『壹』 细菌油脂
微生物功能性油脂的研究
董欣荣 曹 健
摘要 从影响微生物油脂合成的重要因素、微生物油脂的制备、微生物油脂的定性分析、产品的理化指标和质量指标及利用微生物生产功能性油脂等几个方面，对国内外微生物功能性油脂的研究进行了综述。
关键词 微生物；功能性油脂；制取
分类号 TS218.01
FUNCTIONAL FATS AND OILS FROM MICROORGANISMS
Dong Xinrong Cao Jian
(Bioengineering department,Zhengzhou Grain College,Zhengzhou 450052)
Abstract This paper gives a general review of the prod uction of fats and oils from microorganisms,the important factors that work ri ng the process,qualitative analysis,physical and chemical properties and quality properties of the procts as well as the microorganism is applied to make the functional oils and fats at home and abroad.The proction of functional fats an d oils from microorganisms are also investigated.
Key words microorganism;functional fats and oils;proction
0 前言
微生物油脂一般又称单细胞油脂，很多微生物如细菌、霉菌、酵母菌及藻类等在一定条件下，可在菌体内产生大量油脂，有的干基菌体含油高达70%以上，而且这些油脂与一般植物油脂有类似的脂肪酸组成(见表1)〔1〕。微生物油脂的研究始于第一次世界大战期间，德国为了解决当时的油源匮乏而利用产脂内孢霉生产油脂，之后美国也开始着手微生物油脂的生产，但没有实现工业化。直至第二次世界大战前夕，德国科学家筛选到了适于深层培养的菌株，开始在德国工业化生产微生物食用油。
表1 部分微生物油脂的脂肪酸组成
菌株 12∶0 14∶0 1 6∶0 16∶1 18∶0 18∶1 18∶2 18∶3 其它
假丝酵母(Candidal0) - tr 32 - 15 44 8 -
隐球酵母
(Cryptococcus terricolus) - tr 36 1 14 36 8 tr
红酵母
(Rhdotorula glatiuis) - - 18 1 6 60 12 2 24∶0 1%
Rhythium irregulare 1 6 26 15 5 26 5 6a 20∶0 7%
产脂内孢霉 - 2 25 70 17 47 5 1
麦角菌霉 - tr 23 6 2 19 8 - 18∶1-OH 42%
串珠镰孢 - 1 14 - 11 30 42 1
米黑毛霉 - 1 20 4 6 48 16 5a
少根根霉 tr 1 18 4 11 29 16 tra
淀粉核衣藻 - - 30.7 2.6 0.8 4.1 35.3 7.5b 16∶2 16.2%
16∶3 2.7%
高山被孢霉
Ovder Mucorales b b b b b b 15 0
20∶3 3%
20∶4 30%
20∶5 15%
说明：a——γ—亚麻酸；b——未知；tr——痕量；br——支链酸；-— —OH羧基酸
