⑴ 一文了解離子色譜（IC)
離子色譜，一種高效液相色譜技術，又稱高效離子色譜（HPIC）或現代離子色譜。其檢測原理基於溶液中電離物質的電導性，通過檢測電導值來分析物質的電離程度，適用於親水性陰、陽離子的分離。
離子色譜的分離原理基於離子交換樹脂與流動相中溶質離子間的可逆交換和分析物溶質對交換劑親和力的差異，使得離子在柱中分離。以檢驗亞硝酸鹽為例，亞硝酸根離子首先與分析柱的離子交換位置進行離子交換，並被淋洗液中的OH-基置換洗脫。依據離子對樹脂親和力的強弱，分析物離子依次洗脫，實現分離。
抑制器在離子色譜中扮演重要角色，它降低淋洗液背景電導並提升被測離子的電導率，改善信噪比。在進行微量或超微量分析時，避免污染是關鍵，需在采樣、存儲和分析階段採取嚴格措施。對於高濃度樣品，適當稀釋有助於減少干擾。
離子色譜的儀器構成包括流路系統、抑制器、淋洗液發生器、試劑與試劑水、標准貯備液、離子色譜儀、分析柱、樣品定量環、容量瓶與樣品瓶等。試劑水及淋洗液的純度直接影響檢測限，建議使用高純水器配製。分析柱的選擇應根據具體需求進行。
離子色譜方法包括離子對色譜、離子交換色譜與離子排斥色譜。離子交換色譜是離子色譜中最重要的分離方式，通過固定相與流動相的極性差異，實現離子的分離。離子對色譜通過加入親脂性物質，生成非極性分子在反相模式下分離。離子排斥色譜利用固定相表面的Donan膜，依據分子的離解常數進行分離。
離子色譜廣泛應用於多個領域。在食品檢測中，可用於粉絲、腐竹、麵粉等水發食品中吊白塊的檢測，奶製品中三聚氰胺、亞硝酸根和硝酸根的檢測，飲用水中消毒副產物的檢測，以及食品中添加劑和防腐劑的檢測。在環境檢測中，可用於水體中生物多胺的檢測，碳酸飲料中甜味劑和防腐劑的檢測。在化工領域，離子色譜在電鍍、石油、制葯廢水和日用化學品中的應用廣泛。此外，離子色譜還可用於科研中的離子液中吡啶和咪唑鹽類物質的檢測，以及安全治安中無機炸葯中陰離子的檢測。
離子色譜在多個領域展現出強大的應用潛力，提供了一種高效、准確的分離和檢測離子型化合物的方法。
⑵ 原核表達產物純化後有一條非目的蛋白條帶，怎麼辦
如果有抗體，做個western blot判斷下，是雜帶還是降解片段；
如果是雜帶，優先考慮優化你使用的純化方案，如Ni柱，考慮延長washing buffer的時間和提高咪唑濃度，使用解析度更好的填料；
還去不掉，考慮用2步或3步純化，比如用離子交換、凝膠過濾。
個人見解，僅供參考，祝一切愉快！
⑶ 我也是做蛋白純化的，有種蛋白第一次純化時，也是非常雜，你之前又遇到過類似情況有什麼經驗嗎xiexie
一般可溶性表達都會遇同類問題，個人覺得有如下方面可以考慮：
仔細研究填料的說明書，同樣是His-tag或GST標簽的填料，但不同廠家，或者不同解析度，其緩沖液和洗脫濃度都是有差異的，務必注意！比如，在選擇填料時，可選擇顆粒稍微細些的填料，解析度會更好些。
在樣品的各階段都要控制雜蛋白，以最常見的His-tag，可溶表達為例，上樣時，加入低濃度（5-10mM咪唑）；上樣後，多洗幾個柱體積的緩沖液及低濃度咪唑（20-50mM），更多的洗掉雜蛋白（請注意，在這個過程也會伴隨目標蛋白的緩慢洗脫，會一定程度降低得率，所以需要優化時間和濃度）；再採用梯度咪唑洗脫目標蛋白。（所以，第一次用連續梯度洗脫，觀察最佳洗脫的咪唑濃度是很有必要的）；
如果一種方法（如親和）經過優化，某些雜蛋白可能就是難以分離，仍不足以得到理想的純度，完全可以採用第二步純化，如離子交換，往往會達到事半功倍的效果，比你總折騰一種方法劃算。
個人見解，歡迎繼續討論，祝實驗順利！
⑷ 干貨分享 | 蛋白提取純化具體步驟
蛋白提取純化詳解：步驟、方法與注意事項
蛋白提取純化主要分為三個步驟：前處理、粗分離與精細分離。
- **前處理**：確保組織或細胞中的目標蛋白以溶解狀態釋放，保持其天然狀態，避免生物活性的丟失。動物材料應剔除結締組織與脂肪組織，種子材料去殼或種皮，油料種子先脫脂。組織和細胞的破碎採用電動搗碎機、勻漿機、超聲波或化學試劑進行，隨後使用緩沖液提取所需蛋白，去除細胞碎片，通過離心或過濾分離出目標蛋白。
- **粗分離**：將蛋白提取液與雜質分開，常用方法包括超濾、鹽析、等電點沉澱與有機溶劑分級分離。這些方法便於處理大量樣本，同時有效去除雜質，濃縮蛋白溶液。
- **精細分離**：利用層析法，如離子交換層析、親和層析、疏水層析與分子篩，進一步純化蛋白。電泳法如區帶電泳、等電點聚焦也可作為最後的純化步驟。這些方法對純化精度要求高，適合小規模分離。
- **提取方法**：蛋白質提取主要依賴溶劑，水溶液提取法使用稀鹽和緩沖系統，適用於大部分蛋白質。有機溶劑提取法用於與脂類結合牢固的蛋白質，需在低溫下操作。
- **分離純化**：根據蛋白質溶解度的不同選擇分離方法。如鹽析法通過調整鹽濃度改變蛋白質溶解度，實現分離；等電點沉澱法利用pH調節使蛋白質沉澱；低溫有機溶劑沉澱法通過改變溶劑環境實現分離。
