㈠ pcr用超純水
最好還是在冰上做啦,一次兩次沒有問題,久了多了可能問題就出來了
一般用的是滅菌的雙蒸水
保證引物的終濃度就可以.都是用水稀釋的,沒啥差別
㈡ 我想問做PCR擴增應該注意的事項
注意] 1、整個操作要帶口罩及一次性手套，並盡可能在低溫下操作。
另外，提取上清這步一定要小則殲心，靠近沉澱的部分一定要捨得不要，要不然會有蛋白質污染，影響比值
2、加氯仿前的勻漿液可在-70℃保存一個月以上，RNA沉澱在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。
總mRNA的提取(自己的經驗)
一、 關於Trizol Reagent需要的試劑
1． Chloroform：氯仿 (分析純)
2． Isoproplyl alcohol：異丙醇(分析純)
3． 75% Ethanol（in DEPC-treated water）:75%乙醇。要求用分析純無水乙醇並用0.01%的DEPC處理過的無Rnase的水稀釋。
4． RNase-free water：無Rnase的水。方法是：將DEPC按0.01%（V/V）加在d H2O中500ml（50ul），在37℃過夜，並高壓滅菌即得（150℃ 3小時）
5． 一次性塑料手套
6． 注意：DEPC有致癌之嫌
二、 關於Trizol Reagent的使用過程：
1． Homogenization（勻漿）
a. Tissues：組織
每100mg組織勻漿加1mlTrizol試劑，樣品體積不能超過Trizol試劑的10%。
b. Cells Grown in monolayer（單層細胞接毒後出現病變的）
針對JEV細胞總RNA的抽提法：
BHK21細胞長成單層後，接毒0.5-1ml（採用大瓶），37℃吸附1h，倒掉，加維持液（含2%的血清和HEPE8的MEM）約5ml，維持天。出 現75%-100%的病變時，以PBS（預冷）沖洗細胞兩次，直接在細胞瓶中加入Trizol試劑1ml/10cm2，吹吸幾次，以裂解細胞（細胞瓶有兩 種常用規格：大的約45cm2，小的約30cm2，故所用Trizol試劑分別約為4.5ml和3ml。Trizol試劑的加入是依細胞瓶而定，以蓋滿瓶 底為度，而不是依據細胞的數量，否則可導致DNA的污染）具體方法如下：（樣品一定要新鮮）
（1） 組織接入預冷的EP管中，加入Trizol試劑1ml/10cm2（量一定要加足，否則易污染），混勻，吹吸幾次，以破裂細胞，置室溫5min，以使核蛋白復合物徹底分離。
（2） 加氯仿0.2ml（每1ml Trizol試劑加入氯仿0.2ml），蓋好，劇烈震盪15s，置室溫2-3分鍾。
（3） 4℃離心，10000g×15min，離心後，混合物將分離為底層為淺紅的、中層為酚-氯仿相、上層為無色的水相。RNA包含在水相中，水相的體積約相當於所加的Trizol試劑量的60%。
（4） 仔細吸取上層水相，移至另一EP管中。
（5） 加0.5ml異丙醇，以沉澱RNA（每1ml Trizol試劑加入0.5ml異丙醇）高盯輪，置室溫10min。
（6） 4℃離心，10000g×10min。RNA沉澱為一層如凝膠樣透明的小塊附在管底和管壁。
（7） 棄上清液，加入預冷的75%乙醇1ml（每1ml Trizol試劑加入75%乙醇至少1ml），震盪，充分洗滌沉澱，4℃離心，5500g×5min。棄上清液，空氣乾燥（或真空乾燥）後，沉澱重懸於無 Rnase dH2O中，吹吸幾次，55℃-60℃作用10分鍾以溶解RNA，-70℃保存備用。
（8） 抽提出的細胞總RNA乾燥後加水50ul，取10ul加無Rnase水990ul，稀釋100倍成1ml。於0.5cm厚的石英比色杯中，以無Rnase水為對照，在721型紫外分光光度計下檢測，結果應為：A260/280 ratio<1.6。
（9） 分離組織10mg（純組織）加800ul Trizol試劑。
（10） 擴增產物的鑒定
DEPC處理方法如下：
1. DEPC處理
（1）DEPC水：100ml超純水加入0.2ml DEPC，充分混勻，高壓滅菌。
（2）Tip頭(槍頭）、EP管等在提RNA過程中及做RT時接觸RNA的器材（包括1ml、200μl、20μl Tip頭；EP管和PCR反應管等）：用0.1%的DEPC水（1000 ml超純水加入1ml DEPC）37℃浸泡過夜，高壓滅菌。
2. 提取RNA，用DEPC水溶解
3. RT
我是用PCR儀來控制溫度和時間的，所以RT是在PCR反戚信應管中作的。
4. 操作過程中要戴一次性手套，並經常換手套。
最好把要直接接觸樣品的東西都用DEPC水處理一下，槍頭盒插好槍頭後，加入1-2ml的0.1%DEPC水，在滅菌就行了；現在有進口的RNASE FREE的槍頭買，直接用不用處理的.
