『壹』 有没有人装过GE的凝胶过滤色谱柱
凝胶过滤色谱法：分辨率较高，但是上样量仅为柱体积的1%，而且对流速也有版严格的权限制。
离子交换色谱法：根据目的蛋白质表面所含有的氨基酸残基带有的净电荷分离蛋白质，但是分辨率没有凝胶过滤高。
亲和层析法：根据生物分子的特异性分离目的蛋白，特异性很高，但是配件容易丢失 适合含有特异性的标签的或者抗体。
疏水色谱：根据疏水性来分离蛋白质,缺点是有的蛋白质在高盐中溶解度降低，所以应用范围受到限制，适合蛋白质表面含有较多疏水性氨基酸残基的疏水性蛋白质。
『贰』 为什么凝胶过滤层析柱会漏水
凝胶过滤层析(gel filtration chromatography)
凝胶过滤层析法又称排阻层析或分子筛方法，主要是根据蛋白质的大小和形状，即蛋白质的质量进行分离和纯化。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，使蛋白质混合物中的物质按分子大小的不同进行分离。
也叫做分子排阻层析（molecular-exclusion chromatography）。一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。 一般是大分子先流出来，小分子后流出来。
凝胶过滤层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离物质的分子大小不同来进行分离。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下来速度慢，而大分子物质却被排除在外部，下来的速度快，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。对于高分子物质有很好的分离效果。
⒈凝胶的选择根据实验目的不同选择不同型号的凝胶。如果实验目的是将样品中的大分子物质和小分子物质分开，由于它们在分配系数上有显著差异，这种分离又称组别分离，一般可选用SephadexG-25和G-50，对于小肽和低分子量的物质（1000-5000）的脱盐可使用SephadexG-10，G-15及Bio-Gel-p-2或4.如果实验目的是将样品中一些分子量比较近似的物质进行分离，这种分离又叫分级分离。一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶，层析过程中这些物质都能不同程度地深入到凝胶内部，由于Kd不同，最后得到分离。
⒉柱的直径与长度根据经验，组别分离时，大多采用2-30cm长的层析柱，分级分离时，一般需要100cm左右长的层析柱，其直径在1-5cm范围内，小于1cm产生管壁效应，大于5cm则稀释现象严重。长度L与直径D的比值L/D一般宜在7-10之间，但对移动慢的物质宜在30-40之间。
⒊凝胶柱的制备凝胶型号选定后，将干胶颗粒悬浮于5-10倍量的蒸馏水或洗脱液中充分溶胀，溶胀之后将极细的小颗粒倾泻出去。自然溶胀费时较长，加热可使溶胀加速，即在沸水浴中将湿凝胶浆逐渐升温至近沸，1-2小时即可达到凝胶的充分胀溶。加热法既可节省时间又可消毒。
凝胶的装填：将层析柱与地面垂直固定在架子上，下端流出口用夹子夹紧，柱顶可安装一个带有搅拌装置的较大容器，柱内充满洗脱液，将凝胶调成较稀薄的浆头液盛于柱顶的容器中，然后在微微地搅拌下使凝胶下沉于柱内，这样凝胶粒水平上升，直到所需高度为止，拆除柱顶装置，用相应的滤纸片轻轻盖在凝胶床表面。稍放置一段时间，再开始流动平衡，流速应低于层析时所需的流速。在平衡过程中逐渐增加到层析的流速，千万不能超过最终流速。平衡凝胶床过夜，使用前要检查层析床是否均匀，有无“纹路”或气泡，或加一些有色物质来观察色带的移动，如带狭窄、均匀平整说明层析柱的性能良好，色带出现歪曲、散乱、变宽时必须重新装柱。
⒋加样和洗脱凝胶床经过平衡后，在床顶部留下数亳升洗脱液使凝胶床饱和，再用滴管加入样品。一般样品体积不大于凝胶总床体积的5％-10％。样品浓度与分配系数无关，故样品浓度可以提高，但分子量较大的物质，溶液的粘度将随浓度增加而增大，使分子运动受限，故样品与洗脱液的相对粘度不得超过1.5-2.样品加入后打开流出口，使样品渗入凝胶床内，当样品液面恰与凝胶床表面相平时，再加入数毫升洗脱液中洗管壁，使其全部进入凝胶床后，将层析床与洗脱液贮瓶及收集器相连，预先设计好流速，然后分部收集洗脱液，并对每一馏份做定性、定量测定。
⒌凝胶柱的重复使用、凝胶回收与保存一次装柱后可以反复使用，不必特殊处理，并不影响分离效果。为了防止凝胶染菌，可在一次层析后加入0.02％的叠氮钠，在下次层析前应将抑菌剂除去，以免干扰洗脱液的测定。
如果不再使用可将其回收，一般方法是将凝胶用水冲洗干净滤干，依次用70％、90％、95％乙醇脱水平衡至乙醇浓度达90％以上，滤干，再用乙醚洗去乙醇、滤干、干燥保存。湿态保存方法是凝胶浆中加入抑菌剂或水冲洗到中性，密封后高压灭菌保存。
⒍凝胶层析的应用
⑴脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6.柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25％-30％，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。
⑵用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。
⑶测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的的分子量。
⑷高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液
『叁』 凝胶过滤层析过程中流速的大小有什么影响
凝胶层析操作中应注意的一些具体问题.
