蒸馏水煮沸法抗原修复

Ⅰ 求免疫组化冰冻切片荧光染色具体流程

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石蜡切片免疫组化染色步骤

石蜡切片免疫组化染色步骤
1、载玻片的处理： 抗原修复过程中，由于高温、高压、辐射等诸多因素的影响，极易造成脱片。为保证试验的正常进行，可选用我公司提供的ZLI-9001 APES、ZLI-9003 HistogripTM或ZLI-9005 Poly-L-Lysine等几种试剂，对已清洗的载玻片进行处理。具体方法如下：
1.1 APES：现用现配。将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的APES中，停留20~30秒钟，取出稍停片刻，再入纯丙酮溶液或蒸馏水中涮去未结合的APES，置通风橱中晾干即可。用此载玻片捞片时应注意组织要一步到位，并尽量减少气泡的存在，以免影响染色结果。
1.2 HistogripTM：将洗净的玻片放入以1:50比例丙酮稀释的Histogrip液中，停留1~2分钟，然后用双蒸水快速清洗三次，室温干燥或60oC烤箱烘烤一小时，装盒备用。
1.3 Poly-L-Lysine：将洗净、干燥的载玻片放入以1:10比例去离子水稀释的多聚赖氨酸溶液中，浸泡5分钟，60oC烤箱烘烤一小时或室温过夜干燥。装盒备用。试验中使用的器具均为非玻璃制品。 2、常用酶消化： 2.1 胰蛋白酶：一般使用浓度为0.05%~0.1%，消化时间为37℃、10~40分钟，主要用于细胞内抗原的显示。
2.2 胃蛋白酶：一般使用浓度为0.4%，消化时间为37℃、30~180分钟，主要用于细胞间质抗原的显示，如：Laminin（层粘蛋白），Collagen IV（IV型胶原）等。
g/ml的saponin溶液，消化时间为室温孵育30分钟。 2.3 皂素（Saponin）：一般使用浓度为2~10 3、抗原热修复： 可根据实验室的具体条件，选用微波炉抗原修复、高压锅抗原修复或水浴高温抗原修复。抗原热修复可选用各种缓冲液，如TBS、PBS、重金属盐溶液等，但实验证明，以0.01M枸橼酸盐缓冲液（pH6.0）效果最好。请选用我公司提供的ZLI-9064 枸橼酸盐缓冲液（粉剂）配制，取该粉剂一包溶于1000ml的蒸馏水中，混匀，其pH值在6.0 0.1，如因蒸馏水本身造成的pH值偏差，请自行调整。
3.1 石蜡切片微波炉抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，3％H2O2处理10分钟，蒸馏水洗2分钟×3。将切片放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，置微波炉内加热使容器内液体温度保持在92℃~98℃之间并持续10~15分钟（注意：无论是使用医用或家用微波炉，请根据具体机型酌情设置条件，务必满足以上步骤中对温度和时间的要求）。取出容器，室温冷却10~20分钟（注意：不可将切片从缓冲液中取出冷却，以便使蛋白能够恢复原有的空间构型）。PBS洗，下接免疫组化染色步骤。
3.2 石蜡切片高压抗原修复操作方法：切片脱蜡至水。将1500ml~3000ml的枸橼酸盐缓冲液（工作液）注入不锈钢压力锅中加热至沸腾。切片置于金属架上，放入锅内，使切片位于液面以下，盖锅压阀。当压力锅开始慢慢喷气时（约加热5~6分钟后），计时1~2分钟，然后将压力锅端离热源，冷水冲至室温后，取下气阀，打开锅盖，取出切片，蒸馏水洗后，PBS洗2分钟×3，下接免疫组化染色步骤。
3.3 石蜡切片电炉煮沸抗原修复操作方法：切片脱蜡至水后，放入盛有枸橼酸盐缓冲液（工作液）的容器中，并将此容器置于盛有一定数量自来水的大器皿中，电炉上加热煮沸，从小容器的温度到达92℃~98℃起开始计时15~20分钟，然后端离电炉，室温冷却20~30分钟，蒸馏水冲洗，PBS洗，下接免疫组化染色步骤。 4、免疫组化染色步骤： （以美国ZYMED公司SP试剂盒为例）
石蜡切片脱蜡至水。
3%H2O2室温孵育5~10分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性。
蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟，(如需采用抗原修复，可在此步后进行)。
5~10％正常山羊血清（PBS稀释）封闭，室温孵育10分钟。倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液，37℃孵育1~2小时或4℃过夜。
PBS冲洗，5分钟×3次。
滴加适当比例稀释的生物素标记二抗（1%BSA-PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或滴加第二代生物素标记二抗工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
PBS冲洗，5分钟×3次。
滴加适当比例稀释的辣根酶标记链霉卵白素（PBS稀释），37℃孵育10~30分钟；或第二代辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃或室温孵育10~30分钟。
PBS冲洗，5分钟×3次。
显色剂显色（DAB或AEC）。
自来水充分冲洗，复染，封片。
冰冻切片免疫组化染色步骤
m，室温放置30分钟后，入4℃丙酮固定10分钟，PBS洗，5分钟×3。用3％过氧化氢孵育5~10分钟，消除内源性过氧化物酶的活性。PBS洗，5分钟×2。冰冻切片4~8