与动植物油的生产相比，微生物油脂的生产有许多优点：1、微生物适应性强，繁殖速度快 ，生产周期短；2、微生物生长所需的原料丰富多样，特别是可以利用农副产品、食品工业及造纸业中产生的废弃物，如亚硫酸纸浆、木材糖化液、废糖液、制造淀粉产生的废料废液等，同时还保护了环境；3、微生物方法生产油脂可节约劳动力，同时不受场地、气候、季节的影响，一年四季可连续生产；4、利用不同的菌种和培养基产品构成变化较大的特点，尤其适合于开发一些功能性油脂。如富含油酸、γ—亚麻酸、花生四烯酸、EPA、DHA、角鲨烯、二元羧酸等的油脂以及代可可脂。此外，由于人口的增长使得油脂需求量与自然资源严重短缺的矛盾日益尖锐，开辟新油源—微生物油脂更具有重要的现实意义〔2、3〕 。
目前利用微生物生产油脂的技术可行性已不存在太大问题，主要还是经济可行性。微生物生 产油脂受多种因素影响，而且生产油脂的菌种有限，只有那些干基菌体含油率高，油脂转化率也较高的微生物才有可利用的价值。目前筛选的微生物干基菌体含油率一般为30%～60%，少数为70%～80%。油脂转化率一般为15%，个别菌种达20%～25%。因此，一般的微生物油脂经济价值还无法与植物油相抗衡，对微生物油脂的研究主要集中在利用微生物生产经济价值高的特殊营养油脂、特殊工业用途油脂。这类油脂的主要营养成分在天然动植物油脂中存在量很少，甚至不存在，但具有较大的生理功能和特殊用途，因而我们统称为微生物功能性油脂。目前通过微生物油脂分提制取可可脂、采用酵母发酵生产代可可脂都已在日本得以实现，以霉菌生产的γ—亚麻酸油脂已在日、英问世，生产富含花生四烯酸、二十碳五烯酸、二十二碳六烯酸、中碳酸及蓖麻酸油脂的真菌、藻类菌种也已找到〔1，6，21〕。微生物功能 性油脂作为动植物油脂的必要补充在促进人类健康方面正起着越来越重要的作用，所以对微 生物功能性油脂的研究具有极其重大的意义。
1 影响微生物油脂合成的重要因素
1.1 培养基的C/N比
油脂的生成由细胞油脂含量与细胞收获量的乘积决定。微生物生产油脂的 过程可分为两阶段：细胞增殖阶段和产油阶段。这两个阶段所用培养基的C/N比不同，细胞增殖期要 求氮素营养相对偏高以获取足量菌体细胞；产油期则是在获取足量菌体细胞后，增加碳素营养物 质，为菌体大量积油创造条件〔9〕。
1.2 pH值
产生油脂的最适pH值依微生物种类而不同，酵母为3.5～6.0，霉菌为中 性至偏碱性。构巢曲霉在pH2．8～7.4培养时，随pH值上升，油酸含量增加。而培养油脂 酵母的增养基最初pH值越接近中性，稳定期细胞油脂含量越高〔7〕。
1.3 无机盐和微量元素
一般地对于真菌，适当增加无机盐和微量元素的使用量，可提高产油速度 及产油量。Carrid等人对构巢曲霉的研究表明，调整Na＋、Mg2＋、SO42－ 、PO43－等离子的含量比，可使油脂含量由25%～26%(生成率6.7～7.9)提高到51 %(生成率17.2)。一项有关油脂酵母产油的实验证明，在培养基中增加铁离子浓度可加快油 脂合成，而增加锌离子浓度(有些菌株要求维生素B)可提高积累量。
1.4 温度
油脂生成的最适温度大多在25℃左右。温度可影响油脂的组成、含量，培 养温度低时不饱和脂肪酸含量将增加。
1.5 培养时间
培养时间对油脂的合成也很重要。如黑曲霉、米曲霉、根霉、红酵母、酿 酒酵母 最佳培养时间分别为3d、7d、7d、5d、6d。培养时间不足，微生物菌体总数达不到最 大量而影响油脂量；培养时间过长，微生物个体变形、自溶，形成的油脂进入培养基中难以 收集，同样影响油脂产量。
1.6 孢子数量
菌体生长期孢子数量过多，单细胞油脂产量反而可能低。细胞内积存的油 脂过多，又会使菌体失去增殖能力。因此培养产油菌时应使之达到最佳孢子数量，以保持菌 体的增殖能力和产油生理状态。
1.7 氧气供给量
微生物利用基质糖类合成油脂及不饱和脂肪酸都需要氧气参与，因此必须供应充足的氧气。
1.8 添加
