能夠在15min內將外泌體濃縮到微電極周圍的高場區域｡ACE設備流程明顯快於目前使用的方法,這個裝置簡化了外泌體提取和回收過程的能力,明顯減少了加工步驟和消耗時間｡CHEN等構建了具有交叉電極的DEP晶元,能在30min內從血漿樣品中分離出外泌體｡經過測試證明,DEP晶元具有高捕獲率和高回收率,需要的時間更短,並且不需要笨重和貴重的儀器｡

2.6 微流控晶元法

微流控晶元法是新開發出來的用於快速高效分離樣品中外泌體的方法｡WOO等使用2個納米過濾器(Exodisc)集成的實驗盤在30min內實現了20-600nm外泌體的全自動富集｡使用納米粒子跟蹤分析定量檢測證實了細胞培養上清液中外泌體的回收率大於95%｡與超速離心法相比,Exodisc提供了高出100倍的mRNA水平,更省時,所需樣本量更少｡FANG等開發了一種微流體晶元,將包裹了抗CD63的磁珠與血漿樣品通入晶元,在第1個腔室中捕獲到外泌體,通入一抗與磁珠-外泌體混合物結合,再通入熒游標記的二抗形成磁珠-外泌體-一抗-二抗混合物聚集在第2個腔室｡微流控晶元法操作簡單,捕獲率高,特別適合於生物學研究｡外泌體作為癌症診斷的有前景的生物學標志物,其在癌症的液體 活檢 中受到關注｡外泌體的生物學價值和臨床應用價值凸顯了開發有效提取和分離外泌體技術的重要性和必要性｡相信隨著技術的不斷進步和創新,外泌體提取將變得更加簡便經濟,純度越來越高,完整性越來越好｡

提取後往往需要進一步檢測，確定提取的是不是外泌體。有三種方法：1. 掃描電鏡觀察；2. NTA儀器粒徑檢測；3. WB檢測。如圖所示，在外泌體上往往存在許多標志物，這時候就可以選擇相應的抗體進行WB檢測。根據22 篇外泌體相關文獻的統計，排在前4 位的檢測指標為 CD63（13/22）、Tsg101(8/22)、CD9 和CD81並列第三位（6/22）；接著檢測較多的4 個指標為Alix （4/22）、HSP70(3/22)、flotillin (3/22)和Syntenin (2/22)；此外還有一些指標僅在1 篇文獻中出現過，例如HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、nicastrin、AChE、AQP2、RPL5、a-1AT。針對外泌體的定性檢測至少選擇兩個指標就能滿足文章發表需要了，比如檢測CD63 和Tsg101。 

㈢ 生物分析 | 葯物-血漿蛋白結合率研究的方法和要求

在葯物研發的旅程中，葯物與血漿蛋白的相互作用起著關鍵作用，血漿蛋白結合率（PPB）揭示了葯物的有效活性成分。這一比率越高，葯物在游離狀態下的濃度越大，葯效往往更為顯著。了解PPB是評估葯物代謝和分布的重要步驟，測定方法包括平衡透析（ED）、超濾（UF）和超速離心（UC）。

表1/2中，詳細列出了依據化合物性質，體外或體內研究中各種技術的使用頻率，為實驗設計提供了指導原則。[3]

㈣ 心力衰竭超濾治療有什麼價值

摘要

容量負荷過重是心力衰竭患者反復住院的主要原因，鈉瀦留是核心的病理生理環節，而血液超濾是治療液體瀦留的「金標准」。現有證據表明超濾能改善心力衰竭轉歸，降低再住院率。本綜述闡述了超濾治療心力衰竭的機制、有效性、安全性、適應症以及未來的研究方向。

關鍵詞：超濾 心衰 鈉水瀦留

The Future and Current Role of Ultra?ltration in Patients with Heart Failure

Abstract

The high readmission rates of heart failure is e mainly to fluid overload and sodium retention plays a pivotal role in the pathophysiologic process. Ultrafiltration is the gold standard for sodium-volume removal. The available evidence supports Ultrafiltration improve outcomes in patients with acute decompensated heart failure. This review illustrates technical issues, mechanisms, efficacy, safety, indications and directions of ultrafiltration in heart failure.