(1)层析柱的选择
层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择.一般来讲,主要是层析柱的长度对分辨率影响较大,长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长,否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难.一般柱长度不超过100cm,为得到高分辨率,可以将柱子串联使用.层析柱的直径和长度比一般在1:25－1:100之间.用于分组分离的凝胶柱,如脱盐柱由于对分辨率要求较低,所以一般比较短.
(2)凝胶柱的鉴定
凝胶柱的填装情况将直接影响分离效果,关于填装的方法前面已有介绍,这里主要介绍对填装好的凝胶柱的鉴定.凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡.另外通常可以采用一种有色的物质,如蓝色葡聚糖-2000、血红蛋白等上柱,观察有色区带在柱中的洗脱行为以检测凝胶柱的均匀程度.如果色带狭窄、平整、均匀下降,则表明柱中的凝胶填装情况较好,可以使用；如果色带弥散、歪曲,则需重新装柱.另外值得一提的是,有时为了防止新凝胶柱对样品的吸附,可以用一些物质预先过柱,以消除吸附.
『肆』 影响凝胶过滤层析实验结果的因素有哪些
凝胶层析操作中应注意的一些具体问题.
(1)层析柱的选择
层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择.一般来讲,主要是层析柱的长度对分辨率影响较大,长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长,否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难.一般柱长度不超过100cm,为得到高分辨率,可以将柱子串联使用.层析柱的直径和长度比一般在1:25－1:100之间.用于分组分离的凝胶柱,如脱盐柱由于对分辨率要求较低,所以一般比较短.
(2)凝胶柱的鉴定
凝胶柱的填装情况将直接影响分离效果,关于填装的方法前面已有介绍,这里主要介绍对填装好的凝胶柱的鉴定.凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡.另外通常可以采用一种有色的物质,如蓝色葡聚糖-2000、血红蛋白等上柱,观察有色区带在柱中的洗脱行为以检测凝胶柱的均匀程度.如果色带狭窄、平整、均匀下降,则表明柱中的凝胶填装情况较好,可以使用；如果色带弥散、歪曲,则需重新装柱.另外值得一提的是,有时为了防止新凝胶柱对样品的吸附,可以用一些物质预先过柱,以消除吸附.
(3)洗脱液的选择
由于凝胶层析的分离原理是分子筛作用,它不象其它层析分离方式主要依赖于溶剂强度和选择性的改变来进行分离,在凝胶层析中流动相只是起运载工具的作用,一般不依赖于流动相性质和组成的改变来提高分辨率,改变洗脱液的主要目的是为了消除组分与固定相的吸附等相互作用,所以和其它层析方法相比,凝胶层析洗脱液的选择不那么严格.由于凝胶层析的分离机理简单以及凝胶稳定工作的pH 范围较广,所以洗脱液的选择主要取决于待分离样品,一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶层析.为了防止凝胶可能有吸附作用,一般洗脱液都含有一定浓度的盐.
