半微量定氮蒸馏时间

1. 请问半微量凯式定氮法的详细步骤，谢谢！！顺便问下全量半微量和微量的区别是什么呢

(一) 方法原理

样品与硫酸一同加热消化, 分解有机质, 释放出的NH3 与硫酸结合成硫酸铵留在溶液中。在定氮消化瓶中,用氢氧化钠中和硫酸铵生成氢氧化铵,加热又分解NH3 ,用硼酸吸收, 用标定过的盐酸或硫酸滴定, 从而计算出总氮量, 换算为蛋白质量。
(二) 仪器、设备

1. 仪器
分析天平: 感量0.0001克；实验用粉碎机；半微量凯氏蒸馏装置；半微量滴定管, 容积10毫升；硬质凯氏烧瓶: 容积25毫升, 50毫升；锥形瓶: 容积150毫升；电炉: 600瓦。

2. 试剂
(1) 盐酸: 分析纯, 0.02mol/L, 0.05mol/L标准溶液(邻苯二甲酸氢钾法标定)；
(2) 氢氧化钠: 工业用或化学纯, 40%溶液(W/V)；
(3) 硼酸: 分析纯, 2%溶液(W/V)；
(4) 硼酸混合指示剂: 溴甲酚绿0.1克, 甲基红0.1克分别溶于95%乙醇中,混合后稀至100毫升, 将混合指示剂与2%硼酸溶液按 1:100比例混合, 用稀酸或稀碱调节PH值为4.5, 使呈灰紫色, 此溶液放置时间不宜过长, 需在1个月之内使用；
(5) 加速剂: 五水合硫酸铜(分析纯)10克, 硫酸钾(分析纯)100克在研钵中研磨, 仔细混匀, 过40目筛；
(6) 浓硫酸: 比重1.84, 无氮；双氧水: 分析纯,30%；蔗糖: 分析纯；
(7) 双氧水硫酸混合液(简称混液): 双氧水、硫酸、水的比例为3:2:1, 即在100毫升蒸馏水中,慢慢加入200毫升浓硫酸, 待冷却后, 将其加入300毫升30%双氧水, 混匀, 此混液可一次配制500～1000毫升贮藏于试剂瓶中备用, 夏天最好放入冰箱或阴凉处贮藏, 室温(20℃)上下时不必冷藏, 贮藏进间不超过1个月 。

(三) 操作步骤

1. 样品的选取和制备 选取有代表性的种子(带壳种子需脱壳)挑拣干净, 按四分法缩减取样, 取样量不得少于20克。将种子放于60～65℃烘箱中干燥8小时以上, 用粉碎机磨碎, 95%通过40目筛, 装入磨口瓶备用。
2. 称样 称取0.1克试样两份(含氮1～7毫克), 精确至0.0001克, 同时测定试样的水分含量。
3. 消煮1 将试样置开25毫升凯氏瓶中, 加入加速剂粉末。除水稻为1克外, 其它均为2克。然后加3毫升硫酸, 轻轻摇动凯氏瓶, 使试样被硫酸湿润, 将凯氏瓶倾斜置于电炉上加热, 开始小火, 待泡沫停止后加大火力, 保持凯氏瓶中的液体连续沸腾, 沸酸在瓶颈中部冷凝回流。待溶液消煮到无微小的碳粒并呈透明的蓝绿色时, 谷类继续消煮30分钟,豆类继续消煮60分钟。
4. 消煮2 将试样置于50毫升凯氏瓶中, 加入0.5克加速剂和3毫升混液,在凯氏瓶上放一曲颈小漏斗, 倾斜在电炉上加热, 开始小火(用调压器将电压控制在175伏左右), 保持凯氏瓶中液体呈微沸状态。5分钟后加大火力(将电压控制在200伏左右)。保持凯氏瓶中液体连续沸腾, 消煮总时间, 水稻、高粱为30分钟, 其它均为45分钟。
注: 消煮中列入两种消煮条件, 经与国际谷物化学协会标准法(ICC)比较, t值测验均不显著, 准确度与精密度也基本一致,在具体工作中可根据实际情况取其一种。
5. 蒸馏 消煮液稍冷却后加少量蒸馏水, 轻轻摇匀。移入半微量蒸馏装置的反应室中,用适量蒸馏水冲洗凯氏瓶4～5次。蒸馏时将冷凝管末端插到盛有10毫升硼酸指示剂混合液的锥形瓶中, 向反应室中加入40%氢氧化钠溶液15毫升(如采用消煮2的条件, 加10毫升即可)。然后通气蒸馏, 当馏出液体积约达50毫升时,降下锥形瓶。使冷凝管末端离开液面, 继续蒸馏1～2分钟, 用蒸馏水冲洗冷凝管末端,洗液均需流入锥形瓶中。
6. 滴定 谷类以0.02mol/L, 豆类以0.05mol/L标准盐酸或硫酸滴定至锥形瓶中的溶液由蓝绿色变成灰紫色为终点。空白用0.1克蔗糖代替样品作空白测定。消耗标准酸溶液的体积不得超过0.3毫升。