免疫组化非特异性染色的消除方法
一、非特异性染色的主要因素
组织的非特异性染色的机理很复杂，其产生的原因主要可分为以下几点：
（1）一部分荧光素未与蛋白质结合，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去
。
（2）抗体以外的血清蛋白与荧光素结合形成荧光素脲蛋白，可与组织成分结合。
（3）除去检查的抗原以外，组织中还可能存在类属抗原（如Forssman氏抗原），可与组织中特异性抗原以外之之相应抗体结合。
（4）从组织中难于提纯抗原性物质，所以制备的免疫血清中往往混杂一些抗其他组织成分的抗体，以致容易混淆。
（5）抗体分子上标记的荧光素分子太多，这种过量标记的抗体分子带过多的阴离子，可吸附于正常组织上而呈现非特异性染色。
（6）荧光素不纯，标本固定不当等。 二、消除非特异性染色的方法
消除荧光抗体非特异性染色的方法应根据产生的原因采取适当的方法，常用的方法有以下几种：
（一）动物脏器粉末吸收法
常用肝粉（猪、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉、鼠脑粉和鸡胚粉等。每毫升荧光抗体中加入肝粉50～100mg,在离心管中充分混匀，在室温中振动2h，4℃中过夜，再搅拌10min，高速离心（3000～15000r/min）30min，1～2次后，即可使用其上清液。吸收一般应在临用前进行，吸收后之荧光抗体保存冰箱中勿超过2周。染色应作吸收前后之比较，吸收时可先用缓冲盐水将组织干粉浸湿，离心（3000～15000r/min）30min，除去上清液，再加入荧光抗体进行吸收，以免消耗过多的抗体。
肝粉或新鲜细胞吸收是一种非特异性的消除方法，对荧光抗体的荧光色素和蛋白都有吸附作用。如检查组织中的病毒抗原时，也可用相同的组织干粉或匀浆沉淀物吸收之。
用脏器肝粉吸收对荧光抗体损失较多，如果根据Hiramotos氏等的方法将组织的20%生理盐水匀浆液，用生理盐水洗2～3次，12000r/min
10min离心沉淀，用其沉淀物吸收其荧光抗体即能完全达到目的，京极方久氏认为这样吸收对荧光抗体几乎没有损失，他们常用此法，效果甚佳，吸收后放置一周左右，用时有必要再吸收一次。
【肝粉的制法】
（1）将若干只小白鼠或大白鼠放血杀死，取出肝脏，用生理盐水洗2～3次，除去血液，剥掉表面的结缔组织的脂肪。
（2）剪碎，用生理盐水反复洗涤至无血色止，然后再加生理盐水少许，用组织捣碎机或匀浆器作成匀浆。
（3）将肝匀浆装入离心管内（1/3左右），交换地用2～3倍量生理盐水和丙酮反复洗涤各三次，至上清无血色止，每次完毕先用2000r/min离心沉淀15 min后，再除去上清液。
（4）最后用丙酮洗涤肝浆，再用布氏漏斗过滤，或离心沉淀，将沉淀物平铺在洁净的玻璃板上，37℃烤干（过夜）。
（5）在乳钵中充分研磨，用120目铜筛筛选过后，分装，密封，低温干燥保存。
2006-12-22 13:24 wifgw
二）透析法
荧光素如FITC分子可以通过半透膜，而蛋白质大分子不能透过，可将未与蛋白结合的荧光素透析除去。
（1）将标记完毕的荧光蛋白液装入一透析袋或玻璃纸袋内，液面稍留空隙，紧扎。
（2）浸入0.02mol/pH
7.1～7.4的PBS中（悬于大于标记物体积约50～100倍的PBS内），在4℃中透析，每日更换3～4次PBS，约5～7天，透析液中无荧即可（在荧光光源照射下）。
（三）葡聚糖凝胶G-50柱层析法
除游离荧光素可用2×46cm柱层析法，详细方法参阅第二章。加入荧光抗体15～18ml（按床体积的5%～10%加样），使其缓慢渗入柱内，待即将全部入柱时，加入PBS少许，关闭下口，停留30～40min ，使游离荧光充分进入细筛孔中，然后再接通洗脱瓶开始滴入洗脱液。加入洗脱液一定量后，荧光抗体即向下移行，逐渐与存留于上端的游离荧光素之间拉开明显的界线，随着大量洗脱液的不断加入，二者分离距离越来越大，荧光抗体最先流出，分前、中、后三部分收集，测F/P比值，合格者合并，浓缩，分装。洗脱液用20%磺基水杨酸测定蛋白（发生沉淀反应），继续洗脱，游离荧光素则相继被洗脱下来，至洗脱液中无蛋白和荧光素后，此层析柱即可再用。