Key words: Ultrafiltration, heart failure, sodium and water retention

充血性心力衰竭（congestive heart failure，CHF）患者常因心功能失代償需要反復住院治療，社會及經濟負擔巨大，已成為最嚴重的全球性健康問題之一。容量負荷過重和肺充血是絕大多數急性失代償心衰（acute decompensated heart failure，ADHF）患者住院的主要原因。血液超濾是治療鈉水瀦留的「金標准」，採用超濾技術有效處理充血顯示了很好的前景，已成為國際研究熱點。

鈉在CHF中的重要作用

鈉離子是細胞外液最重要的離子，體內鈉總量決定了細胞外液的總量。CHF患者水腫發生的主要原因首先是體內鈉總量的增加，而不是水。CHF時鈉水瀦留首先是鈉瀦留，這是交感-腎上腺系統和腎素-血管緊張素-醛固酮系統激活，腎小管鈉重吸收增加的結果。鈉的增加必然伴隨體內水的蓄積，最終導致細胞外液量增加。同時，鈉瀦留也構成了放大神經內分泌激活反饋環的一部分。

鈉水瀦留導致肺充血和心室充盈壓升高，臨床表現為呼吸困難、端坐呼吸、艫取M，室壁張力增加會使冠脈灌注減少，導致心內膜下心肌缺血，加速細胞凋亡、壞死。另外，室腔擴大和心室球形重塑引起或加重二尖瓣和三尖瓣返流，造成心功能進一步惡化。這些不良的病理生理後果是最終進一步惡化心室收縮和舒張功能。右心壓力上升引起心肌間質水腫、心肌收縮力下降。靜脈壓升高臨床上會導致腎血流下降、腎小球濾過率降低和鈉排泌減少。因此，如何安全有效地處理容量負荷是CHF治療的重要靶標。

利尿劑面臨的挑戰

利尿劑是目前糾正容量負荷過重、緩解肺充血症狀最常用的葯物，但是利尿劑的效果不盡人意。大量的研究顯示，即使規范化治療的住院病人，多數CHF病人的容量負荷過重也沒有得到有效糾正。ADHERE注冊研究中，21的病人出院時體重沒有變化甚至增加；住院過程中，體重減少小於10磅者佔74，也就是說體重不達標者近3/4。利尿劑抵抗也是心衰利尿治療難題之一, 約占心衰患者中的1/3。

呋塞米會激活神經內分泌系統，降低腎小球濾過率。靜脈使用呋塞米，使腎素、醛固酮、去甲腎上腺素升高。Bayliss等的研究表明，使用呋塞米4周，會使血漿腎素和醛固酮水平持續增加。事實上，神經內分泌激活與病死率直接相關。早在1987年就有學者研究發現，單次靜脈使用呋塞米使腎小球濾過率降低15，腎血流也相應下降。Gottlieb等對63例CHF病人的研究發現，呋塞米會明顯降低腎小球濾過率。腎小球濾過率越低，需要的利尿劑劑量就越大，病死率就越高。

利尿劑對CHF遠期轉歸的影響，迄今為止尚無隨機對照臨床試驗數據。但ADHERE研究發現，使用利尿劑和肌酐水平升高者死亡率更高，住院時間更長。有腎功能不全且同時使用利尿劑者，死亡率為7.8，不使用者為5.5；腎功能正常同時使用利尿劑者死亡率為3.3，不使用者2.7。死亡率最高的一組是肌酐升高且長期使用利尿劑患者。該研究還發現，無論治療初始的腎功能如何，長期使用利尿劑治療的死亡率更高。

