1. 纯化生物产品的得率是如何计算的
生物药物的提取纯化技术
第一节 概述
一、生物药物的特点及纯化方法
许多生物药物具有生物活性，其稳定性受pH,一温度、离子强终提取过程所使用的溶剂和表面活性剂、金属离子等方面的严件物药物对剪切力很敏感，分子量越大，其稳定性就越差，在甘离纯化过程中，条件就应当越温和。一些组分的浓度非常低。但是生物药物产品的纯度却要求很高，含量要达到95%甚至98%以上。结晶态产品最好，药物还应具有正常的颜色、稳定性和溶解速率。
生物药物的制备，如蛋白质制备，涉及物理、化学和生物学知识。其主要原理有两个方面：一是利用混合物中组分分配率差别，把它们分配于可机械分离的两个或几个物相中，如盐析、有机溶剂提取、层析和结晶等；二是将混合物置于单一物相中，经物理力场作用使各组分分配于不同区域而达分离目的，如电泳、超离心、超滤等。相互分离主要利用蛋白间各种性质的微小差别,诸如分子形状、分子量大小、带电性质、溶解度、生物功能专一性等，制备方法可按这些主要因素进行分类。按分子大小和形态分差速离心、超滤、分子筛及透析等方法；按溶解度分为盐析、溶剂抽提、分配层析、逆流分配及结晶等；按电荷差异分为电泳、电渗析、等电点沉淀、离子交换层析及吸附层析等；按生物功能专一性有亲合层析法等。
蛋白分离纯化比较困难。需要研究目的物质的微细特征，巧妙联用各种方法并进行严密的操作，并有必要了解精制过程的精制程度和回收率。具有活性的蛋白可利用吸收光谱等物理性质或以相当于单位氮活性增加进行追踪；其他蛋白可用电泳、超离心、层析、扩散及溶解等测定纯度；不稳定蛋白，如分离SH-酶时，使用试剂及缓冲液等要确认不含重金属离子（特级试剂也需检定）。
蛋白质纯化的操作如脱盐、浓缩干燥等均与低分子物不同，须经独特的繁琐操作。
提纯蛋白和酶时常混有核酸或多糖，一般可用专一性酶解、有机溶剂抽取及选择性部分沉淀等法处理。小分子物质常在制备中经多次液相与固相转化被分离或最后用透析法除去。而同类物质分离，情况则复杂得多。主要采用盐析、有机溶剂沉淀，等电点沉淀、吸附、结晶、电泳、超离心及柱层析法等。其中，盐析、等电点及结晶法用于蛋白质和酶的提纯较多；有机溶剂抽提和沉淀用于核酸提纯较多；柱层析、梯度离心对蛋白和核酸的提纯应用十分广泛。
蛋白分离纯化方法很多。 Bonnerjea 等人对有关蛋白和酶的分离纯化方法及其特征进行了分析，发现主要有10种方法，它们的出现频率为：
离子交换 75%
亲和过程 60%
沉 淀 57%
凝胶过滤 50%
其 它 <33%
目前尚无一种方法可用以纯化各种蛋白质，但每种蛋白质都可设法分离纯化。选择纯化方法，需要考虑到纯度、活性、得率等。
二、提取纯化的单元操作和基本工艺流程
生物药物的提取和纯化可分为5个主要步骤：预处理、固液尹离产缩、纯化和产品定型（干燥，制丸，挤压，造粒，制片）每一步骤都可采用各种单元操作。在提取纯化过程中，要尽可能减少操作步骤，因为每一操作步骤都不可避免带来损失。操作步骤多，总收率就会下降。生物药物提取工艺流程的基本模式如1-1所示。根据主要分离因素排列的单元分离范围见图1-2。
图1-1 生物药物提取工艺流程的基本模式
表1-1根据主要分离因素排列的单元分离范围
三、提取纯化单元操作技术的特点
现代生物制药领域提取纯化技术的进步得益于生化分析分离技术开拓性工作的成果汾离纯化技术的特点之一是各种技术产互交叉，新型的分离纯化方法不断涌现。如沉淀技术和亲和技梦相结合•形成了亲和沉淀技术；超滤和亲和技术相结合，形成了严和超滤技术；萃取与载体膜相结合，形成了液膜载体萃取法。这种新方法取长补短，使分离纯化过程更加科学合理、快速有效、经济实用。尽管有些方法仍处于实验室的试验阶段，要用于工业规模还需要进一步探索，有的甚至没有实用价值，但都可为今后的产展提供新的思路。