(四) 结果计算

式中:
V2 滴定试样时消耗标准酸的体积(毫升)
V1 滴定空白时消耗标准酸的体积(毫升)
N标准酸溶液的浓度(mol/L)
K 氮换算成粗蛋白质的系数
W 试样重量(克)
X 试样水分含量
0.0140每毫摩尔氮的克数
平行测定的结果用算术平均值表示,保留小数后二位。
两份试样粗蛋白质的平行测定结果为15%以下时, 其相对相差不得大于3%；15%～30%进为2%；30%以上为1%。

凯氏定氮法中的常量，微量，和半微量区别：
区别在于检测用样品量，你可以按标准进行操作，没有必要拘泥于某一方法
主要看你样品量是否足够
1、常量由于可以把全部消化液一同蒸馏测定，故较适合蛋白质含量低的样品。
2、微量、半微量差别在装置上，二者皆属于水蒸汽蒸馏操作，只是前者把蒸汽直接导入反应室内，后者把蒸汽导入反应室外加热，由于二者皆取消化液的一部份操作，可平行蒸馏操作，但检测限要较常量法高。
3、纯粹从回收率的角度看，半微量要稍好。

2. 化验饲料中真蛋白含量使用的氢氧化钠溶液的配制与标定

一、原理 蛋白质在一定碱性条件下能与重金属盐类发生盐析作用而析出沉淀．此沉淀物不溶于热水。而非蛋白氮类物质易溶于水。用热水洗涤沉淀．将水溶性含氮物质洗去，剩下的沉淀物质再用凯氏定氮法测定即可得出饲料真蛋白质的含量。 二、测定所需的材料 1．仪器和设备 实验室用台式粉碎机、分样筛(20目)、分析天平(感量0．1mg)、烧杯(250m1)、玻璃棒、玻璃漏斗、中速定量滤纸(直径15cm)、表面皿(直径10cm)、干燥箱(可控温度65～70℃)、凯氏烧瓶(100m1)、烧煮炉或电炉、半微量定氮蒸馏器、容量瓶(100m1)、锥形瓶(250m1)、酸式滴定管(50m1)。 2．试剂与试液 硫酸AR、10％ 硫酸铜水溶液、硫酸钾或无水硫酸钠AR、氢氧化钠AR、40％ 氢氧化钠水溶液、2．5％氢氧化钠水溶液、2％ 硼酸水溶液、0．05％mo]／]盐酸标准溶液、氯化钡试液、5％氯化钡水溶液、0．1％ 甲基红乙醇溶液、0．5％ 溴甲酚绿乙醇溶液。 三、样品的选取与制备 取有代表性的样品约lkg。用四分法分为两份。一份装瓶加封作为留用样品。另一份粉碎过20目。装于广口瓶中贴标签待测。 四、测定步骤 1．试样的前处理 准确称取试样1～2g(精确到0．1mg)于250ml烧杯中，加蒸馏水50ml煮沸．依次加入10％硫酸铜水溶液20ml和25％氢氧化钠溶液20rnl，边加边搅拌，加完后继续搅拌几分钟。放置2小时或静置过夜，沉淀物以中速定量滤纸过滤。用70℃以上热水18ml反复洗涤沉淀．直至滤液无沉淀为止(取氯化钡试液滴于表面皿中。加2mol／l盐酸溶液1滴．滴人滤液．在黑色背景下观察应无白色沉淀)。然后，将滤纸和沉淀物包好，放人烘箱中在65～70℃下干燥2小时。 2．试样的消化 将烘干的试样连同滤纸一起放人凯氏烧瓶中．依次加入硫酸钾或无水硫酸钠9 硫酸铜1 浓硫酸25ml，摇匀，尔后置于电炉上先低温(100～200~C)加热，注意防止泡沫浮起，待泡沫消失后再提高加热温度(约410~C)至沸腾，消化至溶液澄清无黑点并呈蓝绿色，再继续加热30分钟，然后将凯氏烧瓶移出电炉放冷。 3．定容 将冷却后的消化液加蒸馏水约10～20ml，’摇匀后转入100ml容量瓶中，再加10～20ml蒸馏水洗涤凯氏烧瓶。溶液并入容量瓶中，如此反复洗涤，直至消化液全部转入容量瓶中。待冷却至室温后，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀。即为试样分解液。 4．蒸馏 采用半微量凯氏定氮蒸馏法。先将水蒸汽发生器与半微量凯氏定氮蒸馏器连接好。在水蒸汽发生器的水中加入甲基红指示剂3滴与硫酸数滴，使水溶液保持橙红色，否则应补加少许硫酸。取20ml2％硼酸水溶液于250ml锥形瓶中，加0．1％甲基红乙醇溶液5～6滴，0．5％溴甲酚绿乙醇溶液2～3滴，摇匀。然后将锥形瓶置于半微量凯氏定氮蒸馏器的末端．使冷凝管末端浸入此吸收液面下2／3处。准确移取试样分解液10～15ml注入半微量定氮蒸馏器中，用少量蒸馏水冲洗进样口，尔后缓慢加入40％氢氧化钠水溶液20ml。用少量蒸馏水冲洗进样口，用玻璃塞塞好进样口。再加适量蒸馏水封住进样口以防止漏气。蒸馏3～5分钟以后待冷凝管末端管口之馏出液呈中性(红色石蕊试纸不变色)时将冷凝管末端离开吸收液面并冲洗冷凝管末端管口，洗液并入吸收液。再蒸馏1～2分钟后用蒸馏水冲洗冷凝管末端管口，洗液并入吸收液。然后将锥形瓶移出，准备滴定。此时应夹断气源。排出废液，准备下一个样品的测定。 5．滴定 吸收氨后的吸收液立即用0．05tool／1的盐酸标准溶液滴定使溶液颜色由蓝绿色变为灰红色即为滴定终点。同时记录盐酸标准溶液的耗用量。 6．空白 在进行样品测定的同时进行空白测定。空白测定除不加试样外其他操作步骤与试样相同。空白试验消耗的盐酸标准溶液的体积不得超过0．5ml。 7．结果计算 五、注意事项 1．在试样的前处理过程中，“煮沸”要求是加热至沸并保持30分钟，目的是使试样中的非蛋白氮类物质充分溶解于水中。加10％硫酸铜溶液和25％氢氧化钠溶液时最好采用移液管移取，然后沿着烧杯内壁缓慢滴加，一方面防止局部氢氧化钠太浓将溶解部分蛋白质，这样会导致最终结果偏低；另一方面是为了使试样中的真蛋白质充分盐析：放置2小时或静置过夜也是这个道理。沉淀物宜以双层中速定量滤纸过滤，双层滤纸可以加快过滤速度，同时又不致于将沉淀物过滤掉。滤液无SO+2表明了已充分洗涤沉淀物，因为如果滤液中仍有SO+2 。则表明沉淀物中间仍可能夹杂有部分可溶性非蛋白氮类物质(如NH )，若不继续洗涤则将导致最终结果偏高。将滤纸和残渣(沉淀物)包好放入烘箱中于65～70cc下干燥2小时是为了使沉淀物充分干燥。一方面是为了避免沉淀物中仍夹杂有一些氨类物质(尽管这种情况一般不会发生。因为滤液已经过了氯化钡试液的检验，但仍不能排除因人眼观察的局限性使其中间仍夹杂有部分热烘干的过程中挥发掉)；另一方面也是为了下一步试样消化的顺利进行。因为如果试样潮湿，炭化升温过快，气体骤然膨胀不易从凯氏烧瓶中散发出去，很容易使试样与气体一同冲出凯氏烧瓶从而导致消化失败。 2．消化时应经常转动凯氏烧瓶以便使消化进行得迅速而完全。在炭化时如有黑色碳粒溅在瓶壁上应将凯氏烧瓶移出。待冷却后加少量蒸馏水冲洗之。尔后再继续消化 3．对胶体物质或脂肪含量较高的样品。消化时应防止泡沫溢出瓶口．如发现有泡沫溢至瓶颈时应立即移开火源，并加1～2滴蒸馏水再继续消化。 4．蒸馏过程中要注意气体通路。即管夹要有一个打开，以免烫伤。在加试样分解液或碱液于反应室时要快。应先检查气源是否夹断。废液流出口是否畅通。开始蒸馏时应先通蒸汽后夹断废液排出口。否则所加液回流排出。 核心提示：饲料特别是植物性饲料中含量较多的非蛋白氮化合物如氨化物不能或不能完全被单胃动物(如猪、禽等)利用，只有真蛋白质才能被单胃动物消化、吸收与利用。因此饲料真蛋白质含量比饲料粗蛋白含量更能反映出饲料的营养价值。