在尋證醫學的時代，這一目前「最好」的緩解症狀的治療工具，因為自身葯理性質的限制，違背了總的治療目標，可能導致有違初衷的結果。

血液超濾是糾正鈉水瀦留的「金標准」

採用血液超濾脫水糾正鈉水瀦留已有30餘年歷史。與腎小球濾過原理類似，濾器在超濾泵負壓吸引下，利用半透膜兩側建立的壓力梯度濾出水分及中小分子物質，蛋白和血細胞不能透過濾膜孔而被留存，形成超濾液。超濾液的形成不依賴溶質濃度梯度，鈉和水等小分子溶質能自由通過半透膜。臨床上可以根據病人的具體負荷狀況，確定需要清除的鈉和水的總量，實現可調、可控、可預測的機械脫水。超濾液成份相當於原尿，電解質濃度和晶體滲透壓與血漿相同。因此，單純超濾前後血漿鉀、鈉、氯、碳酸氫鹽等變化不明顯，不會造成電解質和酸鹼平衡紊亂。

超濾緩解鈉瀦留優於利尿劑。緩解鈉水瀦留的核心是鈉，人體鈉總量決定細胞外液總量，決定充血症狀的程度。以呋塞米為代表的利尿劑產生的是低張尿，尿鈉濃度約為60mEq/L，正常血鈉濃度為140時，每排出1L尿，會有80mEq的鈉存留體內，如果體內有10L的鈉水瀦留，充分利尿後會有800mEq（18.4g）鈉滯留體內。超濾液鈉濃度與血漿相等，因此，與利尿劑比較等量的液體清除，超濾的排鈉量更多，排鈉能力強於利尿劑。

超濾機械脫水對CHF病人有良好的血流動力學效應。Marenzi等測量了24例CHF患者超濾前後的血流動力學反應。總超濾量為4880±896ml，隨著超濾量的增加，肺毛壓（PWP）和右房壓（RAP）逐步下降，心排量（CO）和每搏量（SV）提高。

臨床試驗證明超濾治療優於利尿劑

血液超濾治療CHF的臨床觀察已有30餘年歷史，主要雜志上已發表了100餘篇論文。但早期的研究採用的是傳統CRRT或血液透析設備，因為臨床使用不便，這些研究多為單中心和小樣本的零星研究，難以形成有力的證據。隨著攜帶型心衰專用單純超濾設備的出現，超濾治療CHF重新引起了臨床極大的關注。

Dahle等的研究針對ADHF病人首先驗證了採用外周靜脈建立體外循環實現血液超濾是可行的。9例ADHF患者使用2個18G靜脈導管建立淺表靜-靜脈超濾，超濾持續33.3±20小時，總超濾量7.0±4.9L，患者體重下降6.2±5.0kg。為CHF現代超濾治療奠定了基礎。

RAPID-CHF試驗[9]共入選40例ADHF病人，在入院24小時內隨機分配到早期超濾或利尿劑組，超濾組限定單次8小時治療。超濾組和利尿劑組24小時平均液體清除量分別為4650ml和2838ml（p＝0.001），主要終點體重下降分別為2.5kg和1.86kg（p＝0.240）。在清除液體而言，超濾治療優於利尿劑，而且超濾過程安全，病人耐受良好。

Costanzo等[10]對20例ADHF伴利尿劑抵抗的患者，入院早期（4.7±3.5小時）開始超濾治療。結果顯示，平均總超濾量達到8654±4205ml，12例患者（60）3天內出院。與超濾前基線數據比較，隨訪第30天和90天的體重明顯下降（p=0.06）,症狀明顯改善（p=0.003），血肌酐沒有明顯變化。超濾能夠安全有效的縮短住院時間，改善心功能狀態，臨床獲益持續3個月。

UNLOAD研究是迄今最大規模的評價超濾治療ADHF隨機對照試驗。該研究共28個中心參加，入選200例收縮期心衰住院患者，隨機分到早期超濾組（住院24小時內）或常規利尿組。超濾組住院後48小時內不用利尿劑，超濾量和速度（最大500ml/h）由負責醫師確定。常規利尿治療組靜脈使用利尿劑是門診劑量的2倍以上。