若用以除去荧光抗体中的游离荧光素和硫酸铵等盐类，可先在过柱前透析一夜，否则，NH4+太浓，在蛋白未完全洗脱时即出现NH4+，因而影响提纯与回收蛋白，一般待洗脱液出现蛋白时，即进行收集，之后出现SO4++（用1%BaCl2检查发生白色沉淀）。最后是NH4+，（用纳氏试剂检查呈黄棕色沉淀），待洗脱液无SO4++及NH4+后可再用。
如仅用小量荧光抗体，可用1×20cm的柱层析柱，取2g Sephadex G-50装柱，即可过滤2～3.5ml荧光抗体。
（四）DEAE纤维素柱层析法
标记过多或过少荧光素的抗体分子可用DEAE-纤维素柱层析法除去。方法如下： DEAE-纤维素柱的装柱，洗脱、再生方法等与提纯IgG方法相同。装柱所需DEAE-纤维素量以干重每克交换20～50mg标记蛋白量为宜
。常用梯度洗脱法如下：
（1）层析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡，标记物上柱后，先用0.01mol/L、pH7.2PB洗脱，洗出无色或淡绿色液体，洗脱液量（根据床体积大小每梯度乘3），然后依下列各种离子强度洗脱液，
分别洗脱和收集：
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/L NaCl）……洗脱部分1。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/L NaCl）……洗脱部分2。
0.01mol/L、pH7.2PBS（0.02mol/L NaCl）……洗脱部分3。
将此三部分收集液（每管5ml）分别测定其F/P比值，0.05mol/L NaCl pH7.2PB洗脱液280nm光密度高峰管合并，浓缩保存备用。因这部分非特异性染色荧光最少，是比较好的荧光抗体。其他两部分可以废弃。
（2）柱上吸附的过度标记蛋白可继续增加NaCl的浓度至
2.0mol/L洗脱完。
经过DEAE-纤维素层析后的标记抗体，其抗体量一般约损失50%，因此有些要求不太高的抗体，如抗细菌荧光抗体，不一定要这样处理，可用染色效价测定的稀释法除去非特异性染色。
（五）荧光抗体稀释法
先测定荧光抗体特异性染色与非特异性染色的效价，若二者效价相差较大，则可将荧光抗体稀释至一临界浓度，使特异性染色呈阳性，而使非特异性染色保持阴性，稀释方法和染色效价测定方法相同。
（六）纯化抗原法
用各种方法提纯单一成分的抗原是产生单价特异性抗体的最主要条件。近代免疫化学技术（免疫吸收法）和柱层析法等提供了很大的可能性，可参考有关专著。
（七）纯化抗体法---免疫吸收法
例如抗IgA血清的纯化方法---免疫吸收法。如分泌型IgA（ SIgA）抗原纯度不高，所制的抗血清常与IgG呈交叉反应，为此需要吸收，常采用纯化的人IgG戊二醛聚合物加以吸收纯化。方法如下：
1．人IgG聚合物的制备 在5ml含40mg/ml人IgG的0.1mol/L pH7.0磷酸缓冲溶液中，加入2.5%戊二醛溶液1ml，边加边搅，5min即出现混浊，逐现大块胶块，放置30min后，用研钵将凝胶磨细，继用1.0mol/L pH7.0磷酸缓冲溶液反复洗涤3次，末次加蒸馏水至20ml，即为人IgG聚合物悬液。
2．免疫吸收法 将待吸收的抗SIgG血清加入待量IgG聚合物悬液，置室温搅拌60min,离心沉淀，上清液即稀释1倍的纯化抗SIgA血清。如用IgG聚合物作少量分次吸收，其效果更好。
（八）伊文氏蓝（Evans blue）衬染法
用0.01%伊文氏蓝的0.01mol/L pH7.2PBS稀释荧光抗体，可将背景细胞和组织染色，呈红色荧光，与特异性黄绿色荧光形成鲜明的对比，减少了非特异性荧光，宜作常规应用。伊文氏蓝一般先配成1%溶液，保存于4℃，用前再稀释至0.01%用以
和然释荧光抗体。
此外，还可以用胰酶消化组织切片或用10%牛血清蛋白封闭法等消除非特异性染色，提高特异性染色。