3. 亚甲基蓝光度法

方法提要

沉积物试样中的硫化物同盐酸反应，生成的硫化氢随水蒸气进入乙酸锌溶液中被吸收，生成硫化锌。吸收液中的硫离子在酸性条件和三价铁离子存在下，与对氨基二甲基苯胺二盐酸盐反应生成亚甲基蓝，在波长650nm处测定其吸光度。

方法适用海洋、河流沉积物中硫化物的测定。检出限w(S)为0.3×10^-6。

仪器

硫化氢发生-吸收装置(图76.1)。

半微量定氮蒸馏器(图76.2)，冷凝器下端附有可以取下的连接管。

分光光度计。

图76.1 硫化氢发生-吸收装置

图76.2 半微量定氮蒸馏器(凯氏)

试剂

乙酸锌溶液(100g/L)称取50g乙酸锌［Zn(Ac)₂·2H₂O］加水溶解并稀释至500mL，摇匀。

碘酸钾标准溶液c(1/6KIO₃)=0.0100mol/L称取0.3567g预先在120℃烘干2h并在干燥器中冷却的碘酸钾(KIO₃)，加水溶解后移入1000mL容量瓶中，稀释至刻度，摇匀，用前配制。

碘溶液c(1/2I₂)=0.0100mol/L称取10g碘化钾(KI)溶于50mL水中，加入1.27g碘片(I₂)，溶解后，移入1000mL容量瓶中，用水稀释至刻度，摇匀。

无水碳酸钠。

乙酸。

淀粉溶液(5g/L)称取1g可溶性淀粉(化学纯)，用少量水调成糊状，加入100mL沸水，搅匀。继续煮至透明。冷却后，加入1mL乙酸，稀释至200mL，盛于试剂瓶中。

硫代硫酸钠标准溶液c(Na₂S₂O₃)≈0.01mol/L称取25g硫代硫酸钠(Na₂S₂O₃·5H₂O)，用新煮沸并冷却的水溶解，加入2gNa₂CO₃，溶解后转入棕色试剂瓶中，加水至10L，混匀。置于阴凉处，8～10天后标定其浓度。

标定移取15.00mL碘酸钾标准溶液［c(1/6KIO₃)=0.0100mol/L］，沿壁注入100mL碘量瓶中，用少许水淋洗瓶壁，加入0.5gKI，用刻度移准管沿瓶壁注放1mL(1+3)H₂SO₄，塞好瓶塞，轻摇混匀，用少许水封口，在暗处放置2min，半开瓶塞，沿瓶壁加50mL水，在不断摇动下，用硫代硫酸钠标准溶液滴定至溶液呈浅黄色，加入1mL淀粉溶液，继续滴定至蓝色刚刚消失为止。计算硫代酸钠溶液的浓度(mol/L)。