結果顯示，超濾組比靜脈利尿劑組體重降低更多（5.0±3.1 vs 3.1±3.5kg，p=0.001），呼吸困難緩解兩組相似。超濾組90天再住院率更低（18.6 vs 32.2，p=0.04）。安全指標方面，超濾組低血鉀更少（1 vs 12,p=0.018）,出院時肌酐升高（＞0.3mg/dl）的比例兩組相似（22.6 19.8, p=0.709）。

UNLOAD試驗回答了超濾治療ADHF的幾個重要問題。超濾在降低體重和減少再住院等終點指標上，優於常規葯物治療。對於CHF遠期轉歸，超濾明顯減少再住院和對醫療資源的佔用。試驗證明超濾治療CHF是安全的。

急性失代償性心衰心腎挽救研究（Cardiorenal Rescue Study in Acute Decompensated Heart Failure ,CARRESS-HF）是近期發表的一項重要研究。該研究入選的是急性失代償心衰伴腎功能惡化的患者，共納入188例患者，隨機分為階梯葯物治療或血液超濾治療組，葯物治療組調整利尿劑和其他葯物直到每日尿量達到3-5L。研究主要終點為96 h患者體重和血肌酐水平的變化。結果顯示，兩種治療策略在體重減輕方面作用相似（5.5±5.1kg vs 5.7±3.9kg，p=0.58）；階梯葯物治療組血肌酐無明顯變化，而超濾組肌酐明顯升高（-3.5±46.9μmol/L vs 20.3±61.9μmol/L，p=0.003）；兩組死亡率和因心衰住院率方面無差別，但血液超濾組有更多的嚴重不良事件（72對57，P=0.03）。

在超濾治療ADHF研究陽性結果一邊倒的情況下，這是一項非常有意義的研究。對於ADHF伴腎功能惡化的患者，超濾治療並不優於強化葯物治療方案，它可引起更多的腎功能惡化。同時，研究者也注意到，針對心腎綜合征這一特定的患者人群，無論採取哪種治療策略，總體預後都很差，1/3的患者在60天因心衰死亡或再次住院。治療這些患者仍是一個挑戰，需要尋找更好的治療方法。

在對利尿劑反應差的患者中，血液超濾是很好的替代，該研究未納入此類患者。研究中患者出現腎功能惡化的原因尚不清楚，腎功能惡化可能是不良事件增多的原因。同時，也有學者認為血肌酐的一過性升高不一定反映了腎功能的惡化，也有可能與血液濃縮有關，減慢超濾速度可能有較好效果。

日常臨床實踐中，葯物治療緩解充血，每個醫院的用葯差異很大。達到CARRESS-HF研究葯物階梯治療的每日3-5L尿量不太現實。ADHERE資料庫中，73的ADHF住院期間體重下降＜4.5kg，而該研究中平均體重下降為5.5kg。

ADHF出現心腎綜合征是最大神經內分泌激活和嚴重心腎軸紊亂的表現，針對ADHF病理生理下游的任何治療（包括超濾）都不會根本改善臨床轉歸。早期使用超濾可能獲益最大，而不是到了晚期作為挽救性治療。

AVOID-HF研究是正在進行的一項隨機對照試驗，該研究計劃入選800例肌酐＜3mg/dl的ADHF患者。研究目的是與靜脈利尿劑比較，考察超濾是否能減少這類病人的心衰事件。這是迄今入選樣本量最大的研究，期待能回答超濾治療對心衰事件的影響。

超濾作為治療CHF的新方法，已發表的臨床研究加深了我們對心衰的認識，並顯示了很好的治療前景。但是仍有諸多問題有待回答，比如，明確界定超濾的最佳指證和超濾治療的最佳時機，什麼類型病人獲益最大？有沒有其他難以預測的副作用？未來需要更多、更大規模臨床試驗來回答這些問題。