Ⅱ 蒸馏水可以烧开喝吗它对身体有什么好处

蒸馏水可以煮沸饮用，但不建议长期饮用。蒸馏水是经过多层处理的水，以去除水中的微生物、细菌和矿物质。它经常被用于制备药物和化学实验。蒸馏水是纯水，但许多水经过反复处理，可能产生对人体有害的成分。所以蒸馏水可以煮沸后饮用，但不宜长期饮用，以免影响身体。长期饮用蒸馏水，会导致人体内无机盐的流失，同时也失去了从水中获取人体所需微量元素的机会，可以喝工业蒸馏水，对身体还是有害的。蒸馏水是将饮用水经过高温煮沸后，从上层水蒸气中凝结出来的水。

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Ⅲ 求助HE染色和免疫组化

• HE染色是应用最广泛的组织病理学常规染色技术。
  一染色程序
  1．石蜡切片HE染色（常规HE染色）
  （1）二甲苯Ⅰ 5～10min
  （2）二甲苯Ⅱ 5～10min
  （3）无水乙醇Ⅰ 1～3min
  （4）无水乙醇Ⅱ 1～3min
  （5）95%乙醇Ⅰ 1～3min
  （6）95%乙醇Ⅱ 1～3min
  （7）80%乙醇 1min
  （8）蒸馏水 1min
  （9）苏木素液染色 5～10min
  （10）流水洗去苏木素液 1min
  （11）1%盐酸-乙醇 1～3s
  （12）稍水洗 1～2s
  （13）返蓝（用温水或1%氨水等） 5～10s
  （14）流水冲洗 1～2min
  （15）蒸馏水洗 1～2min
  （16）0.5%伊红液染色 1～3min
  （17）蒸馏水稍洗 1～2s
  （18）80%乙醇 1～2s
  （19）95%乙醇Ⅰ 2～3min
  （20）95%乙醇Ⅱ 2～3min
  （21）无水乙醇Ⅰ &, nbsp; 3～5min
  （22）无水乙醇Ⅱ 3～5min
  （23）石炭酸-二甲苯 3～5min
  （24）二甲苯Ⅰ 3～5min
  （25）二甲苯Ⅱ 3～5min
  （26）二甲苯Ⅲ 3～5min
  （27）中性树胶封固
  注：①（12）和（13）项可省去，但（14）的冲水时间需延长至10～15min（细胞核显示更清晰）。
  ②（23）项可用无水乙醇代替；北方地区可省略。
  2．冰冻切片HE染色
  （1）冰冻切片固定 10～30s
  （2）稍水洗 1～2s
  （3）苏木素液染色（60℃） 30～60s
  （4）流水洗去苏木素液 5～10s
  （5）1%盐酸-乙醇 &n, bsp; &nbs, p; &nb, sp; 1～3s
  （6）稍水洗 1～2min
  （7）返蓝（用温水或1%氨水等） 5～10s
  （8）流水冲洗 15～30s
  （9）0.5%伊红液染色 1～2min
  （10）蒸馏水稍洗 1～2min
  （11）80%乙醇 1～2min
  （12）95%乙醇 1～2min
  （13）无水乙醇Ⅰ 1～2min
  （14）无水乙醇Ⅱ 1～2min
  （15）石炭酸-二甲苯 2～3min
  （16）二甲苯Ⅰ 2～3min
  （17）二甲苯Ⅱ 2～3min
  （18）中性树胶封固
  注：①（7）和（8）项可省去，但（9）的冲水时间需延长至10～15min（细胞核显示更清晰）。
  ②（15）项可用无水乙醇代替；北方地区可省略。
  二染色结果：细胞核呈蓝色，细胞浆、肌纤维、胶原纤维和红细胞呈不同程度的红色。钙盐和细菌可呈蓝色或紫蓝色。
  三染色注意事项
  1．切片染色前，应彻底脱蜡。
  2．用含有升汞液体固定的组织，其切片染色前应先脱去汞盐：
  （1）石蜡切片脱蜡至水洗
  （2）Lugol液 20min
  （3）流水冲洗 5min
  （4）95%乙醇 10min
  （5）水洗 1min
  （6）5%次亚硫酸钠水溶液 5min
  （7）流水冲洗 5min
  （8）显微镜观察除汞满意后，转入HE染色
  3．脱除福尔马林色素（必要时）：
  （1）石蜡切片脱蜡至水洗
  （2）1%NaOH(1ml)与80%乙醇（99ml）混合液 10min
  （3）流水冲洗 5min
  （4）转入HE染色
  4．严格执行HE染色流程，用显微镜控制细胞核的苏木素染色质量。HE染片应着色鲜艳，红、蓝分明，对比清晰。
  5．载玻片自二甲苯中取出后，应立即用洁净、光亮的盖玻片和稠度适宜的中性树胶湿封载玻片。封盖处内无气泡，外无溢胶。封片时必须进行操作人员和局部环境的二甲苯污染防护。不应将组织切片烤干或风干后再行封片。
  6．必须在载玻片的一端牢贴标签。标签上应印有病理科所在的医院名称。标签上应清楚显示有关的病理号及其亚号；标签上的病理号应准确无误，无涂改。
  7．制片完成后，技术人员应对切片与其相应的病理学检查记录单或取材工作记录单认真进行核对；确认无误后，将制备好的切片连同相关的活检申请单/活检记录单以及取材工作单等一并移交给有关的病理医师；交接双方经核对无误后，办理移交签字手续。
  8．石蜡切片-HE染色的优良率（甲、乙级切片所占的比率）应≥85%。石蜡切片-HE染色质量的基本标准列于附表。
  9．制片工作一般应在取材后2个工作日内完成（不含进行脱钙、脱脂等需要特殊处理的标本）。
  10．制片过程出现意外情况时，技术室人员应及时向病理医师和科主任报告，设法予以补救。
  