生物药物提取纯化技术的另一特点是注重新材料的研制开发如膜分离介质，层析介质，亲和配基，新型萃取剂等在最近几年来发展非常快。提取纯化设备方面推陈出新，在设备的计算机控制及生产自动化，连续化及GMP规范化等方面取得很大的成就。
膜过滤技术发展很快，分为微滤、超滤和纳滤，不仅用于细胞的分离，还用于蛋白质的浓缩。超滤技术的主要特点是节能，对生物大分子类药物无破坏作用。液一液萃取广泛应用于抗生素及小分子量药物的提取。溶剂选择的余地大，且易实现大规模生产。高速离心式液体萃取机是目前效率最高，使用最广的装置。液一液萃取技术还衍生出许多新的萃取技术，如双水相萃取，亲和萃取，超临界萃取等。双水相萃取蛋白质类药物是大规模提取高纯度蛋白质类药物的有效技术。而超临界界萃取利用超临界流体的物理特性，即通过压力和温度的改变控制溶质在溶剂中的分子扩散能助，控制溶质的溶解度，从而实现分离。
层析（色谱）技术是最近几十年来发展最快的纯化技术。层析装置的种类很多，且分离纯化机理也各不相同，适应于许多药物产品的分离纯化。离子交换色谱是应用最广，且易于实现大规模生产的方法。应用于抗生素、氨基酸、核昔酸、蛋白质的提取和纯化。分子筛层析根据分子量大小不同的原理，适应于蛋白质类药物的纯化。层析分离技术的最高层次当属基于分子识别的技术如亲和层析。这一技术已衍生出一大批新的技术，如免疫亲和层析、染料亲和层析、金属离子鳌合层析。疏水性层析是基于分子的疏水性能来分离纯化的。高效液相色谱法本是分析化学的常用手段，现已将其扩展到生物药物的分离纯化的应用中。有些设备仅可进行分析，有的还可用于分离纯化，在新药开发的过程中，缩短了分离纯化所需时间。
与层析技术同步发展的各种分离介质是层析分离的技术保障，商品化的预装柱、缓冲剂、计算机程序控制还使操作变得简单易学。置换层析与洗脱层析不同，是指吸附在层析柱上的一种组分被另一种置换剂（与层析上的介质的亲和力大于原被吸附的组分）置换出层析柱的层析技术。该技术有上样量高，分辨率高的特点。被分离的样品在分离过程中还有浓缩作用。
总之，随着科技的发展，新的分离、提取、纯化技术还将不断得到改进。
四、提取纯化的工艺论证
我国1992年修订了GMP,要求从1993年3月1日以后新建或改建的药厂，均要符合GMP的要求。1994年开始了各项验证，其中工艺论证是关键的一个不可缺少的组成部分．产品的纯化是生产过程中关键的一步。这涉及到药物的质量。所谓工艺验证，就是通过系统的方法得到关于生产工艺的书面材料，证明并保证生产过程能始终如一地生产出特定的高质量的产品。提取纯化处理工艺验证的范围包括：厂房设施、工程仪表、机械设备、生产环境、工艺条件、计算机软件、介质、原材料、半成品、成品、操作人员素质和测试方法等。以上各个部分都要有验证材料或试验数据，根据这些材料和数据写出验证报告。当工艺的某一部分有较大变动时（如大修、工艺条件变化），要进行重新验证，即再验证．再验证是针对某一部分的行动，而不是整个工艺过程的验证．因此比较简单、快速、易行。验证的实施过程包括以下步骤：提出验证要求，组织验证小组，制定验证方案，实施验证试验，写出验证报告，再验证等。
现以生物制药纯化最常用的层析工艺为例，说明验证试验的过程。首先对层析设备进行安装验证，即在不通电源的情况下，根具设备说明书查看安装是否正确，并对接线、管路连接、安放地点、输人电压等逐项检查，无误后，再进行运转试验．接通电源后，观察电机、泵、监测器、信号系统、阀、压力、温度等是否正常．泵的输出流量要经过校正，监测波长也要校正，运转3-5次后，未见漏液、气泡等，一切正常，方可正式运转。层析柱是整个层析工艺的关键设备，要根据出厂标准，逐项验证，如载体外观、颗粒大小（用显微镜测量）、柱效率、分辨率、回收率、有无污染等．如更变层析柱或层析柱填料，要对新层析柱进行重新验证。总之，工艺验证是一项技术性很强，无固定章程可循，既费力，又耗时、耗材的工作．