添加脂肪酸合成的中间物或能形成中间物的二碳化合物如乙醇、乙酸盐、乙醛等可增加油脂含量。
2 微生物油脂的制备
2.1 菌株的选择
用于生产微生物油脂的菌株要求具备以下条件：
(1)具备或改良后具备合成油脂的能力，油脂积累量大，含油量稳定在50%以上且油 脂转化率不低于15%。
(2)能利用农副产品及工业废水、废料。
(3)繁殖力旺盛，杂菌污染困难，沉淀、过滤、分离油脂容易。
(4)油脂风味良好，食用无害，易消化吸收。
(5)用于工业化生产时能适应工业化深层培养，装置简单〔4，5〕。此 外菌种不同，培养条件不同，产品也不同。一些菌株油脂的脂肪酸组成、类型及甘三酯组成 见表1和表2。
表2 微生物油脂的立体专一分析
油脂 Sn 14∶0 16∶0 16∶1 17∶0 17∶1 18∶0 18∶1 18∶2 19tr 20∶0 22∶0 24∶0 24∶1
Mycobacterium 1 1 8 9 tr 2 7 60 - 7 1 1 1 1
snegmatis 2 7 57 13 2 1 6 9 - 1 tr tr 1 tr
3 1 7 7 tr tr 16 18 - 6 7 7 18 7
(油脂酵母) 1 3 14 8 - - 4 61 10 10 - - - -
Lipomyces 2 - 1 2 - - - 88 9 - - - - -
lipoferus 3 6 29 13 - - 9 37 6 - - -
- -
2.2 培养基
需配制的培养基有斜面培养基、种子液培养基、基础摇瓶培养基、发酵培养基等。斜面培养基是培养该菌种的普通培养基；种子培养基与基础培养基成分变化不大 ，主要是为了稳定菌种的性状；发酵培养基要使碳源比重增加，氮源比重下降，同时增加通气量，使菌体充分合成油脂〔28，29〕。
配制时所用的碳源有乳糖、葡萄糖、果糖、蔗糖、石蜡、废糖蜜、纸浆工业废水、木材水解 液、淀粉厂废水等；氮源有铵盐、尿素、硝酸盐、氨基酸、酵母水、玉米浆等；无机盐类有KH2 PO4、MgSO4、CaCl2等；生长素有酵母膏、蛋白胨等；如果要诱变改良菌种，还需配制诱变培养基，所用的诱变剂有亚硝基胍、N—甲基—N—亚硝基胍、硫酸二乙酯、紫外线、激光、离子束等。
2.3 培养方法
2.3.1 菌种的活化
将保存的菌种转接到斜面培养基上，28 ℃培养4 d。
2.3.2 种子液的制备
活化菌种以少量无菌水洗，入装有种子液培养基的三角瓶中，24～30 ℃ ， 转速150～300 r/min，培养2～5 d。培养温度、时间、摇瓶速度依菌种的类型和数 量而定，通常种子液培养基装液量为三角瓶的1/5。
2.3.3 摇瓶培养
采用与(2)同样容积的三角瓶，内装1/5容积的种子液培养基，接入种子液 2～3 mL，温度、转速同(2)，培养时间比(2)延长1～2 d。
2.3.4 大罐发酵
装液量为灌体的2/3，接种5%，罐压0.5 kg/cm2，搅拌速度提高至原来的2倍，罐温与上述温度相同。有时为了逐渐诱导产脂，可采用三级发酵的方法，使培养 基营养的供给趋向于碳源逐渐升高，氮源逐渐减少，通气量加大，pH值也逐渐接近微生物合 成油脂的最适值。
2.4 菌体的收集
培养好的菌体经镜检后，以滤布(纱布、的确凉布)过滤，用蒸馏水洗三次 ，称湿重，取部分湿菌体60 ℃烘干，称干重，以确定湿菌体的含水率。收集大量菌体时则 采用离心法。
2.5 提油前菌体的前处理及菌体油脂的提取
微生物油脂存在于坚韧的细胞壁中，且部分以脂蛋白、脂多糖的形式存在 ，因此提油前必须对菌体进行前处理。前处理的方法主要有四种：(1)干菌体磨碎法(将菌体 与砂子一起进行研磨)；(2)干菌体、稀盐酸共煮法(共煮使细胞分解便于获油)；(3)菌种自 溶法(50 ℃下保温2～3 d)；(4)菌体蛋白变性法(用乙醇或丙醇使结合蛋白变性)〔10〕 。另外还有利用高压匀浆、球磨、膨化、高渗透压等处理使菌体破裂的办法。
