Ⅰ 外泌体提取策略
外泌体即细胞外囊泡（简孙纳卜称EVs）是所有细胞主动分泌的纳米级囊泡,活细胞释放不同类型的细胞外囊泡进入细胞外环境进行细胞间交流,细胞外囊泡越来越多地被认为是有希望的液体活检生物学标志物｡根据相似囊泡的直径大小可将细胞外囊泡分为三类,直径在50-150nm的外泌体,直径在100-1000nm的微囊泡､外粒体和微颗粒,直径在-100-5000nm的凋亡小体｡目前主要认为,外泌体产生的过程是细胞膜内陷形成内体,再形成多泡体,多泡体与质膜融合导致其管腔内囊泡释放到细胞外,产生一种称为外泌体的EV亚型｡
2 外泌体的提取纯化方法
2.1 基于密度的分离方法
2.1.1 超速离心法
超速离心法是最常用的外泌体提取方法,首先,施加较低速度的离心力300g以从细胞培养液中去除细胞;然后,对上清液施加较大的离心力(10000-20000g),去除大的细胞碎片和破碎的细胞器;最后,再次进行高速(100000-150000g)离心从 上清液 中收集外泌体,所有离心在4℃下进行｡超速离心法获得的外泌体不被分离试剂污染,且分离数量多,处理样本小｡尽管超速离心法是提取外泌体最广泛的“金标准”,但仍然有很多缺点,如所需的超高速离心仪器比较昂贵､样品量大､耗时长､电镜观察外泌体时仍存在蛋白质污染｡
2.1.2 蔗糖密度梯度离心法
目前已发现,外泌体在蔗糖梯度为1.15-1.19g/mL密度中漂浮,所以根据这个特性,可以将样品与蔗糖梯度溶液一起超速离心,外泌体沉降到不同的密度区域就可以将其区分出来｡蔗糖密度梯度离心法需要预先配好连续梯度浓度的蔗糖溶液,将蔗糖溶液铺于离心管底部,再将样本放于上部,4℃下100000g超速离心｡蔗糖密度梯度离心法获得的外泌体纯度较高,但是前期准备复杂,耗时长,又不能完全将外泌体与蛋白质分离开｡2013年10月ISEV会议一些研究人员表示,通过蔗糖密度梯度离心法分离囊泡时,细胞囊泡的生物功能丧失｡
2.2 沉淀法
2.2.1 聚乙二醇 (PEG)
PEG 是一种水溶性非离子化合物,具有极强的亲水性,可以与疏水的脂质双分子层结合,从而改变外泌体的溶解度而使外泌体沉淀｡RIDER等研究发现,PEG水平会影响外泌体的产率,且从外泌体中获得的总蛋白和RNA在数量和质量上足以用于蛋白质组学和测序分析｡沉淀法操作简单,不需要特殊设备,更经济,外泌体产量高,但是会沉淀一些非外泌体的疏水性物质而导致外泌体纯度不够｡
2.2.2 试剂盒法
最近已经开发出基于聚合物共沉淀的试剂盒,如ExoQuick､TEI等,可用于提取多种体液中的外泌体｡聚合物沉淀剂ExoQuick与样品4℃共孵育30min,然后室温1500g离心30min,即可获得外泌体沉淀｡与超速离心法比较,试剂盒法更简便､耗时短,且能获得更高的外泌体产量｡试剂盒法获得外泌体沉淀含有的杂质较多,不同来源的样本需要使用不同的试剂盒来进行提取,且试剂盒价格较贵｡
2.3 基于大小的分离方法
2.3.1 SEC SEC
主要根据外泌体的大小对外泌体进行分离和纯化｡样品中大分子物质不能进入凝胶孔而被流动相快速洗脱出来,尺寸小于孔径的物质可进入多孔材料,需要较长时间被洗脱出来,即可通过不同的洗脱时间分离外泌体｡BING等证明了琼脂糖凝胶可以从无血小板上清液中纯化出外泌体,通过这种方法茄吵,外泌体很容易从蛋白质和高密度脂蛋白中分离出来｡HONG等通过改编和使用mini-SEC方法能够有效分离出外泌体,与漫长而复杂的超速离心法不同,它可在30min内完成外泌体分离｡通过SEC分离的外泌体纯度较高,分离出结构上完整且功能活跃的囊泡是基于微型SEC分离的重要优势,但数量较少,而且需要特殊设备,故应用不广泛｡
