免疫球蛋白阳离子交换

1. 临床医学 医学

急性肾小球肾炎(acute glomerulonephritis)通常指急性链球菌感染后肾小球肾炎(acute poststreptococcal glomerulonephritisAPSGN)，是由A组β溶血性链球菌感染后，所引起的免疫复合物沉积在肾小球而致的弥漫性肾小球毛细血管内渗出性增生性炎症病变。临床表现轻重不一，典型表现为水肿尿少、高血压预后良好，大多数完全恢复，少数(1%～2%)可迁延不愈而转为慢性。
1、 病因编辑本段 (一)发病原因能引起急性感染后肾小球肾炎的病原有：

1.β溶血性链球菌A组

2.非链球菌(包括其他的葡萄球菌链球菌革兰阴性杆菌等)病毒(流感病毒柯萨奇病毒B4EB病毒)肺炎支原体及原虫等在A组β溶血性链球菌中由呼吸道感染所致肾炎的菌株以12型为主少数为13462549型引起肾炎的侵袭率约5%由皮肤感染引起的肾炎则以49型为主少数为25557和60型侵袭率可达25%

(二)发病机制

1.发病机制 肾小球疾病的发生机制十分复杂有多种因素参与免疫机制是其中重要的一环免疫发病机制的研究不仅有其理论价值还可指导疾病防治具有重要的临床意义细菌感染多是通过抗原-抗体复合物在肾小球沉积后激活补体诱发炎症反应而发病而病毒支原体等则是直接侵袭肾组织而致肾炎关于A组β溶血性链球菌感染后导致肾炎的机制一般认为机体对链球菌的某些抗原成分(如胞壁的M蛋白或胞质中某些抗原成分)产生抗体形成循环免疫复合物随血流抵达肾脏并沉积于肾小球基膜进而激活补体,造成肾小球局部免疫病理操作而致病但近年还提出了其他机制有人认为链球菌中的某些阳离子抗原先植入于肾小球基膜通过原位复合物方式致病：致肾炎链球菌株通过分泌神经氨酸酶改变了机体正常的IgG从而使其具有了抗原性导致抗体产生沉积在肾脏而发病还有人认为链球菌抗原与肾小球基膜糖蛋白具有交叉抗原性此少数病例属肾抗体型肾炎沉积在肾脏的链球菌抗原一直不甚清楚原以为是其细胞壁抗原(M蛋白)但在肾小球内未发现M蛋白沉积后发现在患者的肾小球内沉积有内链球菌素(endosfrcptosin)肾炎菌株协同蛋白和前吸收抗原(preadsorbing antigen)等链球菌成分但是否APSGN是由上述抗原所诱发的免疫机制致病尚未完全肯定

2.病理改变 APSGN的早期肾活检主要为弥漫性毛细血管内增生性肾小球肾炎光镜下可见肾小球肿大内皮细胞及系膜细胞增生(称为毛细血管内增生)中性多形核白细胞和单核细胞在肾小球内浸润使毛细血管壁狭窄乃至闭塞但毛细血管壁通常无坏死沿毛细血管壁基膜外侧偶有不连续的蛋白质性沉积物(驼峰)即沉积的免疫复合物在电镜下表现为上皮侧大块状的电子致密沉积物在少数肾小球可见局限性毛细血管外增生(新月体)但很少有弥漫性新月体形成肾小球之外的血管和肾小管间质区一般正常在远端小管腔内常见红细胞可形成红细胞管型免疫荧光检查可分系膜型星空型花环型三种在毛细血管襻周围和系膜区可见IgG颗粒样沉积常伴有C3和备解素沉积但较少见有G1q和C4沉积血清补体成分的改变和肾小球毛细血管襻明显的C3备解素的沉积表明补体激活可能主要途径是替代途径
2、 症状体征编辑本段1.典型病例

(1)前驱病史：发病前10天左右常有上呼吸道感染扁桃体炎等链球菌前驱感染史;以皮肤脓疱疮为前驱病史者前驱期稍长约2～4周

(2)水肿：常为最先出现的症状初期以眼睑及颜面为主渐下行至四肢呈非凹陷性合并腹水及胸腔积液都极为少见

(3)尿量：尿量减少与水肿平行尿量越少水肿越重少尿标准为学龄儿童每天尿量<400ml学龄前儿童<300ml婴幼儿<200ml或每天尿量少于250ml/m2;无尿标准为每天尿量<50ml/m2

(4)血尿：疾病初期50%～70%患儿可出现肉眼血尿1～2周后转为镜下血尿轻症病人多数无肉眼血尿尿的改变是本病必不可少的临床表现

(5)高血压：见于70%的病例不同年龄组高血压的标准不同：学龄儿童≥17.3/12kPa(130/90mmHg);学龄前期儿童≥16/10.7kPa(120/80mmHg);婴幼儿≥14.7/79.3kPa(110/70mmHg)为高血压 (6)其他：部分患者可出现腰痛及尿痛症状高血压明显时常伴有头晕头痛恶心呕吐和纳差等

2.严重病例 见于患病初期(1周内)除上述表现外还可出现下列之一的临床表现即为严重病例

(1)急性肾功能不全：表现为严重少尿甚至无尿血肌酐及尿素氮明显升高血肌酐≥176µmol/L(2mg/dl)出现高钾血症及代谢性酸中毒患儿恶心呕吐乏力呼吸增快水肿加重等

