⑴ 蛋白质的纯化实验
一、仪器设备
色析管柱 （Pharmacia C column, 1.6×100 cm）、铁架、铁夹及水平仪；部分收集器（fraction collector, 需准备干净试管约100 支）；浓缩用离心机 （低速5,000 rpm）；浓缩用离心管Centriprep-30 （Amicon 4322） 请注意其使用方法。
二、药品试剂
胶体Sephacryl S-300 （Pharmacia）：a. 预先以缓冲液buffer A-150 平衡好，并且使完全沈降后的胶体体积，占全部体积的七至八成；要先预估好胶体的使用量。b. 胶体温度要与操作场所的温度一致，否则温度变化会产生气泡。c. Sephacryl 系列胶体有相当大的吸附力，因此要在缓冲液加入0.15 M 以上的NaCl 以除去非专一性吸附。Buffer A-150:注意使用时的温度要与管柱胶体的温度一致标准分子量组合 （Bio-Rad 151-1901）：溶于1 mL 后每组取0.4 mL.含有thyroglobulin （670 kD）， bovine gamma globulin （158 kD）， chicken ovalbumin （44 kD）， equine myoglobin （17 kD）， vitamin B12 （1 350）。
三、管柱装填
1. 以纯水冲洗玻璃管柱 （以纯水上下冲洗即可，严禁使用试管刷）；并请了解管柱的构造与拆装方法，垂直架好管柱，以软管连接部分收集器，并以bufferA-150 试看管路是否通畅；可以用止血钳或长尾文书夹夹住出口软管，则可控制溶离的进行。 注意系统的摆设要适当，不要装置于交通要冲。
2. 依预估量取出Sephacryl 胶体，注意胶体的温度与缓冲液是否已平衡；将瓶中的胶体上下震荡，使的完全悬浮，但勿产生太多气泡。
3. 在管柱内加入约10 cm 高缓冲液，然后将胶体慢慢沿着管壁倒入管柱，一直加到管柱顶端，开始流洗后胶体沈降很快。当胶体上方的液面逐渐降低时，可于顶端添加胶体，以达所要高度；胶体高度约90 cm。
4. 胶体完全沈降后，小心以buffer A-150 加满管柱，关闭出口，装上顶端端盖并连通缓冲液瓶，打开出口以重力流洗。 调整缓冲液瓶高度，使流速约每五~六秒一滴，并设定收集体积为2.5 mL/tube。
5. 胶柱流洗约100 mL 后，关闭出口，拆开顶端端盖，先以滴管吸出胶体上方的溶液到剩约1 cm 高，注意勿破坏胶体表面平整； 然后打开出口，使液面下降至胶体面，再关闭出口，准备注入样本。
四、样本色析进行
1. 以微量移液器或滴管吸取样本 （样本体积不得超过胶体总体积的3%），沿着胶体上方管壁缓慢加入，注意切勿破坏胶体的平整表面。
2. 打开出口，同时开启部分收集器；当样本完全没入胶体时，关闭出口，缓缓加入与样本相等体积的buffer A-150，打开出口待其慢慢进入胶体中，如此重复二次。不得扰动胶体表面，造成凹陷。
3. 暂时关闭出口，将液面高度加满至管柱顶端，并把顶端端盖锁上；然后打开出口开始溶离，调整缓冲液瓶的高度，使流速为6 s 一滴。
4. 要留心观察前面几个分划，确定整个系统运转无碍，小心部分收集器最容易出问题。管柱预计将流洗过夜，收集约80 管。
10） 收集试管，进行蛋白质定量分析以及GUS 活性测定，并请作图。
5. 收集GUS 活性区，以Centriprep-30 浓缩至10 mL 后，加buffer A-0 稀释至20 mL，保留100 μL。
6. 管柱请再以buffer A-150 流洗100 mL 后，小心放置一旁，准备以后进行分子量测定。
五、分子量测定
1. 进行分子量测定前一天，请先以buffer A-150 流洗100 mL，并检查胶柱内有无气泡产生，若有严重的气泡或干裂，必须重新装填管柱。
2. 取标准分子量溶液0.4 mL,加上纯质目标酶0.5 mL （以亲和层析法所得的AF 部份），如上法注入管柱中，立刻开始进行胶体过滤，并收集各分划。请依循上述所有管柱及分划收集器的操作要点。
3. 收集所得，进行蛋白质定量分析，可定出数个蛋白质尖峰，以作为分子量依据；另以目测法，决定红色高峰的管数，则可定出vitamin B12的溶离管数。利用以上数据，可画出分子量与溶离管数间的直线关系，作为分子量判定的标准校正线。
4. 同样的一批分划，请进行酶活性分析 （GUS），则可定出酶的溶离体积，对照上述标准校正线，则可求出酶的分子量。
六、拆除管柱及保存胶体