用于油脂浸提的有机溶剂主要有乙醚、异丙醚、氯仿、乙醚—乙醇、石油醚、氯仿—甲醇等 ，浸提后再通过减压蒸馏等手段回收溶剂。
3 微生物油脂定性分析
经苏丹黑染色法染色后，菌体中的脂肪粒呈现蓝紫色或蓝灰色，而菌体 为红色。根据脂肪粒大小可初步判断脂肪含量的多少，还可用于确定最佳产油时间〔5〕。
4 微生物油脂各项理化指标与质量指标的测定
采用AOCS方法，分析指标主要包括以下几方面：(1)折光指数；(2) 比重； (3)透明度；(4)气味、滋味；(5)水分；(6)酸价；(7)过氧化值；(8)碘价；(9)色泽；(10)2 80℃实验；(11)脂肪酸组成；(12)甘三酯组成；(13)不皂化物。
5 利用微生物制取功能性油脂
通过细胞融合、细胞诱变等手段，可使微生物生产出比动植物油脂 更符合人体需要的高营养油脂或某些特定脂肪酸组成的油脂〔27〕。现分述如下：
5.1 油酸、亚油酸
亚油酸是一种人体必需脂肪酸，通过人体的△6脱氢酶作用可以转 变成 人体所需的γ—亚麻酸。尽管这类油脂在植物中存在较为普遍，但亚油酸含量达到70%以上 的只有红花油、葵花油。据报道利用纤维素作碳源来培养丝状菌马铃薯黑痣病薄膜霉 ，所产 生的油脂亚油酸含量高达71.8%～76.3%〔11〕。国外资料报道有利用产脂内孢霉 工业化生产富含油酸、亚油酸的油脂。微生物油脂中油酸、亚油酸常常同时存在，二者可占 总脂量的65%～78%，这一点与许多植物油脂非常相似，此外熔点、折射率、比重、酸价、过 氧化值、皂化值、碘值等物理化学特性的分析结果，也与植物油接近〔9〕。
一份关于38株假丝酵母的全细胞脂肪酸分析表明：这些酵母油酸含量达34%～69%，亚油酸含 量达5%～34%，而且有的菌株棕榈油酸含量达15.9%〔2，3〕。油脂酵母、红酵母、 掷孢酵母合成的油脂以油酸为主要成份，脂肪酸组成与常用植物油中的橄榄油、菜籽油相近 〔2，13〕。
5.2 γ—亚麻酸(GLA)
GLA天然存在量很少，只有在乳脂和特殊野生植物种子中含量较高，人体 △6脱氢酶的存在及活力常受肥胖、癌症、 病毒感染、老龄等健康及营养因素的影响，阻碍摄入的亚油酸转变为GLA，使PG(前列 腺素)不能顺利合成，从而导致动脉硬化、血栓症、糖尿病等，故富含GLA的油脂是一类保健 性油脂〔14〕。
传统上，GLA主要从月见草种子油中提取，1948年Bernhard和Albercht首先从布拉克须霉的 菌丝体脂肪中鉴定出真菌CLA，含量达16%，Nugtern证明其结构与月见草种子油GLA相似。19 64年Show又发现藻状菌纲的菌株含有GLA，而不含α-亚麻酸。最近，日本Ona da Cement公司生物工程研究室的Morio Hiramo和东京农业与技术大学生物工程系的Yunki M iura等利用新鲜海水培养钝顶螺旋藻和一种小球藻(Chlorella sp.NKG4240)生产GLA， 其含量可达总脂肪酸的10%〔15〕。
在发酵生产GLA方面，1985年Osama Suzuki等利用深黄被孢霉、葡酒色被孢霉，拉曼被孢霉 和矮被孢霉以高 浓度葡萄糖(60～400 g/L)为碳源发酵培养，菌体油脂含量达35%～70%，其中GLA占3%～11% 。 1987年蓑岛良一等用雅致小克银汉霉发酵生产GLA，GLA含量达18%。英国使用爪哇镰刀菌， 以小麦淀粉生产的葡萄糖作为培养基进行发酵，产物经提纯达到食用标准，γ—甘油三亚麻 酸酯含量高达16%。利用发酵法生产γ—亚麻酸酯的John & Starge有限公司产量达100 t/a 〔4，26〕。1986年以来，英国Sslby factory of sturge Biochemicals、日本出光 化 学公司已有微生物GLA产品上市，主要用于医药、保健食品、功能性饮料和高级化妆品 〔11〕。