2.3.2超滤法
超滤法是根据外泌体的大小使用相应孔径的滤膜,将样品中小分子物质过滤到膜的另一侧,而将大分子物质滞留在膜上来达到分离的目的｡超虑法简单､省时､成本低｡LIU等改则穗良了简单的超滤法,通过将不同孔径的膜(200､100､80､50､30nm)串联在一起,实现了不同大小外泌体的快速分离,且捕获效率明显高于超速离心法｡然而,过滤器很容易被囊泡和其他大分子物质堵塞,这种情况很容易导致膜压力过大而破碎｡
2.4 基于表面成分亲和力的分离法
2.4.1 蛋白质
外泌体表面含有丰富的蛋白质,所以基于其表面成分的亲和力特别适合于分离外泌体｡CD63是外泌体中发现的最丰富的蛋白质之一,因此,常用抗CD63免疫吸附外泌体｡ZHAO等通过使用抗CD63包裹的磁珠与血液样品不断混合,将外泌体捕获到磁珠上后,加 缓冲液 冲洗5min,然后引入3种不同荧光染料标记的抗体[抗CD24､抗上皮细胞黏附分子(抗EpCAM)､抗糖类抗原-125(抗CA-125)],通过观察不同荧光强度可以量化卵巢癌中不同肿瘤标志物的表达水平｡
2.4.2 膜磷脂
虽然大部分基于表面成分的亲和方法是基于外泌体表面的蛋白质,但是脂质双层也是一种很好的检测目标｡XU等利用外泌体膜上表达的磷脂酰 丝氨酸 (PS)可以被PS结合受体Tim4很好地结合,用Tim4固定化的磁珠与样品反应进行外泌体捕获,并且观察到洗脱的外泌体保持着完整的形态,与商业外泌体提取试剂盒相比,表现出更高的捕获率｡CHEN等利用外泌体将带负电荷的PS暴露在膜上的特点,使用带正电荷基团的离子交换树脂的磁珠与血浆样品反应,血浆中的外泌体就能与磁珠结合,通过这种方法分离的外泌体具有比超速离心法更高的回收率和更少的杂质蛋白｡
2.5 ACE分离法
ACE微阵列产生的介电泳(DEP)分离力是通过施加交流电场产生的,纳米级的粒子和其他纳米级实体物质被吸引到圆形微电极边缘周围的DEP高场区域,细胞和大的实体物质被吸引到DEP低场区域｡ IBS EN等的ACE装置需要30-50μL血浆样品就能够在15min内将外泌体浓缩到微电极周围的高场区域｡ACE设备流程明显快于目前使用的方法,这个装置简化了外泌体提取和回收过程的能力,明显减少了加工步骤和消耗时间｡CHEN等构建了具有交叉电极的DEP芯片,能在30min内从血浆样品中分离出外泌体｡经过测试证明,DEP芯片具有高捕获率和高回收率,需要的时间更短,并且不需要笨重和贵重的仪器｡
2.6 微流控芯片法
微流控芯片法是新开发出来的用于快速高效分离样品中外泌体的方法｡WOO等使用2个纳米过滤器(Exodisc)集成的实验盘在30min内实现了20-600nm外泌体的全自动富集｡使用纳米粒子跟踪分析定量检测证实了细胞培养上清液中外泌体的回收率大于95%｡与超速离心法相比,Exodisc提供了高出100倍的mRNA水平,更省时,所需样本量更少｡FANG等开发了一种微流体芯片,将包裹了抗CD63的磁珠与血浆样品通入芯片,在第1个腔室中捕获到外泌体,通入一抗与磁珠-外泌体混合物结合,再通入荧光标记的二抗形成磁珠-外泌体-一抗-二抗混合物聚集在第2个腔室｡微流控芯片法操作简单,捕获率高,特别适合于生物学研究｡外泌体作为癌症诊断的有前景的生物学标志物,其在癌症的液体 活检 中受到关注｡外泌体的生物学价值和临床应用价值凸显了开发有效提取和分离外泌体技术的重要性和必要性｡相信随着技术的不断进步和创新,外泌体提取将变得更加简便经济,纯度越来越高,完整性越来越好｡