1. 若管柱长期不用，应当自管柱中取出胶体，以缓冲液清洗后，置冷藏室中保存，但绝对不要放在冷冻箱中。胶体若装填太紧，有时可能不易取出，要有耐心地以缓冲液慢慢冲出来。
2. 胶体可以加0.01% NaN3防止霉菌生长，但使用前记得要洗去；再度使用时，请检查胶体中有无灰黑色霉菌颗粒，若有结块而不易打散者，也不要使用。
⑵ 超滤膜的原理是什么孔径与分子量之间有关系吗
超滤膜原理
超滤膜筛分过程，以膜两侧的压力差为驱动力，以超滤膜为过滤介质，在一定的专压力下，当属原液流过膜表面时，超滤膜表面密布的许多细小的微孔只允许水及小分子物质通过而成为透过液，而原液中体积大于膜表面微孔径的物质则被截留在膜的进液侧，成为浓缩液，因而实现对原液的净化、分离和浓缩的目的。
超滤膜孔径与分子量之间的关系
超滤膜是一种具有超级“筛分”分离功能的多孔膜。它的孔径只有几纳米到几十纳米，也就是说只有一根头发丝的1‰!在膜的一侧施以适当压力，就能筛出大于孔径的溶质分子，以分离分子量大于500道尔顿、粒径大于2～20纳米的颗粒。超滤膜的结构有对称和非对称之分。前者是各向同性的，没有皮层，所有方向上的孔隙都是一样的，属于深层过滤;后者具有较致密的表层和以指状结构为主的底层，表层厚度为0.1微米或更小，并具有排列有序的微孔，底层厚度为200～250微米，属于表层过滤。工业使用的超滤膜一般为非对称膜。超滤膜的膜材料主要有纤维素及其衍生物、聚碳酸酯、聚氯乙烯、聚偏氟乙烯、聚砜、聚丙烯腈、聚酰胺、聚砜酰胺、磺化聚砜、交链的聚乙烯醇、改性丙烯酸聚合物等等。
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⑷ 超滤膜有什么作用
超滤膜能复够去除水中制能够找到的任何最为细小的颗粒物，超滤的颗粒截留范围一般可达到0.001－0.01微米，微滤的颗粒截留范围比超滤要高出1－2个数量级，一般为0.1－0.2微米。
目前人对水的需求不断增加，对水质的要求也越来越高，现在水质受到污染已经越来越严重了，为了能有效解决这个问题，得到可以饮用的水以及合格的工业用水，膜技术由于清洁、无污染、无相变等特色受到各行业广泛地关注。东丽超滤膜法是一种广泛应用于海水淡化、苦成水淡化、造、食品医疗、锅炉补给水软化水、浓缩分离、工艺纯水、饮用水、废水回用等领域，而且它的重要性正在日益显著
⑸ 绾跨矑浣撲腑涓嶅惈鈥滅粏鑳為ㄦ灦鈥
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⑹ 超滤截留分子量与膜孔径
超滤膜截留的分子量 10000 30000 50000 60000 100000 200000 300000 500000 1000000..
对应超滤膜孔径(μm) 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06 0.07 0.08 0.1
也就是说100kD（10万）的截留分子量对应50nm的孔径
⑺ 100kd大约多少nm
100KD--5.5nm
300KD的透纳薯析袋孔径为14nm；100KD--5.5nm；洞埋者50KD--3nm；液肆30KD--2.2nm；20KD--1.8nm；10KD--1.5nm；1KD--1.2nm。
⑻ 过滤膜 的孔径大小，10kd 的蛋白选用多少的孔径过滤
第一超滤管达不来到100%的与孔径源完全一致。任何滤膜都达不到和标称孔径完全一致，只能是无限的接近孔径。 其二分子量是质量，而孔径是长度单位，原则上不具有匹配性。原因是，标的物的结构会直接影响过滤精度。球状的和链状的，分子量相同，但是用相同孔径可以截住球状的，而链状的就会透过去。 因此，两者之间没有绝对的联系。
早上好，这个看你要过滤的材料要求了。如果是低黏度的，通常选择小孔径的比如0.22，如果是高黏度的，一般选择0.8或者更高的，特别粘稠比如甘油那样超过300cps的就不要过滤了……含有大量固体颗粒的，请先选择二级过滤，比如先用0.8再用0.45，直接用0.45或者0.22将会导致过滤器压力急剧升高爆膜掉。你是要过滤水相，还是有机相的？
⑼ 澄清过滤后超滤用多少KD的膜进行比较合适
100KD和300KD都可以，因为HCD, HCP和RNA的分子量一般会小于100KD而质粒的分子量较大，因此这两款膜包都可回以对质粒进行快速有答效的超滤浓缩以及洗滤换液。Sartorius赛多利斯拥有膜配方和生产专利，通过对树脂规格，配方和制膜工艺的专业引领着一次性行业的发展。