  附表 常规石蜡包埋-HE染色切片质量的基本标准
  优 质 标 准 满 分 质 量 缺 陷 减 分
  ⒈组织切面完整， ①组织稍不完整：减1～3分②不完整：减4～10分
  内镜咬检、穿刺标本切面数 10 ③未达到规定面数：减5分
  
  ⒉切片薄(3～5μm)，厚薄均匀 10 ①切片厚(细胞重叠)，影响诊断：减6～10分
  ②厚薄不均匀：减3～5分
  
  ⒊切片无刀痕、裂隙、颤痕 10 ①有刀痕、裂隙、颤痕，尚不影响诊断：减2分
  ②有刀痕、裂隙、颤痕，影响诊断：减5分
  
  ⒋切片平坦，无皱褶、折叠 10 ①有皱褶或折叠，尚不影响诊断：各减2分
  ②有皱褶折或折叠，影响诊断：各减5分
  
  ⒌切片无污染 10 有污染：减10分
  
  ⒍无气泡（切片与载玻片间/ 10 ①有气泡：减3分
  盖片与切片、载玻片间）， ②胶液外溢：减3分
  盖片周围无胶液外溢
  
  ⒎透明度好 10 ①透明度差：减1～3分
  ②组织结构模糊：减5～7分
  
  ⒏细胞核与细胞浆染色对比清晰 10 ①细胞核着色灰淡或过蓝：减5分
  ②红(细胞浆)与蓝(细胞核)对比不清晰：减5分
  
  ⒐切片无松散，裱贴位置适当 10 ①切片松散：减5分
  ②切片裱贴位置不当：减5分
  
  ⒑切片整洁， ①切片不整洁：减3分
  标签端正粘牢，编号清晰 10 ②标签粘贴不牢：减3分
  ③编号不清晰：减4分
  合 计 100
  切片质量分级标准： ①甲级片： ≥90分 （优）
  ②乙级片：75～89分（良）
  ③丙级片：60～74分（基本合格）
  ④丁级片： ≤59分 （不合格）
  