高科技生物药物的生产工厂，已有“交钥匙工程”。所谓交钥匙工程，就是将整个工厂组装在高强度的，便于运输的钢制建筑结构内，整个建筑要达到洁净标准，所有的生产设备和公用设施都安装到位。在用户在场的情况下，要对整个工厂进行发货前的试运转及鉴定。然后，整个工厂的生产设备和公用设施直接运输到用户的厂址，在各车间组装后，与当地的水、电、下水道等系统及仓库对接，立即就可以投人生产。
五、生物药物生产的屏蔽防护技术
(Containment technology)
一些药物，如抗癌药，往往对生物活细胞具有毒性，因此必须对中试或大生产的全过程设置屏蔽防护装置．1984年，Flickinger等就提出了中试和生产规模细胞毒素剂的安全生产装置的设计概念，其基本要求是：人员进出口要加以控制；在工作场所保持负压（一级、二级或三级生物密封室）：空气的排放必须通过HEPA过胜器；对有烟雾产生的设备要有附加的屏蔽防护装置；有适当的个人防护措施；生产过程中所排放的废物要有生物学或化学的除污方法；对工作人员进行医疗监测；环境监测。
六、纯化工艺过程的质量控制
生物药物纯化工艺技术要求高，应尽可能选用高质量的设备，并要求有清洁的各级GMP厂房。纯化方法的设计应考虑到尽可能去除污染病毒、核酸、宿主细胞杂蛋白、糖及其他杂质；要防止纯化过程中带人有害物质．如采用柱层析技术纯化，应提供填料的质量认证证明(IS09001证书），并证实从柱上不会掉下有害物质。样品上样前应除热原质等。若用亲和层析技术（以单克隆抗体品作为配基），应有检测可能污染此类外源性物质的方法，不应含有可测出的异种免疫球蛋白，柱层析配制溶液用水一律用超纯水(Milli Q水）。
关于纯度的要求，可视产品的来源、用途和用法而制定，例如经反复多次使用的真核细胞表达的制品，要求纯度达到98％以上；多次使用的原核细胞表达的制品要达95％以上；外用制品的纯度可降低要求。用于健康人群或用于重症患者，对纯度要求各不相同．
纯化工艺的每一步均应测定纯度，计算提纯倍数收率等。纯化工艺过程中应尽量避免加人对人体有害的物质，若不得不加人，应设法除尽；并在最终产品中检测残留量，残留量应远远低于危害剂量，还要考虑到多次使用的积蓄作用。
附：基因工程α一型干扰素制备及质，控制要点
干扰素是一组多功能的细胞因子，分为干扰素α、干扰素β、和干扰素γ。干扰素α为多基因产物。分为许多亚型，都是由许多氨基酸残基组成的多肤。人干扰素γ是一种免疫干扰素，是由100多个氨基酸残基组成的多肽，天然产品是一种糖蛋白，两处有糖基化位点．
发酵后可用离心法或其他方法收集菌体，要求尽可能缩小操作的范围，凡接触过菌液的用具，如离心杯、转头和玻璃器皿等应浸泡新洁尔灭杀菌1h以上，才可清洗。离心后的废弃液经杀菌后才能倒人下水道。收获的菌种如在24h内破菌裂解，可放在4-80C,否则应冻存于_30'C以下的冰箱中，在一300C保存的菌体可使用6个月。将收获的菌体用适当的缓冲液做成所需浓度的均匀悬液，可用物理、化学或生物学方法进行裂解，裂解后的菌液，可用高速离心沉淀或其他适当方法分离，上清液即为粗制干扰素。不得用对人体有害的化学试剂裂解菌体，用加酶或其他蛋白裂解菌体时，应在半成品内证明此种蛋白的含量在允许的范围内，对制品安全及效果没有影响，并提供检测方法．