硫化物标准储备溶液的制备及标定使用硫化氢发生装置(见图76.1)，向200mL10g/LNa₂S溶液中缓缓地滴加5.0mL(1+2)HCl，产生的硫化氢气体被氮气带出，用500mL乙酸锌溶液［Zn(Ac)₂·2H₂O，1g/L］吸收生成的硫化锌。将吸收液用中速定量滤纸过滤，混匀。此过程应在通风柜中进行。

标定移取20.00mL硫标准储备溶液于250mL碘量瓶中，依次加40mL水、20.00mL碘溶液、10mL(1+9)HCl，混匀。于暗处放置5min，用硫代硫酸钠标准溶液滴定至溶液呈浅黄色。加入1mL淀粉溶液，继续滴定至蓝色刚刚消失。

同时移取20.0mL水，按上法进行空白滴定。

按下式计算硫化物标准储备溶液的浓度:

岩石矿物分析第四分册资源与环境调查分析技术

式中:ρ_(S2-)为硫的质量浓度，μg/mL;V₂为滴定空白溶液消耗的硫代硫酸钠标准溶液的体积，mL;V₁为滴定硫化物标准溶液消耗的硫代硫酸钠标准溶液的体积，mL;c为硫代硫酸钠标准溶液的浓度，mol/L;V为硫化物标准储备溶液的体积，mL。

硫化物标准溶液ρ(S^2-)=10.0μg/mL移取一定体积的硫化物标准储备溶液，按下式计算，将其质量浓度调整为10.0μg/mL。

岩石矿物分析第四分册资源与环境调查分析技术

式中:V₄为应量取的硫化物标准储备溶液的体积，mL;V₃为欲配制的硫化物标准使用溶液的体积，mL;ρ₃为硫化物标准溶液的浓度，μg/mL;ρ₄为硫化物标准储备溶液的浓度，μg/mL。

硫酸铁铵溶液(125g/L)称取25g硫酸铁铵［Fe(NH₄)(SO₄)₂·12H₂O］于250mL烧杯中，加100mL水，5mLH₂SO₄，稍加热使溶解，加水至200mL，混匀。如浑浊则应过滤。

对氨基二甲基苯胺二盐酸盐溶液(1g/L)称取1g对氨基二甲基苯胺二盐酸［NH₂C₆H₄N(CH₃)₂·2HCl，化学纯］溶于700mL水中，在不断搅拌下，缓缓地加入200mLH₂SO₄，冷却后用水稀释至1000mL，混匀，贮存于棕色试剂瓶中，置于冰箱中保存。

校准曲线

移取0.00mL、0.50mL、1.00mL、1.50mL、2.00mL、2.50mL、3.00mL硫化物标准溶液(10.0μg/mL)，置于50mL容量瓶中，加10mL乙酸锌溶液，混匀。加入5mL对氨基二甲基苯胺二盐酸盐溶液、1mL硫酸铁铵溶液，水稀释至刻度，充分混匀。校准系列的浓度(以S^2-计)分别为0.00μg/mL、0.05μg/mL、0.10μg/mL、0.15μg/mL、0.20μg/mL、0.25μg/mL、0.30μg/mL。静置10min，将溶液移入1cm比色皿中，用水作参比，于波长650nm处测量吸光度。绘制校准曲线。

分析步骤

称取3g(精确至0.01g)混匀的湿试样，置于50mL烧杯中，加5mL水、2～3mL乙酸锌溶液，用少许水全量转入定氮装置中。

移取10mL乙酸锌溶液于100mL刻度试管中，将冷凝器下端的玻璃连接管插入刻度试管至接近其底部，通水蒸气蒸馏(见图76.2)。打开冷凝器的冷却水，当定氮装置中的试样被蒸气充分搅动并加热近沸时，迅速加入15mL(1+2)HCl，并立即盖紧盖子，继续通水蒸气。当刻度试管中的吸收液达到50～60mL时，将连接管和刻度试管一并取下，停止通水蒸气，用少量水冲洗连接管，冲洗液并入吸收管中。加入5mL对氨基二甲基苯胺二盐酸盐溶液、1mL硫酸铁铵溶液，用水稀释至刻度，混匀。静置10min，以下测定步骤同校准曲线。