  四HE染色试剂的配制
  1．苏木素染液
  （1）Harri苏木素染液
  苏木素 1g
  无水乙醇 10ml
  硫酸铝钾 20g
  蒸馏水 200ml
  氧化汞 0.5g
  冰醋酸 8ml
  先用无水乙醇溶解苏木素，用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾；然后将该两液合并煮沸，加入氧化汞，继续加热和搅拌溶液至深紫色，随即用冰水冷却，恢复至室温后过滤备用。使用前加入冰醋酸并混匀、过滤。
  （2）Gill改良苏木素液
  苏木素 2g
  无水乙醇 250ml
  硫酸铝钾 17g
  蒸馏水 750ml
  碘酸钠 0.2g
  冰醋酸 20ml
  先用无水乙醇溶解苏木素，用蒸馏水溶解硫酸铝钾；然后将该两液混合，再依次加入碘酸钠和冰醋酸。使用前过滤。
  （3）Mayer改良苏木素液
  A液：苏木素 2g
  无水乙醇 40ml
  B液：硫酸铝钾 100g
  蒸馏水 600ml
  将苏木素溶于无水乙醇中（A液）；稍加热，使硫酸铝钾溶于蒸馏水中（B液）。将A液与B液混合后煮沸2min，再用蒸馏水补足至600 ml，加入400mg碘化钠充分混匀。染液呈紫红色。
  2. 盐酸－乙醇分化液
  浓盐酸 1 ml
  70%乙醇 99 ml
  3．伊红液
  （1）0.25～0.5%伊红Y水溶液
  伊红Y 0.25～0.5 g
  蒸馏水 100 ml
  冰醋酸 1滴
  （2）0.5%伊红Y-氯化钙水溶液
  伊红Y 0.5 g
  蒸馏水 100 ml
  无水氯化钙 0.5 g
  （3）0.25～0.5%伊红Y-乙醇溶液。
  伊红Y 0.25~0.5 g
  80%乙醇 100 ml
  4．石炭酸-二甲苯混合液
  石炭酸 1份
  二甲苯 3份
  
  石蜡组织切片的HE染色
  
  1．取材组织块，经固定后，常规石蜡包埋，4μm切片。
  
  2．切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯（I）5min→二甲苯（Ⅱ）5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min。
  
  3．苏木素染色5min，自来水冲洗。
  
  4．盐酸乙醇分化30s（提插数下）。
  
  5．自来水浸泡15min或温水（约50℃）5min。
  
  6．置伊红液2min。
  
  7．常规脱水，透明，封片：95％乙醇（I）min→95％乙醇（Ⅱ）1min→100％乙醇（I）1min→100％乙醇（Ⅱ）1min→二甲苯石碳酸（3：1）1min→二甲苯（I）1min→二甲苯（Ⅱ）1min→中性树脂封固。
  
  免疫组化操作规程
  
  （一）、仪器设备
  1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；
  2）水浴锅
  （二）、试剂
  1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L， KH2PO4 1.4mmol/L。
  2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。
  3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。
  4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。
  5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
  6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。
  7）封裱剂：
  a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合；
  b、油和TBS(或PBS)配制。
  8）TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。
  （三）、操作流程
  1、脱蜡和水化
  脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。
  1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；
  2）无水乙醇中浸泡5分钟；
  3）95%乙醇中浸泡5分钟；
  4）70%乙醇中浸泡5分钟；
  2、抗原修复
  用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。
  1）抗原热修复
  （1）高压热修复 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
  （2）煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。
  （3）微波热修复 在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。
  2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。
  3、免疫组织化学染色
  SP法
  1）脱蜡、水化；
  2）PBS洗2～3次各5分钟；
  3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；
  4）PBS洗2～3次各5分钟；
  5）抗原修复；
  6）PBS洗2～3次各5分钟；
  7）滴加正常山羊血清封闭液,室温20分钟。甩去多余液体。
  8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。
  9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。
  10）PBS洗3次各5分钟；
  11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；
  12）II抗中可加入0.05%的tween-20。
  13）PBS洗3次各5分钟；
  14）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；
  15）PBS或自来水冲洗10分钟；
  16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；
  17）自来水冲洗10～15分钟；
  18）脱水、透明、封片、镜检。
  SABC法
  1)脱蜡、水化。
  2)PBS洗两次各5分钟。
  3)用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。
  4)抗原修复。
  5)PBS洗5分钟。
  6)滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。
  7)滴加Ⅰ抗,室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。
  8)PBS洗三次每次2分钟。
  9)滴加生物素化二抗,20℃～37℃20分钟。
  10)PBC洗3次每次2分钟。
  11)滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟。
  12)PBS洗4次每次5分钟。
  13)DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。
  14)蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。
  15)脱水、透明、封片、镜检。
  