浓缩与纯化方法应能去除绝大部分非干扰素物质。一般要用不同原理多步骤的纯化方法，并使干扰素浓缩至一定程度，应详细说明浓缩纯化的全过程。在纯化过程中不得加人对人体有害的物质，加入的物质应能在以后的纯化过程中被去除或证明其浓度在允许的范围内，不得影响制品的安全与效果。如用异种抗体亲和层析纯化，应说明其来源及纯度，并提供此种抗体微量IgG的检测方法，在半成品检定中应测定IgG的含量，并确定允许浓度。制备注射用制品时浓缩纯化过程应特别注意去除热原质，并采取措施防止溶液、试剂和容器污染，而造成制品热原质增加。
浓缩纯化最后所得的纯化干扰素即为“半成品原液”，取样供作纯度检定后，立即加人人白蛋白，使其最终含量为2％，称为加“白蛋白半成品”，取样测定干扰素效价，保存在一300C,应尽量避免冻融，直到制剂配制时才取出融化、合并、离心、除菌过滤、制备成品，“加白蛋白半成品”在一300C下保存不得超过半年。
制剂配制：除菌过滤采用0.3μm薄膜，过滤后样品应做无菌试验，并取样测定干扰素效价，根据除菌样品的效价测定结果，将让述无菌试验合格的“加白蛋白半成品”用无菌的2 %白蛋白缓冲液稀释至所需浓度，不得加防腐剂，稀释后的“加白蛋白半成品”需做热原测定、效价测定和无菌试验。
冷冻干燥：冻干工艺应不损害干扰素的活性，并使冻干后制品的水分达到一定的标准。
基因工程干扰素分注射用和外用两种．其质量标准不同，应分别予以规定。每种制品又分为半成品和成品检定．
2. 超滤离心管怎么使用
蛋白浓缩和换Buffer通常使用的超滤管，常用Millipore的Amicon-Ultra-15超滤管（MWCO10kD）。也有其它型号的、不同体积大小和MWCO超滤管可选，视目的蛋白的分子量与浓缩前体积、浓缩目标体积而定。可重复使用。
1、选择合适的超滤管，主要考虑MWCO和浓缩体积，通常应截留分子量不应大于目的蛋白分子量的1/3，比如目的蛋白分子量为35kDa，就可以选择10kDa截留分子量的超滤管。若目的蛋白分子量为10kD左右，则可以用截留分子量3kD的超滤管。
2、新买来的超滤是干燥的，使用前加入MilliQ水，水量完全过膜，冰浴或冰箱里预冷几分钟。然后将水倒出，即可加入蛋白液，加入的多少，以不超过管顶的白线为准。操作要轻，加入蛋白液前，超滤管需要插在冰上预冷。
3、平衡。质量和重心二者都要达到平衡。注意转速和加速度不可太快，否则直接损坏超滤膜。开始离心超滤（离心机预冷至4度）。膜与转轴的方向根据说明书调整（角转离心机的情况是膜与轴垂直）。在实际使用中，一般转速开的比说明书里的要低，这样可以延长离心管的使用寿命。
4、当浓缩到剩下1ml时，【取50ul国产Bradford溶液，加入10ul流穿，看有没变蓝色，以此判断超滤管是否漏掉蛋白。如果管漏了，将上层和流穿重新倒入新管中开始超滤。要精确判断是否漏管，用5mg/ml的BSA离心10min，再取流穿，跑蛋白胶或Bradford粗测】，继续加入剩下的蛋白液浓缩（在冰上操作，防止蛋白受热），直到所有浓缩液都加完为止。离心过程中注意是否发生蛋白沉淀，导致堵管。若发生沉淀，要确定沉淀的具体原因，是蛋白浓度过高还是Buffer不合适；前者可用多根超滤管同时超滤，降低浓度的办法解决，后者的方法是换不同的Buffer，直到蛋白不发生沉淀为止。
5、前面几步用以浓缩蛋白，如果要换Buffer，在总蛋白液浓缩至1ml左右的时候，轻轻加入新的Buffer（经0.22um超滤膜超滤），再浓缩至1ml左右，连续三次，最后一次的浓缩终体积根据需要的蛋白浓度而定，一般不多于500ul，也有浓缩至200ul以内的情况。按照每次至少10倍左右的体积浓缩算，三次达到1000倍以上，基本上可以达到换buffer的目的。
6、取出最终蛋白浓缩液的操作在冰上操作，用黄枪头（200ul）取，轻轻顺着边缘插入枪头，轻轻吹打、混匀蛋白液，注意不要碰到超滤膜，然后吸取浓缩液，每次吸接近200ul，直到吸完。管底剩下的最后一点浓缩液不必吸取，否则难度太大，有可能损坏超滤膜。最后加入MilliQ水到超滤管中，没过超滤膜，防止膜失水变干。