按下式计算硫的含量:

岩石矿物分析第四分册资源与环境调查分析技术

式中:w(S^2-)为试样中硫化物硫的质量分数，10^-6;ρ(S^2-)为从校准曲线上查得的硫的浓度，μg/mL;V为吸收液定容的体积，mL;m为称取试样的质量，g;w(H₂O^-)为湿水样中吸附水的质量分数。

注意事项

硫化物标准溶液应在使用前临时配制。

氮气中如有微量氧，可安装洗气瓶(内装亚硫酸钠饱和溶液)予以除去。

4. 为什么半微量定氮法进行肉质的挥发性盐基氮实验，没有冷凝液体流出，装置不漏气啊，

挥发性盐基氮是样品水浸液在弱碱下与水蒸汽一起蒸馏出来的总氮量， 是富含蛋白质类物质腐败变质的产物， 它也是鉴定食物腐败变质程度的一个指标。发性盐基氮受发酵时间、温度等因素影响，按照国家标准食品卫生理化检验GB ／ T 5009.44-2003，对发酵食品可采用半微量定量法， 完成挥发性盐基氮指标的检测。半微量法具有科学性、合理性的玻璃仪器操作, 减少污染, 准确度高, 适合于所有的样品检测, 因此一直沿用至今。但存在消化时间太长( 不同材料通常1 到几小时) 及放出有毒有害气体, 必须在通风橱中进行的弊端。
而用全自动凯氏定氮法是测定食品中蛋白质含量，否能对样品中挥发性盐基氮等项目进行检测,有待对其功能做进一步探讨。

5. 请教挥发性盐基氮的检测问题

最好是用离心机过滤。。尽量减少过滤的时间。。。 VBN的检测反映的是鱼粉的腐败过程所产生的氨以及胺类等碱性含氮物质，因此，离心后的样液应马上检测。作者以粗蛋白含量为65%的进口秘鲁鱼粉为例，对比时间对VBN的影响（见表1）。 表1 时间对VBN的影响 时间 VBN（mg/100g） 2h 175 1h 158 0.5h 133 10min 112 5min 106 3min 105 以上表明，试液应在5min以内进行测定。

6. 凯式定氮法的操作步骤

1. 样品的选取和制备 选取有代表性的种子(带壳种子需脱壳)挑拣干净, 按四分法缩减取样,
取样量不得少于20克。将种子放于60～65℃烘箱中干燥8小时以上, 用粉碎机磨碎, 95%通过40目筛, 装入磨口瓶备用。
2. 称样
称取0.1克试样两份(含氮1～7毫克), 精确至0.0001克, 同时测定试样的水分含量。
3. 消煮1 将试样置开25毫升凯氏瓶中,
加入加速剂粉末。除水稻为1克外, 其它均为2克。然后加3毫升硫酸, 轻轻摇动凯氏瓶, 使试样被硫酸湿润, 将凯氏瓶倾斜置于电炉上加热, 开始小火,
待泡沫停止后加大火力, 保持凯氏瓶中的液体连续沸腾, 沸酸在瓶颈中部冷凝回流。待溶液消煮到无微小的碳粒并呈透明的蓝绿色时,
谷类继续消煮30分钟,豆类继续消煮60分钟。
4. 消煮2 将试样置于50毫升凯氏瓶中,
加入0.5克加速剂和3毫升混液,在凯氏瓶上放一曲颈小漏斗, 倾斜在电炉上加热, 开始小火(用调压器将电压控制在175伏左右),
保持凯氏瓶中液体呈微沸状态。5分钟后加大火力(将电压控制在200伏左右)。保持凯氏瓶中液体连续沸腾, 消煮总时间, 水稻、高粱为30分钟,
其它均为45分钟。
注: 消煮中列入两种消煮条件, 经与国际谷物化学协会标准法(ICC)比较, t值测验均不显著,
准确度与精密度也基本一致,在具体工作中可根据实际情况取其一种。
5. 蒸馏 消煮液稍冷却后加少量蒸馏水,
轻轻摇匀。移入半微量蒸馏装置的反应室中,用适量蒸馏水冲洗凯氏瓶4～5次。蒸馏时将冷凝管末端插到盛有10毫升硼酸指示剂混合液的锥形瓶中,
向反应室中加入40%氢氧化钠溶液15毫升(如采用消煮2的条件, 加10毫升即可)。然后通气蒸馏, 当馏出液体积约达50毫升时,降下锥形瓶。使冷凝管末端离开液面,
继续蒸馏1～2分钟, 用蒸馏水冲洗冷凝管末端,洗液均需流入锥形瓶中。
6. 滴定 谷类以0.02mol/L,
豆类以0.05mol/L标准盐酸或硫酸滴定至锥形瓶中的溶液由蓝绿色变成灰紫色为终点。空白用0.1克蔗糖代替样品作空白测定。消耗标准酸溶液的体积不得超过0.3毫升。