如何消除污染
機器運行完後，取出PCR產物時不能隨便丟棄，應該用塑料手套或其他打結包好後丟入垃圾桶。
（1） 試劑：mixer盡量分裝，不要原瓶多次取用。
（2）加樣：原則是DNA最後加，其他試劑按照體積大小從大往小的加。如果是同種引物和探針有多管的話只是DNA不同，那麼採取的方法是算出總體積後加在一個管子裡面，混合均勻之後再分裝到各個管子里去，這樣可以有效地避免誤差及污染。
另外，普通實驗室容易污染，且污染程度很高，與跑電泳還有質粒制備提取都在同一個房間里有比較大的關系，最容易造成高濃度污染的就是產物的開蓋和質粒的稀釋。
目 前，國內外各個公司提供的診斷試劑盒大多採用了UNG來防污染。Uracil-DNA N-glycosylase（UNG）尿嘧啶DNA糖基酶，來源於大腸桿菌重組克隆表達。
RNA定量
RNA也最好至少要用電泳，一方面定量，另一方面可以看看完整性。至於用分光光度計比較 不同標本之間就更不準了。
RNA的貯藏，最主要的是溫度，－20不夠，最好－80，液氮最保險
mRNA是不能代替蛋白水平的分析的，因為還有翻譯效率和RNA降解速度 的影響
RT-PCR有兩種做法：
條件具備的話可用kit進行一步法進行；若條件不太好的話可分兩步進行逆轉錄再PCR。但後來發現兩步法的結果更加理想，條帶特異性強且無拖尾現象，我推測是體系更加單一比較利於PCR的進行
一定要做內參的，每一次，我想。不作內參的結果是不可信的
電泳可以不一起跑，沒有關系，計算的是相對表達程度，半定量和定量RT-PCR做的都是基因相對表達 量，不是絕對表達量
mRNA的分離與純化中
步驟（4）中將RNA溶液置65℃中溫育然後冷卻至室溫再上樣的目的有兩個，一個是破壞RNA的二級結構，尤其是mRNA Poly(A+)尾處的二級結構，使Poly(A+)尾充分暴露，從而提高Poly(A+)RNA的回收率；另一個目的是能解離mRNA與rRNA的結 合，否則會導致rRNA的污染。所以此步驟不能省略。
下面，我們介紹一個可以確認RNA溶液中有沒有殘留的RNA酶的方法。
3）保溫試驗
方法很簡單的，按照樣品濃度，從RNA溶液中吸取兩份1000 ng的RNA加入至0.5 ml的離心管中,並且用pH7.0的Tris緩沖液補充到10 ul的總體積，然後密閉管蓋。把其中一份放入70℃的恆溫水浴中,保溫1 h。另一份放置在-20℃冰箱中保存1 h。
時間到了之後，取出兩份樣本進行電泳。電泳完成後，比較兩者的電泳條帶。如果兩者的條帶一致或者無明顯差別（當然，它們的條帶也要符合方法2中的條件）， 則說明RNA溶液中沒有殘留的RNA酶污染，RNA的質量很好。相反的，如果70℃保溫的樣本有明顯的降解，則說明RNA溶液中有RNA酶污染。
PCR污染與對策
)PCR擴增產物污染.這是PCR反應中最主要最常見的污染問題，所以，擴增區的儀器什麼如槍頭等要注意。
還有一種容易忽視，最可能造成PCR產物污染的形式是氣溶膠污染；在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠，在操作時比較劇烈地搖動反應管，開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染.據計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝，因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題.