提取后往往需要进一步检测，确定提取的是不是外泌体。有三种方法：1. 扫描电镜观察；2. NTA仪器粒径检测；3. WB检测。如图所示，在外泌体上往往存在许多标志物，这时候就可以选择相应的抗体进行WB检测。根据22 篇外泌体相关文献的统计，排在前4 位的检测指标为 CD63（13/22）、Tsg101(8/22)、CD9 和CD81并列第三位（6/22）；接着检测较多的4 个指标为Alix （4/22）、HSP70(3/22)、flotillin (3/22)和Syntenin (2/22)；此外还有一些指标仅在1 篇文献中出现过，例如HSP90、LAMP2B、LMP1、ADAM10、nicastrin、AChE、AQP2、RPL5、a-1AT。针对外泌体的定性检测至少选择两个指标就能满足文章发表需要了，比如检测CD63 和Tsg101。
Ⅱ 外泌体相关研究文献分享,轻松读完一篇文献（十九）
分享一篇发表在J Extracell Vesicles（2020年IF=25.83）上的文章，标题为《Active cargo loading into extracellular vesicles: Highlights the heterogeneous encapsulation behaviour》。细胞外囊泡(EVs)是生物纳米颗粒，来源于大多数细胞类型，用于调节细胞间通信。它们作为天然分泌的纳米囊泡，在药物传递领域展现出巨大潜力，因其固有的生物相容性、合适的尺寸和固有的细胞靶向能力。
尽管EV治疗具有独特优势，但封装大量治疗分子以稳定使用作为输送载体仍是一个挑战。研究主要分为两类载药方法：预装载和后装载。预装载涉及将小分子药物与亲本细胞共孵育或转染药物编码DNA到亲本细胞，然后分离自然携带治疗分子的EV。然而，这种方法仅限于培养细胞来源的EV，难以应用于血浆或食物来源的EV。后装载方法则在被动或主动刺激下，如孵育、超声、冻融和电穿孔，将药物载入纯化的EV。尽管如此，所有方法都遇到了装载能力较差的问题，特别是对于亲水分子的封装。
为了提高装载效率并促进治疗药物封装，研究提出了一种高效载药方法，名为“超声和挤压辅助主动负载”(SEAL)。该方法通过在硫酸铵中重悬并超声mEVs，暂时渗透膜以建立主动加载所需的跨膜铵梯度。挤压操作缩小mEVs，使颗粒尺寸均一，从而重塑不利于载药和递送的非球形或多层囊泡。然后用PBS透析散装溶液，并用阿霉素孵育进行活性负荷。
通过TritonX-100裂解mEVs样品，检测荧光信号以确定SEAL的效率。与被动孵育相比，由于药物封装更有效，荧光强度增加了10.5倍。显著的荧光猝灭进一步证实了更多药物在SEAL制备的mEVs腔内累积。在脂质体模型中也获得了一致的结果。Western blot检测显示超声和挤压处理没有显著影响mEVs的蛋白含量。
为了优化SEAL的技术参数以改善载药量，研究发现2-4分钟的超声处理和0.5-1M硫酸铵溶液条件效率最佳。延长超声处理时间或使用更浓缩的溶液都不能在不影响结构完整性的情况下提高封装效率。挤压操作结果显示，超声处理后的3个挤压循环足以减小mEVs的尺寸，提高封装效率。通过多参数分析，揭示了mEVs的封装异质性与成分方差之间的相关性，进一步指导了纯化过程中去除不需要的组分，提高纯度。
为了彻底揭示异质性，研究应用nFCM系统对SEAL制备的Dox-mEVs进行单颗粒分析。这提供了更定量的方法来表征载药能力，包括活性载率和活性加载效率。研究发现未/低负载颗粒的共存是显著的，因此采用超滤(UF)、尺寸排除色谱(SEC)和胰蛋白酶处理三种EV纯化方法进行了研究，发现SEC和胰蛋白酶处理能够增加活性负载率，而UF纯化导致样品损失。