看完了采纳我哦~~

7. 有谁知道凯氏定氮的具体步骤，注意事项，！！

1、消化:精密称取大豆样品1.0g左右，放入干燥的250 ml消化管中，加入0.4g CuSO4 7g K2SO4 10ml H2SO4先200'C炭化，待泡沫停止后提高温度到450'C，加热至液体沸腾，待瓶内液体呈蓝绿色透明后，再继续加热0.5h。

冷却后加入20ml水，移入100ml容量瓶中，用少量水洗涤消化管2~3次，洗液合并于容量瓶中定容。

2、蒸馏:连接凯氏定氮装置，于水蒸气发生瓶内装水至2/3处，加甲基红指示剂数滴及数ml硫酸，保持水呈酸性。加入数粒玻璃珠以防暴沸，调节火力加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。

3、向吸收瓶内加入20g/L硼酸溶液20ml及混合指示剂2滴，并使冷凝管下端插入液面以下，吸取10ml样品消化稀释液由进样口进入反应室，并以10ml水洗涤进样口使其流入反应室内，将400g/L NaOH溶液10ml倒入进样口，立即夹紧螺旋夹，并加入少量蒸馏水，密封进样口。

当蒸汽通入反应室时，准确计时，反应产生的氨气通过冷凝管进入吸收瓶，蒸馏5min，移动吸收瓶，使冷凝管下端离开液面，再蒸馏Imin，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部，取下吸收瓶。

停止加热，使反应室内的液体进入汽水分离器，打开进样口的螺旋夹，将汽水分离器的液体放出。再向反应室内加入蒸馏水，夹紧螺旋夹，再次进行加热至水蒸汽放出，停止加热，使反应室内的水进入汽水分离器，进行洗涤。

4、滴定:用0.025mol/L硫酸标准溶液滴定吸收液至灰色。

5、计算:X= 2cVX 14X5.71/m

X为样品中蛋白质的含量，%；c为硫酸标准溶液的浓度，molL；V为样品消化液消耗硫酸标准溶液的体积，ml；m为样品的质量，g。

注意事项

(1) 样品应是均匀的。固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。

(2) 样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上。万-沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。

(3) 消化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30%过氧化氢(H2O2)2-3ml，促使氧化。

(4) 在整个消化过程中，不要用强火。保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。

(5)如硫酸缺少， 过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用。因此，当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量。

(6)加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。

(7)混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。

(8) 氨是否完全蒸馏出来，可用PH试纸试馏出液是否为碱性。

(7)半微量定氮蒸馏时间扩展阅读：

凯氏定氮法原理

凯氏定氮法首先将含氮有机物与浓硫酸共热，经一系列的分解、碳化和氧化还原反应等复杂过程，最后有机氮转变为无机氮硫酸铵，这一过程 称为有机物的消化。

为了加速和完全有机物质的分解，缩短消化时间，在消化时通常加入硫酸钾、硫酸铜、氧化汞、过氧化氢等试剂，加入硫酸钾可以提高消化液的沸点而加快有机物分解，除硫酸钾外，也可以加入硫酸钠、氯化钾等盐类类提高沸点，但效果不如硫酸钾。

硫酸铜起催化剂的作用。凯氏定氮法中可用的催化剂种类很多，除硫酸铜外，还有氧化汞、汞、硒粉、钼酸钠等，但考虑到效果、价格及环境污染等多种因素，应用最广泛的是硫酸铜。