我国上海工业微生物研究所在500L发酵罐中用M102菌株发酵生产GLA，GLA含量达到8% 。1993年，南开大学生物系用深黄被孢霉As3.3410为出发菌株，经紫外诱变得变异株，在1 0L 罐中发酵产生GLA时，菌体得率为29.3%，油脂含量达44.7%，其中GLA含量达9.44%〔 12〕；1998年福建师范大学生物工程学院以深黄被孢霉As3.31410为出发菌株，经紫外 、硫酸二乙酯、亚硝基胍复合诱变处理后，进行了60m3罐三级发酵，菌体油脂含量高达79 .2%〔16〕。
5.3 花生四烯酸(AA)
AA传统上来自鱼油，但含量极低，一般小于0.2%(W/W)。AA与二十碳五烯 酸(EPA)是花生酸代谢的重要中间产物，它们在营养学、医学上的地位为世人瞩目，这主要 是 由于二十碳酸代谢产物PG、TX、LT具有调节脉管阻塞、血栓、伤口愈合、炎症及过敏等生理 功能〔1〕。1990年Buranova等发现几株被孢霉能聚集二十碳三烯酸(DGLA又称二高γ —亚麻酸)和AA，并且在一定条件下生产EPA。80年代以来，GLA、AA含量高的微生物油脂 相继在日本、英国、法国、新西兰等国投入工业化生产，日本、英国已有AA发酵产品投入市 场〔17〕。国内朱法科等以一株被孢霉为出发菌株，通过紫外诱变得到一株AA高产菌 ，AA得率达0.83g/L。研究还指出：培养不同时间的菌丝(3d～5d)在室温下老化15d，菌丝 体中总脂含量由18%～30%上升至36%～41%；菌丝体中AA含量则由1.1%～2.6%上升至2.6%～ 3.7%〔18〕。
5.4 二十碳五烯酸(EPA)和二十二碳六烯酸(DHA)
天然EPA、DHA通常在海洋动物和海洋浮游植物中含量丰富。EPA、DHA属于 ω—3多不饱和脂肪酸(PUFA)，其生理功能主要表现在：(1)预防和治疗动脉粥状硬化、血栓 形成及高血压。(2)治疗气喘、关节炎、周期性偏头痛、牛皮癣、肾炎。(3)治疗乳腺、前列 腺和结肠癌。目前ω—3PUFA的商业来源是海洋鱼及其油。鱼油中ω—3PUFA的构成与含量随 鱼种类、季节、地理位置等变化；为了提高其氧化稳定性，多数鱼油常常要经过氢化、调和 等步骤从而使EPA、DHA受到破坏。
1988年Shimizu等人提出高山被孢霉是生产EPA的一个潜在来源，在12℃的低温条件下生长时 ，可积累15%以上的EPA。Thraustochytrium aureum则是一种海生真菌，DHA含量达34%。许 多 海生藻可产高含EPA和DHA的油脂。金藻纲、黄藻纲、哇藻纲、红藻纲、褐藻纲、绿藻纲、绿 枝藻纲、 隐藻纲、Eustigmatoohyceae中的一些藻都高含EPA；甲藻纲的藻DHA含量高，而甲藻纲 中Amphidinium carteri的EPA和DHA含量都很高〔15〕。
培养基组成、通气、光强、温度、培养时间等对EPA、DHA等PUFA的合成、积累起着重要作用 ，氮源的数量影响饱和与不饱和脂肪酸的比例，光照不足将增加ω—6脂肪酸的合成和抑制 ω—3脂肪酸的合成，对数生长期末尾或在稳定期的开始时微生物PUFA的浓度达到最大。 此外使用基因工程选育菌种，有可能大大增加藻类、真菌产生EPA、DHA及其他PUFA的潜力， 而且藻油中的EPA比鱼油中有着更大的氧化稳定性，且没有鱼油的气味和滋味。
表3 可生产类可可脂的微生物
菌种 干菌体量
PC/g.L－1 脂质含
量/% 脂肪酸组成/% 1、3-二饱和、3不饱
和甘 油酯含量/%
16∶0 18∶0 18∶1
红冬孢酵母
(Rhodosporidium toruloi des） 12.8 59.8 25.0 12.7 46.4 47.9
红酵母(Rhodotorula glaminis) 8.0 35.8 29.8 11.8 35.5 32.8