(4)加样量
关于加样前面已经有所介绍,要尽量快速、均匀.另外加样量对实验结果也可能造成较大的影响,加样过多,会造成洗脱峰的重叠,影响分离效果；加样过少,提纯后各组分量少、浓度较低,实验效率低.加样量的多少要根据具体的实验要求而定：凝胶柱较大,当然加样量就可以较大；样品中各组分分子量差异较大,加样量也可以较大；一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1％－5％左右,而分组分离时加样体积可以较大,一般约为凝胶柱床体积的10％－25％.如果有条件可以首先以较小的加样量先进行一次分析,根据洗脱峰的情况来选择合适的加样量.设要分离的两个组分的洗脱体积分别为Ve1和Ve2,那么加样量不能超过(Ve1－Ve2).实际由于样品扩散,所以加样量应小于这个值.
从洗脱峰上看,如果所要的各个组分的洗脱峰分得很开,为了提高效率,可以适当增加加样量；如果各个组分的洗脱峰只是刚好分开或没有完全分开,则不能再加大加样量,甚至要减小加样量.另外加样前要注意,样品中的不溶物必须在上样前去掉,以免污染凝胶柱.样品的粘度不能过大,否则会影响分离效果.
(5)洗脱速度
洗脱速度也会影响凝胶层析的分离效果,一般洗脱速度要恒定而且合适.保持洗脱速度恒定通常有两种方法,一种是使用恒流泵,另一种是恒压重力洗脱.洗脱速度取决于很多因素,包括柱长、凝胶种类、颗粒大小等,一般来讲,洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质充分平衡,分离效果好.但洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、区带变宽,反而会降低分辨率,而且实验时间会大大延长；所以实验中应根据实际情况来选择合适的洗脱速度,可以通过进行预备实验来选择洗脱速度.一般凝胶的流速是2－10 cm/hr,市售的凝胶一般会提供一个建议流速,可供参考.总之,凝胶层析的各种条件,包括凝胶类型、层析柱大小、洗脱液、上样量、洗脱速度等等,都要根据具体的实验要求来选择.例如样品中各个组分差异较小,则实验要求凝胶层析要有较高的分辨率,提高分辨率的选择应主要包括：选择包括各个待分离组分但分离范围尽量小一些的凝胶,选择颗粒小的凝胶,选择分辨率高的凝胶类型,选择较长、直径较大的层析柱、减少加样量、降低洗脱速度等等.
『伍』 凝胶过滤层析的基本原理
凝胶过滤层析又称为排阻层析或分子筛方法。其基本原理是利用被分离物质分子大小不同及固定相（凝胶）具有分子筛的特点，将被分离物质各成分按分子大小分开，达到分离的目的。层析柱中的填料是某些惰性的多孔网状结构物质，多是交联的聚糖(如葡聚糖或琼脂糖)类物质，小分子物质能进入其内部，流下时路程较长，而大分子物质却被排除在外部，下来的路程短，当一混合溶液通过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质就按不同分子量筛分开了。
『陆』 影响凝胶过滤层析分辨率的主要因素有哪些
(1)层析柱的选择
层析柱大小主要是根据样品量的多少以及对分辨率的要求来进行选择。一般来讲，主要是层析柱的长度对分辨率影响较大，长的层析柱分辨率要比短的高；但层析柱长度不能过长，否则会引起柱子不均一、流速过慢等实验上的一些困难。一般柱长度不超过100cm，为得到高分辨率，可以将柱子串联使用。层析柱的直径和长度比一般在1:25－1:100之间。用于分组分离的凝胶柱，如脱盐柱由于对分辨率要求较低，所以一般比较短。
(2)凝胶柱的鉴定