進行蛋白純化時，需注意維護蛋白質的穩定性與活性。選擇合適的標簽有利於純化與保持活性。了解蛋白純化標簽的特性和適用范圍至關重要。疏水性質的反向HPLC方法適合於分離特定物質。重組蛋白A瓊脂糖凝膠FF能有效純化血清IgG。處理常見問題時，如雜帶多、鎳柱使用問題、蛋白渾濁、無法純化等，通過調整超聲功率、改變結合緩沖液、增加去垢劑使用、調整洗脫條件等方法，可有效解決問題。
- **標簽選擇**：His標簽、GST標簽、MBP標簽、NusA標簽、Strep標簽等各有優缺點，根據蛋白特性選擇合適的標簽。
- **純化技巧**：利用蛋白酶抑制劑保護蛋白活性，調整雜蛋白與鎳柱結合起始咪唑濃度，使用去垢劑消除雜蛋白，通過超聲前加入去垢劑等方式提高純化效率。
- **問題**：蛋白純化過程中常見問題，如雜帶多、鎳柱使用問題、蛋白渾濁、無法純化等。
- **解決方法**：通過改變超聲功率、檢測pH及樣品組成、使用特定金屬離子、調整洗脫條件等方法，逐一解決。
通過上述步驟與方法，有效實現蛋白的提取與純化，為後續的研究提供高純度、活性的蛋白樣本。
⑸ His標簽蛋白純化那些事兒，你知道嗎
His標簽蛋白純化是一門技術活，需要細致的步驟和方法。是否熟悉His標簽純化的基本知識，決定著蛋白純化的效果。以下是一些常見的His標簽純化問題和解決策略，希望能幫助你提升純化效率。
在進行His標簽純化時，推薦的緩沖液條件是：Binding buffer為20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 20–40 mM imidazole, pH 7.4；而Elution buffer則為20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 500 mM imidazole, pH 7.4。His標簽在中性或鹼性條件下與Ni2+結合力更強，所以推薦使用磷酸緩沖液。
鎳柱的蛋白結合載量為至少40mg (His) 6重組蛋白，可以根據填料的結合載量選擇預裝柱和填料的規格。如果目標蛋白中的咪唑需要去除，可以選擇適合的上機脫鹽柱或手動脫鹽柱。
HisTrap柱子應儲存在20%乙醇中，於4℃-30℃條件下，以確保其長期穩定。使用柱子後，正常用緩沖液沖洗即可再次使用。如果柱子出現堵塞、變色等問題，需進行脫鎳和掛鎳操作，推薦使用20 mM sodium phosphate， 0.5 M NaCl， 50 mM EDTA， pH 7.4的stripping buffer清洗柱子，然後用binding buffer和蒸餾水清洗。
如果裂解液粘性過高，可以使用連續超聲或加入5 μg/ml的DNase I、1 mM的Mg離子在冰上孵育來降低粘性。如果目的蛋白不掛柱，可能是His標簽沒有充分暴露或丟失，可通過加入尿素或鹽酸胍等變性劑檢查，或者調整His標簽的位置。緩沖液條件不合適、洗脫時間過短、樣品量過大等情況也可能導致此問題。在純化過程中，若蛋白掛柱後洗脫不下來，可能是洗脫條件太溫和或蛋白在柱子中沉澱，此時可調整咪唑濃度或pH值，使用添加劑或改變NaCl濃度，或嘗試在變性條件下洗脫。對於洗脫不純的蛋白，需要檢查是否被蛋白酶降解，是否存在高度親和鎳離子的污染物，或有相互作用的污染物，這時可以通過增加添加劑濃度或使用離子交換層析、分子篩進一步純化。
優化金屬離子和宿主蛋白中His標簽的結合能力，可以提高蛋白純度。若遇到純度問題，嘗試更換成結合能力較弱的Co2+，以減少宿主蛋白的雜質。
以上是一些His標簽純化過程中的常見問題及解決策略，希望能幫助你提升蛋白純化的成功率。如果你有任何疑問或需要進一步的幫助，歡迎咨詢優寧維代理的Ni Sepharose FF 填料。
⑹ 純化後的蛋白在含有高濃度nacl的情況下濃縮容易沉澱嗎
理由相信，濃度越高，對保存蛋白質越有利。加入 PEG 和更換 緩沖液種類是一種值得試驗的方法，但結果如何還在兩可之間，沒試過就不會知道。
鎳柱下來以後，溶液中混有相當多咪唑和議定含量的Ni，都有可能引起蛋白質不穩定變性沉澱。
我在純化一種蛋白質時，也遇到過相同的情況，雖然蛋白質不同，但是也許能有幫助。
鎳柱後，用含 EDTA 的緩沖液透析，除去 Ni ，再過 DEAE 離子交換柱，之後透析再濃縮，分裝小管，-80度保存。一次使用一支。
理論上說蛋白質應在高濃度情況下保存，但當緩沖溶液中含有大量鹽而且目的蛋白中含有大量輸水氨基酸的情況下，高濃度就不利於保存。
在這種情況下，如果你不想太多的稀釋蛋白，可以選擇適當脫鹽，如透析、凝膠過濾、超濾等，但應保持緩沖液具有一定的離子強度（500mM NaCl這個濃度太高，可以降到100），如果還不行的話，可以添加甘油至終濃度5%左右。
Ni純化最好不要用Tris，可能會影響Ni的結合。