产脂内孢霉 8.5 10.4 25.1 12.3 47.1 30.6
被孢霉(Mortierella vinacea ) 5.0 33.7 27.9 12.7 48.0
被孢霉(MM nana) 4.5 51.3 25.1 16.6 44.4
被孢霉(M.ramanianaver
anguispora) 3.2 13.4 28.1 16.6 40.8
5.5 长链二元酸
长链二元酸在工业上有广泛的用途，是生产聚合体、粉末涂料、可塑剂、 润滑油、香料、农药等的出发原料和中间体。C10以下的短链二元羧酸在自然界存在 广泛，合成较为容易，但C11以上的长键二元羧酸几乎没有天然存在的，合成也很 困难。很多微生物经发酵可得到C11～C18饱和及不饱和二元酸，这方面的应用 在日本最为广泛，且经使用效果良好。
5.6 角鲨烯
角鲨烯资源也非常短缺，主要存在于深海鲸鱼和鲨鱼肝油中，橄榄油和米 糠油中含量也较高。角鲨烯在油中具有抗氧化作用，但它全氧化后又成为助氧剂。其氢化物 是优良的化妆品基质和钟表等精密机械的润滑剂。以癸烷为碳源，利用深黄被孢霉发酵得到 的油脂，角鲨烯含量可达50mg/L。
5.7 代可可脂
可可脂是世界上最贵重的油脂之一，天然可可脂是以可可豆为原料经清洗 、去皮，水压法提取而得到的，其甘三酯组成为POS52%、SOS19%、POP6%。天然可可脂具有 风味良好、不易氧化且不被脂解酶分解、加工粘度适合、易于脱模等特性，成为制取巧克力 不可缺少的一种油脂成分。由于天然可可脂货源不足且价格昂贵，因此出现了多种多样的类 可可脂、代可可脂。利用微生物制取可可脂包含两方面的内容：(1)利用微生物酶作为催化 剂，催化油脂酯交换，达到可可脂要求的甘三酯组成，用这种方法可制得类可可脂。(2)培 养微生物菌株，使其在菌体内产生理化性质或甘三酯组成与可可脂接近的类可可脂和代可可 脂。
莫斯科工业研究所利用红酵母属、红冬孢酵母属、隐球酵母属菌株生产油脂 的一 项研究表明：Rhodotorula gracilis K-76及Rhodosporim sphaerocarpum L-103产生 的2 位为油酸的甘三脂产量很高，经分提得到的油脂理化性质近似于可可脂、橄榄油、棉籽油； 荷兰利用假丝酵母属、类酵母属、红酵母属 油脂酵母属等14个属的酵母变异种生产可可脂 及其代用品，以N-甲基-N-亚硝基胍诱变后得到高产菌种，经培养油脂含量达30%，且其中95 %的甘三酯具有P 37.6%、S 14.3%、O 37.5%的脂酸肪组成〔21〕；加拿大以脱 蛋白乳清为培养基培养酵母，通过添加所需晶型得到了甘三酯组成及含量与可可脂相似的类 可可脂，并且不经分提即可市售，产品均匀稳定〔22〕。
在利用微生物合成可可脂方面研究最多的是日本。在一项专利中，将乳酸杆菌、双歧杆菌菌 种接种到一种由油、脂、发酵的奶粉、糖类制成的混合物中，并按比例添加有全奶粉、蔗糖 、乳糖、磷脂、香料、柠檬酸及天然色素，在低于45℃的条件下发酵后，所得产品经感官检 验具酸乳酪味，可代替可可脂用于食品中〔23〕。
还有一项专利是将一种对苹婆酸及其衍生物敏感的假丝酵母进行摇瓶培养，培养后测得其甘 三酯组成中POP占18.6%、POS占39.0%、SOS占14.6%，可作为可可脂使用〔24〕 。另有一项专利使用被孢霉生产代可可脂，成效也非常显著〔25〕。
综上所述，微生物功能性油脂的研究是21世纪的发展方向，它将使油脂行业的范围更广 ，也将使微生物应用到更为广阔、重要的领域。
作者简介：董欣荣：女，1973年生，硕士研究生
作者单位：郑州粮食学院生物工程系，郑州 450052
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收稿日期 1999-06-25