7、以下是处理超滤管，重复利用超滤管的步骤。
8、倒出超滤管里的水，用milliQ水轻轻润洗几次，【若管底有可见的蛋白沉淀，可以先加入水，然后用枪头吹打，注意不要碰到膜，吹打至沉淀悬起，然后倒掉，不可用自来水猛冲】然后加入0.2M的NaOH溶液，室温放置20min，期间平衡超滤管。再离心10min。倒出残留的NaOH溶液，将管芯浸入MilliQ水的烧杯(1或2L)中,放置几个小时,再换新的水,放置几个小时，不断稀释NaOH浓度。50ml管和盖子用自来水洗，内壁再用MilliQ水洗干净。
9、取出浸没的管芯，加至接近满的MilliQ水，50ml管也加满MilliQ水，将管芯慢慢放入50ml
离心管，排出部分水，然后盖上盖子，放4度保存，直到下次使用。一般来说，按照上述步骤和注意事项，每根管用三四年不会坏。
3. N-TIMS法测定
仪器设备及器皿
热电离质谱仪 MAT262、TRITON等相当类型，配备有负离子进样装置，及点焊机、超净台等质谱计配套设备。Re和Os同位素测定均采用单带源。
可控电热板连续可调，数码显示电热板表面温度
Teflon蒸发皿 100mL。用于蒸发含Os的HBr溶液。
Teflon尖底瓶 5mL。用于Os的微蒸馏。
微蒸馏器的Teflon尖底瓶清洗 先用酒精棉擦洗其内部，再用超纯水冲洗干净。加入5mL超纯HNO3，盖上盖子，在烘箱中～120℃加热24h。取出，打开盖子，弃去HNO3，用超纯水清洗干净。再加入分析纯HBr，盖上盖子，在烘箱中～120℃加热24h。取出，打开盖子，弃去HBr，用超纯水清洗干净。加入5mL超纯HNO3，盖上盖子。在烘箱中～120℃加热24h。取出，打开盖子，弃去HNO3，用超纯水清洗干净。敞开盖子，放置在搪瓷盘上，在烘箱～120℃加热烘烤24h。再加入0.5mL超纯HNO3，密闭。烘箱中～120℃加热2h，冷却后，用4.5mL超纯水稀释，用ICP-MS检测尖底瓶中的溶液是否还有残存的Os。如果还残存有Os，则重复上面的清洗流程。
其他装置、器皿及其清洗同86.5.3.1。
试剂和材料
微蒸馏用氧化剂溶液w(CrO3)=100g/L，c(H2SO4)=9mol/L，加热蒸馏90min，以除去可能存在的痕量Os。
超纯HBr分析纯HBr经石英蒸馏器两次蒸馏，为了保证HBr的纯度和浓度，每次蒸馏舍去开始的蒸出部分，并在蒸馏液剩下1/10时停止蒸馏。最后再用双瓶亚沸蒸馏一次。纯化后c(HBr)=8.2mol/L。
助发射剂Ba(OH)2饱和溶液称取4.0g分析纯Ba(OH)2·8H2O于60mLTeflon试剂瓶内。约90℃热水浴中加热30min，自然冷却过夜，可得到Ba(OH)2饱和溶液。在试剂瓶下部可看到Ba(OH)2·8H2O针状结晶，溶液表面漂浮有白色Ba(CO3)2。用滴管取中间部分溶液到1.5mLTeflon离心管中，备点带时使用。用Parafilm膜密封Ba(OH)2饱和溶液，防止空气中的CO2与Ba(OH)2生成Ba(CO3)2沉淀。Ba的存在显著降低了铂灯丝的电功函，提高了试样离子的产出率。
助发射剂Ba(NO3)2溶液由分析纯Ba(OH)2、优级纯NaOH和超纯HNO3配制而成。Ba4g/L、Na1g/L、HNO31mol/L。
阴离子交换树脂BioradAG-1X874～38μm(200～400目)，Cl-型。使用前用超纯水清洗，除去阴离子树脂中的漂浮物。然后将阴离子树脂装入内径约3mm的玻璃交换柱中，柱床高2cm，下垫玻璃纤维。用5mL8mol/LHNO3清洗Re，并用水洗至中性，再用2mL0.8mol/LHNO3平衡。采用N-TIMS测量Re时，必须用小阴离子交换柱对已分离出来的Re溶液作进一步纯化。