㈤ 濾過作用的原理

1.機械屏障-濾孔
濾過膜由三層結構組成(圖)
①內層是毛細血管的內皮細胞。內皮細胞有上許多直徑50-100nm的小孔，稱為窗孔(fenestration)，它可防止血細胞通過，但對血漿蛋白的濾過可能不起阻留作用。
②中間層是非細胞性的基膜，是濾過膜的主要濾過屏障。基膜是由水合凝膠(hydrated gel)構成的微纖維網結構，水和部分溶質可以通過微纖維網的網孔。有人把分離的基膜經特殊染色證明有4-8nm的多角形網孔。微纖維網孔的大小可能決定著分子大小不同的溶質何者可以濾過。
③外層是腎小囊的上皮細胞。上皮細胞具有足突，相互交錯的足突之間形成裂隙。裂隙上有一層濾過裂隙膜(filtration slit membrane)，膜上有直徑4-14nm的孔它是濾過的最後一道屏障。通過內、中兩層的物質最後將經裂隙膜濾出，裂隙膜在超濾作用中也很重要。
2.電學屏障
濾過膜各層含有許多帶負電荷的物質，主要為糖蛋白。這些帶負電荷的物質排斥帶帶負電荷的血漿蛋白，限制它們的濾過。腎在病理情況下，濾過膜上帶負電荷的糖蛋白減少或消失，就會導致帶負電荷的血漿蛋白濾過量比正常時明顯增加，從而出現蛋白尿。
人體兩側腎全部腎小球毛細血管總面積估計在1.5以上，這樣大的濾過面積有利於血漿的濾過。在正常情況下，人兩腎的全部腎小球濾過面積可以保持穩定。但是在急性腎小球腎炎時，由於腎小球毛細血管管腔變窄或完全阻塞，以致有濾過功能的腎小球數量減少，有效濾過面積也因而減少，導致腎小球濾過率降低，結果出現少尿(每晝夜尿量在100-500ml之間)以致無尿(每晝夜尿量不到100ml)。 腎小球濾過作用的動力是有效濾過壓。
腎小球有效濾過壓=(腎小球毛細血管壓+囊內液膠體滲透壓)-(血漿膠體滲透壓+腎小囊內壓)(圖)。由於腎小囊內的濾過液中蛋白質濃度較低，其膠體滲透壓可忽力略不計。因此，腎小球毛細血管血壓是濾出的唯一動力，而血漿膠滲透壓和囊內壓則是濾出的阻力。有效濾過壓=腎小球毛細血管壓-(血漿膠體滲透壓+腎小囊內壓)。皮質腎單位的進球小動脈粗而短，血流阻力較小；出球小動脈細而長，血流阻力較大。因此，腎小球毛細血管血壓較其它器官的毛細血管血壓高。用微穿刺法沒得腎小球毛細血管平均值6.0kPa(45mmHg)(為主動脈平均壓的40%左右)；用微穿法還發現，由腎小球毛血管的進球端到出球端，血壓下降不多，兩端的血壓幾乎相等。腎小囊內壓與近曲小管內壓力相近。囊內壓為1.3kPa(10mmHg)。據測定，在大鼠的腎小球毛細血管進球端的血漿膠體滲透壓約為3.3kPa(25mmHg)左右。
在進球端，有效濾過壓=6.0-(3.3+1.3)=1.4kPa。但腎小球毛細血管內的血漿膠體滲透壓不是固定不變的。在血液流經腎小球毛細血管時，由於不斷生成濾過液，血液中血漿蛋白濃度就會逐漸增加，血漿膠體滲透壓也隨之升高。因此，有效濾過壓也逐漸下降。當有效濾過壓下降到零時，就達到濾過平衡(filtration equilibrium)，濾過便停止了(圖)。由此可見，不是腎小球毛細血管全段都有濾過作用，只有從進球小動脈端到濾過平衡這一段才有濾過作用。濾過平衡越靠近進球小動脈端，有效濾過的毛細血管長度就越短，有效濾過壓和面積就越小，腎小球濾過率就低。相反，濾過平衡越靠近出球小動脈端，有效濾過的毛細血管長度越長，有效濾過壓和濾過面積就越大，腎小球濾過率就越高。如果達不到濾過平衡，全段毛細血管都有濾過作用(圖)。