  PAS染色法
  
  操作步骤
  
  1. 固定液:用Carnoy液或75%酒精 Carnoy固定液: 纯酒精 60 ml 冰醋酸 10ml 氯仿 30ml
  
  2. 染色液
  
  1) 过碘酸酒清夜配法:
  
  过碘酸(HIO .2H O) 0.4g 95% 酒精 35ml M/5醋酸钠(2.72g+蒸馏水100ml) 5ml蒸馏水10ml
  
  保存于冰箱内,用棕色瓶,可用两周.
  
  2) Schiff氏液:
  
  0.5克碱性品红加入100毫升蒸馏水中,时时摇动三角瓶5分钟,使之充分溶解.冷却至50℃后过滤,加入10毫升1N盐酸.冷却至25℃,加入0.5-1克偏重硫酸钠,在室温中至少静置24小时,然后密封冰箱保存.
  
  3) Schiff氏酒精液配置 Schiff氏液 11.5ml 1N HCI 0.5ml 纯酒精 23ml
  
  4) 亚硫酸水
  
  1%偏重亚硫酸钠 10ml 1N HCI 10ml 蒸馏水 180ml的树胶溶解。
  
  Schiff（希弗）试剂
  在100 mL热水里溶解0.2 g品红盐酸盐（也有叫碱性品红或盐基品红），放置冷却后，加入2g亚硫酸氢钠和2 mL浓盐酸，再用蒸馏水稀释到200 mL。
  或先配制10 mL二氧化硫的饱和水溶液，冷却后加人0．2g品红盐酸盐，溶解后放置数小时使溶液变成无色或淡黄色，用蒸馏水稀释至200 mL。
  此外，也可以将0.5 g品红的盐酸盐溶于100 mL热水中，冷却后用二氧化硫气体饱和至粉红色消失，加人0.5 g活性炭，振荡过滤，再用蒸馏水稀释至500 mL。本试剂所用的品红是para-rossaniline（或称para-fuchsin,又称假红）。此物与另一类似物rossaniline（或称fuchsin,称洋红）不同。
  品红溶液原是桃红色，被二氧化硫饱和后变成无色的Schiff试剂。
  Schiff试剂应密封贮存于暗冷处，倘若受热见光或露置空气中过久，试剂中的二氧化硫易失，结果又显桃红色，遇此情况，应再通入二氧化硫，使颜色消失后使用。但应指出，试剂中过量的二氧化硫愈少，反应就愈灵敏。

• 
  

Ⅳ 免疫组化 如何复染（免疫组化，苏木精，盐酸，石

（一）、仪器设备

1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅

（二）、试剂

1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L.

2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g.

3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0，加水至1000ml.

4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0，加水至1000ml.

5）酶消化液： a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2（pH7.8） 配制。 b、0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。

6）3%甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。

7）封裱剂：

a、甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0～9.5）等量混合；

b、油和TBS（或PBS）配制。

8）TBS/PBS pH9.0～9.5，适用于荧光显微镜标本；pH7.0～7.4适合于光学显微镜标本。

（三）、操作流程

1、脱蜡和水化

脱蜡前，应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。

1）组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后再浸泡10分钟；

2）无水乙醇中浸泡5分钟；

3）95%乙醇中浸泡5分钟；

4）70%乙醇中浸泡5分钟；

2、抗原修复

用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片。

1）抗原热修复

（1）高压热修复 在沸水中加入EDTA（pH8.0）或0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）。盖上不锈钢高压锅的盖子，但不进行锁定。将玻片置于金属染色架上，缓慢加压，使玻片在缓冲液中浸泡5分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后，去除热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。本方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。

（2）煮沸热修复 电炉或者水浴锅加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10~15分钟。

（3）微波热修复 在微波炉里加热0.01M枸橼酸钠缓冲溶液（pH6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5~10分钟，反复1-2次。适用的抗原有：AR，Bax，Bcl-2，C-fos，X-jun，C-kit，C-myc，E-cadherin，Chromogranin A，Cyclin，ER，Heat shock protein，HPV，Ki-67，MDMZ，p53，p34，p16，p15，P-glycoprotein，PKC，PR，PCNA，ras，Rb，TopoismeraseⅡ等。