其他试剂同86.5.3.1。
高纯铂带纯度w(Pt)=99.999%。美国H.Cross公司产品规格为0.7mm×0.025mm，美国ESPI公司产品规格为0.5mm×0.02mm。铂电离带在使用前必须经过处理，不然Os本底会高达几十pg以上，Re本底高于几百pg。Pt带的处理流程为:用丙酮浸泡铂带，超声洗涤30min，以除去铂带上少量的Re。将铂带插件置于超净台中的点样装置上，在洁净的大气中匀速升高电流使其烧红直至发光，此时通过铂带的电流约为2.5A，持续10min后迅速降下电流。这一步可以将铂带上的微量Os烧掉。在空气中烧过的铂带必须在干燥器中放置半天后方可点样，这样试样在铂带上的分布集中而不会散开。一定要小心用保鲜膜包好放带的盒子，防止再被污染。经过上面3步处理过的Pt带的Os本底可降至1pg以下。
试样制备
样品采集和加工、Re-Os含量粗测、取样量和稀释剂的加入、试样分解、锇的蒸馏分离和铼的萃取分离步骤同86.5.3.1ICP-MS法测定。对于N-TIMS测定，需要进一步进行锇的微蒸馏纯化和铼的离子交换纯化。
1)微蒸馏纯化Os。为了进行NTIMS测定，还必须对Os的水吸收液作进一步微蒸馏纯化(图86.3)。将Os的蒸馏溶液加入等体积超纯HBr，在烘箱中于80℃保温4h。将溶液转入100mLTeflon蒸发皿内，蒸馏到小体积(约30μL)，用微量取样管的塑料吸头吸取浓缩液转移至Teflon尖底瓶盖中央，缓慢蒸发至干。用微量取样管吸取10μL8mol/LHBr置于Teflon尖底瓶的尖底上，将40μL配制好的微蒸馏用氧化剂溶液［w(CrO3)=100g/L，c(H2SO4)=9mol/L］加到Teflon尖底瓶盖上含Os的残渣上。迅速将已装有10μL8mol/LHBr的Teflon尖底瓶的底部倒扣在已装好试样和氧化剂溶液的盖上，尽快旋紧密封，塑料瓶底部和周围用铝箔包围，顶上不包铝箔。将倒置的尖底瓶平移至电热板上，于60～80℃加热3.5～4h。残渣中的锇被氧化成OsO4进入气相，达到小瓶的尖顶上被HBr重新还原为六溴锇酸。微蒸馏完成以后，将盖子上的氧化剂用Milli-Q水洗去，磕掉上面的水，将微蒸馏器正立放置，拧紧盖子，过夜，在80℃下保温4h，然后将尖底中的HBr溶液蒸干备点带用。
2)阴离子交换纯化Re。将用于ICP-MS测定Re的溶液蒸发至近干，用3mL0.8mol/LHNO3中和溶解残渣。转移该溶液到已用0.8mol/LHNO3平衡的阴离子交换柱上。依次用3mL0.8mol/LHNO3、3mL1mol/LHCl和1mL水洗去杂质。最后用3mL4mol/LHNO3洗脱Re于10mL比色管中，并观察是否有穿漏的树脂颗粒。用滴管移取无树脂颗粒的清液到7mLTeflon圆底小瓶中，在电热板上加热近干。反复加水和加热近干数次，以降低酸度。如果HNO3浓度过高，点带时溶液发散，不利于质谱测定。根据Re含量高低保留体积为数十微升，备N-TIMS测定Re同位素比值。对于低含量Re的试样最好每次重新装柱。
N-TIMS同位素比值测定
Re和Os质谱测量均采用单带源和输氧技术。待真空度达到1×10-7hPa时，开始输入氧气，使试样中Re和Os充分氧化。当氧气气压稳定在5×10-7hPa水平时，方可开始加热灯丝。OsO3-的发射温度约为890℃，ReO-4要低一些。
Os同位素比值测量
为了获得足够强而稳定的OsO-3信号，要正确地把试样点在Pt带上:在点样前加入10μLHBr到已完成微蒸馏的尖底瓶的尖底部分，置烘箱中于60～80℃加热15min。冷却后即可点样。点样时不要将微蒸馏器壁上的溶渣混合到尖底处溶液中。用微量移液器将试样的HBr溶液小心地点在铂带上(每次取0.2μL)，以0.6A电流蒸干。当微蒸馏器中含OsHBr溶液全部转移完全蒸干后，缓慢升高电流至1.2A，持续1min赶尽多余的HBr，随后降下电流(蒸干即可，不要升电流，不要发红)。