凝胶柱的填装情况将直接影响分离效果，关于填装的方法前面已有介绍，这里主要介绍对填装好的凝胶柱的鉴定。凝胶柱填装后用肉眼观察应均匀、无纹路、无气泡。另外通常可以采用一种有色的物质，如蓝色葡聚糖-2000、血红蛋白等上柱，观察有色区带在柱中的洗脱行为以检测凝胶柱的均匀程度。如果色带狭窄、平整、均匀下降，则表明柱中的凝胶填装情况较好，可以使用；如果色带弥散、歪曲，则需重新装柱。另外值得一提的是，有时为了防止新凝胶柱对样品的吸附，可以用一些物质预先过柱，以消除吸附。
(3)洗脱液的选择
由于凝胶层析的分离原理是分子筛作用，它不象其它层析分离方式主要依赖于溶剂强度和选择性的改变来进行分离，在凝胶层析中流动相只是起运载工具的作用，一般不依赖于流动相性质和组成的改变来提高分辨率，改变洗脱液的主要目的是为了消除组分与固定相的吸附等相互作用，所以和其它层析方法相比，凝胶层析洗脱液的选择不那么严格。由于凝胶层析的分离机理简单以及凝胶稳定工作的pH 范围较广，所以洗脱液的选择主要取决于待分离样品，一般来说只要能溶解被洗脱物质并不使其变性的缓冲液都可以用于凝胶层析。为了防止凝胶可能有吸附作用，一般洗脱液都含有一定浓度的盐。
(4)加样量
关于加样前面已经有所介绍，要尽量快速、均匀。另外加样量对实验结果也可能造成较大的影响，加样过多，会造成洗脱峰的重叠，影响分离效果；加样过少，提纯后各组分量少、浓度较低，实验效率低。加样量的多少要根据具体的实验要求而定：凝胶柱较大，当然加样量就可以较大；样品中各组分分子量差异较大，加样量也可以较大；一般分级分离时加样体积约为凝胶柱床体积的1％－5％左右，而分组分离时加样体积可以较大，一般约为凝胶柱床体积的10％－25％。如果有条件可以首先以较小的加样量先进行一次分析，根据洗脱峰的情况来选择合适的加样量。设要分离的两个组分的洗脱体积分别为Ve1和Ve2，那么加样量不能超过(Ve1－Ve2)。实际由于样品扩散，所以加样量应小于这个值。
从洗脱峰上看，如果所要的各个组分的洗脱峰分得很开，为了提高效率，可以适当增加加样量；如果各个组分的洗脱峰只是刚好分开或没有完全分开，则不能再加大加样量，甚至要减小加样量。另外加样前要注意，样品中的不溶物必须在上样前去掉，以免污染凝胶柱。样品的粘度不能过大，否则会影响分离效果。
(5)洗脱速度
洗脱速度也会影响凝胶层析的分离效果，一般洗脱速度要恒定而且合适。保持洗脱速度恒定通常有两种方法，一种是使用恒流泵，另一种是恒压重力洗脱。洗脱速度取决于很多因素，包括柱长、凝胶种类、颗粒大小等，一般来讲，洗脱速度慢一些样品可以与凝胶基质充分平衡，分离效果好。但洗脱速度过慢会造成样品扩散加剧、区带变宽，反而会降低分辨率，而且实验时间会大大延长；所以实验中应根据实际情况来选择合适的洗脱速度，可以通过进行预备实验来选择洗脱速度。一般凝胶的流速是2－10 cm/hr，市售的凝胶一般会提供一个建议流速，可供参考。总之，凝胶层析的各种条件，包括凝胶类型、层析柱大小、洗脱液、上样量、洗脱速度等等，都要根据具体的实验要求来选择。例如样品中各个组分差异较小，则实验要求凝胶层析要有较高的分辨率，提高分辨率的选择应主要包括：选择包括各个待分离组分但分离范围尽量小一些的凝胶，选择颗粒小的凝胶，选择分辨率高的凝胶类型，选择较长、直径较大的层析柱、减少加样量、降低洗脱速度等等。
『柒』 凝胶过滤层析和电泳的异同
记得最开始上生物化学的时候，老师问我凝胶电泳和凝胶过滤有什么区别，当时我回回答一个用电，一个答不用电。。。。。凝胶过滤又称为分子筛，是用一根柱子里面有填料，填料是一些粒子，粒子里面有很多的孔，分子比较小的能进入到粒子的孔里面，二分子比较大的就会在粒子旁边流下来。所以用一些蛋白或者是多糖过分子筛，分子大的会先流下来，分子小的后流下来。。。凝胶电泳是运用电泳仪，让蛋白质或者是核酸在凝胶中移动，移动的速率和分子的大小成反比，分子大的跑得慢，分子小的跑得快。。。。简单地说，就是这样。。。。