研究还分析了封装异质性与脂质包涵体的相关性，证明只有具有脂质包涵体的颗粒是可主动加载的。脂质探针介导的磁分离技术(LPMIT)用于选择性去除非脂质封闭颗粒，提高Dox-mEVs样品的纯度。纯化的Dox-mEVs样品的活性负载率进一步提高到63.2%。
牛乳中含有大量酪蛋白，使mEVs的纯化和应用更加复杂。因此，研究引入了免疫磁性分离技术(IMIT)以去除所观察到的酪蛋白成分，并进一步提高活性负载率到83.6%。
研究最后进行了细胞毒性分析和细胞内化行为分析，证明由SEAL制备的装载mEVs的治疗潜力以及样品纯度对整体治疗性能的影响。细胞毒性分析显示空白mEVs的细胞毒性可以忽略不计，而Dox-mEVs表现出强大的细胞毒性反应。细胞内化行为分析则表明转铁蛋白偶联后Dox-mEVs增强了细胞毒性，进一步证实了配体促进的内化。
文章的目的是分享在提高EV药物封装效率和改善治疗性能方面的最新研究成果。通过引入高效载药方法和优化纯化过程，研究揭示了药物封装异质性对治疗结果的潜在影响，并证明了SEAL制备的mEVs制剂具有优越的治疗性能。有兴趣的读者可以自行查找原文进行更深入的了解和研究。
Ⅲ 实战分享 | 外泌体提取之经验小结
近些年来，关于外泌体的研究如火如荼。外泌体在免疫中抗原呈递、肿瘤的生长与迁移、组织损伤的修复等生理病理上起着重要的作用。同时，不同细胞分泌的外泌体具有不用的组成成分和功能，可作为疾病诊断的生物标志物。 来自华中科技大学同济医学院附属协和医院的崔老师，对外泌体提取积累了自己的心得，并将自己的研究成果发表在 Bioactive Materials 上。 下文是崔老师的分享。
要进行关于外泌体的研究，提取纯化外泌体一直是大家非常关注的问题。 能否获得较高纯度的足量外泌体，直接关系着后续研究能否开展 。虽然目前仍然没有能同时保证外泌体的含量、纯度和生物活性的提取宏氏方法，但是我们可以结合当前的实际情况，对外泌体提取做一些探讨和经验总结。
超速离心（差速离心）法是目前最常用的外泌体提取方法 ，即采用低速离心、高速离心交替进行，可分离到大小相近的囊泡颗粒。超离法因操作简单，获得的囊泡数量较多而广受欢迎。本人近期发表的论文中最后也是采用了这种方法。
具体的步骤大家都比较熟悉，无论是提取血清来源的外泌体，还是细胞条件培养基来源的外泌体 ，大家都习惯于先将血清或者条件培养基收集后保存于-80℃的温度下，等达到一定量后，再批量进行超速离心。
这样的话， 大家会发现一个非常严重的问题，尤其是在拍摄电镜的时候——背景杂质很多，并且很多囊泡的形态不够典型，不镇绝雀是文献中描述的那种典型的双凹圆盘状或者茶托状。
通过几次实验的对比，我大概发现了原因， 主要是由于在冻存收集到培养基的时候，没有进行低速离心和普通高速离心。
低速离心可以去除培养基中的未贴壁细胞、死细胞以及大的细胞残骸，而普通高速离心可以去除其中的大型细胞外囊泡。无论是未贴壁细胞、死细胞、大的细胞残骸，还是大型细胞外囊泡，在-80℃冻存及复温的过程中，都会发生破裂，产生小型的细胞膜碎片结构。
这样的话，就导致了电镜背景很杂乱，难以达到高水平论文杂志期刊的要求。另外，还会导致这御早样一个矛盾现象，即蛋白定量中计算的外泌体产量虚高，而蛋白免疫印迹中外泌体标记物蛋白的含量却不高。
因此，在这里推荐给大家一个小贴士
就是在收集准备提取外泌体的条件培养基或者血清时，一定要提前做到低速离心和普通高速离心这一步，尤其是为了做透射电镜或者蛋白免疫印迹实验而提取的外泌体 ，一定要注意这一点。尽管过程比较费时，但是能生产出有用的结果才是更重要的。
至于其他的外泌体提取方法，如密度梯度离心、色谱柱、超滤离心法、微流控芯片法、磁珠免疫法、多聚物沉淀法，我看到学校里面鲜少有人去尝试，毕竟更麻烦。但不同的方法各有优劣，大家可根据自己的实验，谨慎选用。