加发射剂。取5～7μLBa(OH)2饱和溶液作为发射剂滴在试样上，以0.6A电流蒸干，可看到乳白色的沉淀覆盖在Pt带上。随后缓慢升高电流至乳白色沉淀开始熔化成像冰一样的状态，而后降低电流。
图86.3 微蒸馏示意
测量过程。在测量时，电离带升温速度的选择是能否成功测量Os的又一重要因素。如升温速度太快，会明显降低Os的阴离子产生效率，甚至不产生OsO3-负离子。具体升温步骤(以美国H.Cross公司出品，规格为0.7mm×0.025mm的Pt带为例)为:首先以100mA/min的速率自动增加电离带电流，直到1900mA为止。然后以8～10mA/min的速率继续缓慢升高电流，同时用离子计数器监测(190Os16O3)-离子(质量数238)。当出现几十个计数时，停止升高电流，持续数分钟后离子流强度会自然稳步上升。当上升速度明显变慢时，离子流强度一般已达到预期的大小，开始测量质量232、234、235、236、237、238、240。如果信号不够大，则继续缓慢地升高电流，直到获得稳定的足够强的离子流。在升温的过程中，必须注意信号的变化，根据实际情况调整电流增加的速度和强度。如果信号开始衰减，则表明电离带的温度已经超过Os发射的最佳温度了。
Re同位素比值的质谱测量
ReO4-的发射温度相对OsO3-要低一些，Re同位素比值较容易测量。把经阴离子交换纯化后的含Re溶液用微量移液器小心地点在铂带上。按上面Os的方法点样、加发射剂和测量。测量Re采用3μLBa(NO3)2溶液(Ba4g/L、Na1g/L、HNO31mol/L)作为发射剂。
质量分馏效应和同位素干扰校正
1)质量分馏效应校正。TIMS法质谱测定同位素组成时，由于轻同位素的优先蒸发和电离也不可避免地发生质量分馏，从而导致测量值偏离实际同位素比值。为了得到准确的同位素比值，必须对测量值进行质量分馏校正，对于普Os用240/236值作为标准化值，240/236值为3.092203。按指数规律对其他同位素比值进行校正。Triton和MAT262均可对普Os进行在线分馏校正。对于加有稀释剂的情况，可首先对OsO3-进行脱氧计算，在Os的正离子状态下以192Os/188Os(未加稀释剂时192Os/188Os=3.0827)作为标准化值进行质量分馏校正的迭代计算(杨刚，2005)。N-TIMS的质量分馏一般小于0.1%，大大好于ICP-MS(1%～2%)。为了标定稀释剂，曾经用普Os和190Os稀释剂以不同比例混合得到3种不同比值的Os同位素的溶液。分别测定了同位素比值并进行了计算。结果表明，在238质量信号强度在200mV以上，进行分馏校正与不进行分馏校正相比仅相差0.012%;如果信号强度只有几十mV，二者的差别可有0.1%～0.2%。
在实际测量中，Re同位素呈现出明显的同位素分镏效应，因此必须对测量结果进行同位素分镏校正。本实验室曾经在4年间隔中采用Mat-262N-TIMS对天然Re标准的187/185进行数十次测量，计算得出Re同位素比值分镏系数约为(1.002±0.001)。因此在测定加有稀释剂的Re同位素比值时需以普通Re为同位素比值标准，用外标法进行同位素比值校正。
Suzuki(2004)采用全蒸发方法N-TIMS测定Re同位素比值，其基本原理就是接收所有Re的信号，利用所有249和251峰的强度总和相比得到185/187的比值。也就是在数据采集过程中是采集数据的强度而不是瞬时比值，最后用强度的总和相除得到最后的比值。从理论上讲，全蒸发方法避免了轻同位素的优先蒸发和电离造成的同位素比值的变化，消除了Re的质量分馏问题。与常规方法比较，该法优点是准确度高、需要试样量少、测量时间短(一般10～15min测一个试样)。可以准确测定稀释法中Re同位素比值。