2）酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热至37℃，切片也预热至37℃，消化时间约为5~30分钟；胃蛋白酶消化37℃时间为30分钟。适用于被固定遮避的抗原，其中有：Collagen，Complement，Cytokeratin，C-erB-2，GFAP，LCA，LN等。

3、免疫组织化学染色

SP法

1）脱蜡、水化；

2）PBS洗2～3次各5分钟；

3）3%H2O2（80%甲醇）滴加在TMA上，室温静置10分钟；

4）PBS洗2～3次各5分钟； 5）抗原修复；

6）PBS洗2～3次各5分钟；

7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。

8）滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1小时或者4℃过夜或者37℃1小时。

9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟。

10）PBS洗3次各5分钟；

11）滴加Ⅱ抗40～50μl，室温静置，或37℃1小时；

12）II抗中可加入0.05%的tween-20.

13）PBS洗3次各5分钟；

14）DAB显色5～10分钟，在显微镜下掌握染色程度；

15）PBS或自来水冲洗10分钟；

16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化；

17）自来水冲洗10～15分钟；

18）脱水、透明、封片、镜检。

SABC法

1）脱蜡、水化。

2）PBS洗两次各5分钟。

3）用蒸馏水或PBS配置新鲜的3%H2O2，室温封闭5～10分钟，蒸馏水洗3次。

4）抗原修复。

5）PBS洗5分钟。

6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟。甩去多余液体。

7）滴加Ⅰ抗，室温1小时或者4℃过夜或者37℃1小时（4℃过夜后在37℃复温45分钟）。

8）PBS洗三次每次2分钟。

9）滴加生物素化二抗，20℃～37℃20分钟。

10）PBC洗3次每次2分钟。

11）滴加试剂SABC，20℃～37℃20分钟。

12）PBS洗4次每次5分钟。

13）DAB显色：DAB显色试剂盒或者自配显色剂显色（镜下掌握显色程度）。

14）蒸馏水洗。苏木素复染2分钟、盐酸酒精分化。

15）脱水、透明、封片、镜检。

Ⅳ 关于微波炉抗原修复

①该试剂也应注意有多种不同的含水分子量。
②该贮存液久放后可出现结晶。每次使用前，先取出回至室温，摇晃其结晶溶解，也可用微波炉促其快速溶解，然后再用。
0.01M PBS工作液的配制：
取一2000ml的容量瓶一个，装入已称好的NaCt18g，加入少量蒸馏水让其彻底溶解，再加入 Ⅰ液13ml，Ⅱ液87ml，加蒸馏水凑足2000ml，即可使用，即可使用该溶液在室温下可保存3-4周，但以新配为佳。
PBS工作液配制完毕后，都要测其PH值，如果偏酸，可用氢氧化钠来调试，如果偏碱可用HCl调试，测试有如下n种方法：
①PH测试笔测试，这是一种简便、易行、结果较为准确的测试方法。当配制完PBS后，取一小杯，倒入配好的PBS，插入测试笔，打开开关，小屏幕上将可出现测出的PH结果。PH如果7.6不足，小量的可用0.2M Na2HPO4调校，大量的可用氢氧化钠调校。PH如果高于7.6，小量的用0.2M NaH2PO4调校，大量的可用HCL来调校。
②用试纸来测试：PH试纸有两种，一种为广泛PH试纸，范围在1-14，另一种是精密试纸有各种各样的范围。但是，作为冲洗切片用的PBS，其精确度不需要十分精确，如配PH7.6时，测试时在PH7.5或7.7，都可使用。试纸测试PH值，停靠其反应的颜色来确定，十分简便，一般的试剂都可用它来测试。
③仪器测试：对于要求较高，需较准确的PH值，须彩用仪器测试。
1. Tris缓冲溶液(Tris buffer solution,TBS)
①1N HCL ，浓HCL(双重1.19)8.3ml，先取50ml蒸馏水，加入HCL再加水到100ml。
②0.5M Tris-HCL缓冲液(PH7.6)
取Tris(羟甲基氨基甲烷)6.57g，加入少许的蒸馏水搅拌，直至溶解，再加入1N HCL42ml，然后用蒸馏水凑足100ml，于4℃冰箱保存。
临用时，将上述溶液10稀释倍，即为0.05M工作液。