1標本處理區，包括擴增摸板的制備；
2. PCR擴增區，包括反應液的配製和PCR擴增；
3. 產物分析區，凝膠電泳分析，產物拍照及重組克隆的制備。
各工作區要有一定的隔離，操作器材專用，要有一定的方向性。如：標本制備→PCR擴增→產物分析→產物處理。
切記：產物分析區的產物及器材不要拿到其他兩個工作區。
使用一次性吸頭，嚴禁與PCR產物分析室的吸頭混用，吸頭不要長時間暴露於空氣中，避免氣溶膠的污染；
操作多份樣品時，制備反應混合液，先將dNTP、緩沖液、引物和酶混合好，然後分裝，這樣即可以減少操作，避免污染，又可以增加反應的精確度
反應液污染
可採用下列方法之一處理：
1. DNase I法：PCR混合液（未加模板和Taq聚合酶）加入0.5U DNase I，室溫反應30 min後加熱滅活，然後加入模板和Taq聚合酶進行正常PCR擴增。該方法的優點是不需要知道污染DNA的序列；
（三）尿嘧啶糖苷酶（UNG）法
由於UV照射的去污染作用對500bp以下的片段效果不好，而臨床用於檢測的PCR擴增片段通常為300bp左右，因此UNG的預防作用日益受到重視和肯定。
1、提取mRNA時所用的EP管、玻璃等器皿全部都要用0.1%DEPC水浸泡。然後烘乾，高壓滅菌，再烘乾。
2、用DEPC水洗過後當然不能用雙蒸水洗了。那你用DEPC處理還有什麼意義呢？還要用雙蒸水洗嗎？
3、玻璃器皿干烤：180度，8小時或更長時間；小器皿也可以用少許氯仿處理一下。另外，鐵製品、研砵等也可倒上酒精直接燒。
㈢ 做配葯品，稀釋引物，PCR實驗中，對水的要求要很高么
配製一般化學試劑使用二級水即可。
配製生化試劑，包括引物稀釋、PCR所用水，以及轉膜、核酸抽提等，必須使用二次蒸餾水或一級水。
㈣ PCR實驗室超純水機怎麼選
PCR實驗室超純水機怎麼選，下面結合本人的實際工作經驗來談談如何選擇一款適合您PCR實驗室超純水機。
1、智能PLC加真彩觸摸屏控制系統，實時遠程在線監測並顯示設備運行的各種狀態信息
2、四級加強型預處理設計，改善反滲透進水水質
3、具有濃水智能回用工藝設計，水利用率高達75%
4、R0系統自動脈沖沖洗程序設計，有效降低膜結垢風險
5、純化系統自動循環潤洗功能，避免微生物滋生
6、一機多用，可同時提供滿足實驗室標準的I/II/III級用水 網路上面都有。
㈤ 一般實驗室用什麼樣的超純水機比較好
實驗室超純水設備原理：
通常由原水預處理系統、反滲透純化系統、超純化後回處理系統三部分組答成。預處理的目的主要是使原水達到反滲透膜分離組件的進水要求，保證反滲透純化系統的穩定運行。反滲透膜系統是一次性去除原水中98%以上離子、有機物及100%微生物(理論上)最經濟高效的純化方法。超純化後處理系統通過多種集成技術進一步去除反滲透純水中尚存的微量離子、有機物等雜質，以滿足不同用途的最終水質指標要求。
實驗室超純水設備標准配置：
1.一體式PPF精密濾芯：過濾泥沙、顆粒物;
2.一體式活性炭濾芯：吸附有機物、余氯 ;
3.反滲透膜裝置：第一步脫鹽和去除自來水中的細菌和有機物;
4.壓力純水桶：存放反滲透純水，同時提供取水動力;
5.離子交換柱：第二步脫鹽，電阻達10兆歐以上;
6.核級超純化柱：第三步深度脫鹽，電阻達18.2兆歐以上;
7.終端1微米微孔過濾：過濾細小顆粒物質;
8.超純水專用0.45+0.2微米孔徑終端過濾器(選配)：去除細菌及雜質;
9.電子元器件等：提供各種控制功能。