2)同位素干扰校正。采用逐级剥谱法进行氧同位素校正。铼和氧同位素结合的多原子负离子形式有ReO3-和ReO4-两种，以ReO4-为主。锇和氧同位素结合的离子形式有OsO3-和OsO4-两种，以OsO3-为主。氧有3种同位素，它们与Re、Os排列组合形成多种不同质量的多原子负离子。
在氧的3种同位素中，16O同位素丰度最高，3个16O与各种锇同位素结合，形成了N-TIMS测定Re、Os同位素的主质量峰。7个Os同位素(184、186、187、189、190、192)分别与3个16O结合形成的几个主质量峰的质量分别为232、234、235、236、237、238、240。自然氧同位素的丰度在附录86.5D的表86.23中。
按照等概率模型计算了Os同位素与不同组合的3个氧同位素结合所出现的概率见表86.6。
表86.6 根据等概率模型在OsO-3与ReO-4中各种氧同位素组合出现的概率
注:Δm为OsO-3、ReO-4与主质量峰的差值。
OsO-3与主质量峰差值(Δm)为0时，即1个Os同位素与3个16O结合构成的主质量峰出现的概率为0.992879(3个自然16O同位素丰度的乘积);低质量锇同位素和不同比例的16O、17O、18O结合，使OsO-3质量数增加，并叠加在高质量锇同位素的主质量峰上。
OsO-3与主质量峰差值(Δm)为1时，即1个Os同位素与2个16O和1个17O结合构成的质量峰出现的概率为0.001132(3×16O同位素丰度×16O同位素丰度×17O同位素丰度)。
OsO3-与主质量峰差值(Δm)为2时，出现的概率为0.005973，即3×16O同位素丰度×16O同位素丰度×18O同位素丰度+3×16O同位素丰度×17O同位素丰度×17O同位素丰度)。
Δm在3以上干扰峰出现的概率很低(见表86.6)，一般可忽略。在Os同位素谱图中只有184Os16O16O16O-(质量232)质谱峰不受其他同位素的影响。为了消除各种次峰对主质量峰的干扰，可采用逐级剥谱法进行氧同位素的校正。首先根据表86.6扣除184Os与不同氧同位素结合对186Os等其他高质量锇同位素主质量峰的贡献，然后再根据修正后的186Os峰值按表86.6扣除它对187Os等其他高质量锇同位素主质量的贡献。依此类推，从低质量到高质量逐级剥除所有低质量Os同位素与不同氧同位素结合对高质量锇同位素主质量峰的贡献。采用Excel表可方便地扣除干扰，得到修正氧同位素干扰后的锇同位素比值。
Re的两个同位素(187、185)分别与4个16O结合形成N-TIMS测定时的两个主质量峰249和251。同样可按照等概率模型计算Re同位素与不同组合的4个O同位素结合所出现的概率。
ReO4-与主质量峰差值(Δm)为0时，即1个Re同位素与4个16O结合构成的主质量峰出现的概率为0.990516(4个自然16O同位素丰度的乘积)。
ReO4-与主质量峰差值(Δm)为2时，即1个Re同位素与2个16O和2个17O结合构成的质量峰+1个Re同位素与3个16O和1个18O结合构成的质量峰出现的概率为0.007945(6×16O同位素丰度×16O同位素丰度×17O同位素丰度×17O同位素丰度+4×16O同位素丰度×16O同位素丰度×16O同位素丰度×18O同位素丰度)。
铼和锇的离子电离电位不同，铼的离子电离电位较低，因而Os的存在不会影响Re的测量，少量187Re16O16O16O-(235)的存在会影响187Os16O16O16O-(235)的准确测定，这一干扰可以利用185Re16O16O16O-(233)的峰强度通过计算消除。