(2)严重循环充血：高度水钠潴留可引起严重循环充血及心衰水肿等表现为明显水肿持续少尿乃至无尿心慌气促烦躁不能平卧发绀两肺啰音心音低钝心率增快奔马律和肝脏进行性增大 (3)高血压脑病：血压急骤升高达21.3/14.7kPa (160/110mmHg)以上超过脑血管代偿收缩功能使脑血流灌注过多而出现脑水肿表现如剧烈头痛频繁呕吐视力模糊乃至失明严重神志不清昏迷惊厥等 3.非典型病例 (1)肾外症状性肾炎：又称尿轻微改变肾炎虽有典型的链球菌感染前驱病史水肿高血压及血清补体的降低有或者无尿少但尿中往往无蛋白红细胞及白细胞或呈一过性异常

(2)表现为肾病综合征的急性肾小球肾炎：蛋白尿明显的急性肾炎可出现低蛋白血症高脂血症和凹陷性水肿通过尿检动态观察及血清补体检测可与肾炎性肾病综合征相鉴别

1.临床特点 典型急性肾小球肾炎诊断并不困难链球菌感染后经1～3周无症状间歇期出现水肿高血压血尿(可伴有不同程度蛋白尿)再加以血C3的动态变化即可明确诊断

2.实验室检查 但确诊APSGN则需包括下述3点中的2点：

(1)检出致病菌：在咽部或皮肤病损处检出致肾炎的β溶血性链球菌

(2)检出抗体：对链球菌成分的抗体有一项或多项呈阳性如ASOanti-DNAaseB抗体anti-Hase抗体anti-ADPNase抗体等为了使诊断的准确率达到90%必须进行多种抗体测试值得注意的是早期使用抗生素治疗能阻止上述抗体的产生并使咽部细菌培养为阴性但不能阻止APSGN的发生

(3)补体降低：血清补体C3降低
3、 检查化验编辑本段1.尿液分析 尿液改变有很大的个体差异一般表现为：

(1)尿量少而比重较高

(2)常见有肉眼血尿尿液外观为烟雾状的咖啡色常伴有红细胞管型尿沉渣中的红细胞为畸形

(3)常有蛋白尿但程度不一一般24h尿蛋白定量为0.2～3.0g如果蛋白尿明显并持续时间较长可发生肾病综合征

(4)尿中有白细胞和白细胞管型早期尤显著

(5)多种管型尿：除红细胞管型白细胞管型外还可有透明管型颗粒管型及透明管型等

2.血液检查

(1)红细胞计数及血红蛋白可稍低系因： ①血容量扩大血液稀释 ②伴肾功能衰竭者出现促红细胞生成素减少导致肾性贫血 ③溶血性贫血

(2)白细胞计数可正常或增高此与原发感染灶是否继续存在有关

(3)血沉多增快1～3月内可恢复正常

3.血生化及肾功能检查 肾小球滤过率(GFR)呈不同程度下降但肾血浆流量仍可正常因而滤过分数常减少与肾小球功能受累相比肾小管功能相对良好肾浓缩功能多能保持临床常见一过性氮质血症血中尿素氮肌酐轻度增高伴急性肾功能不全时可出现血中尿素氮肌酐的明显升高不限水量的患儿可有轻度稀释性低钠血症此外病儿还可有高血钾及代谢性酸中毒血浆蛋白可因血液稀释而轻度下降在尿蛋白达肾病水平者血清白蛋白下降明显并可伴一定程度的高脂血症

4.链球菌感染的证据 可进行皮肤病灶或咽部拭子细菌培养以发现A组β溶血性链球菌或者检查血清中抗链球菌溶血素或酶的抗体抗“O”(ASO)升高见于80%以上呼吸道感染为前驱症状的病人和50%以脓疱疮为前驱症状的病人一般在感染后2～3周开始升高3～5周达高峰半年内恢复正常还可检测抗脱氧核糖核酸酶B(anti-DNAase B)抗玻璃酸酶(anti-Htase)及抗双磷酸吡啶核苷酸酶(anti-ADPNase)这些酶活性的增高都是链球菌感染的证据Anti-Htasc在皮肤感染时阳性率较高Anti-ADPNase则在呼吸道感染时阳性率高而Anti-ADPNase B则在两种感染时阳性率都>90%

5.免疫学检查 血清总补体(CH50)和补体3(C3)水平的下降是诊断急性肾小球肾炎的关键但下降水平与病变程度及预后无关;血清γ球蛋白和免疫球蛋白IgG水平常增高;血清补体4(C4)水平正常或轻度降低降低的血清补体3多在1～2月内恢复正常但少数3个月才恢复正常

6.肾活体组织检查 早期表现为毛细血管内渗出性增生性炎症内皮细胞及系膜细胞增生上皮下大量沉积物并且呈驼峰样后期以轻度系膜增生为主严重病人可出现大量新月体

1.ECG 可表现为低电压T波低平等改变

2.X线 胸片可发现心影轻度增大;发生严重循环充血时可发现肺水肿表现 3.超声波检查 可见双肾正常或弥漫性肿大皮质回声增强;发生严重循环充血时肝脏增大
4、 鉴别诊断编辑本段 由于多种肾脏疾病均可表现为急性肾炎综合征还有一些肾脏病伴有血C3下降因此需要进行鉴别诊断

1.其他病原体感染后的肾小球肾炎 已知多种病原体感染也可引起肾炎并表现为急性肾炎综合征可引起增殖性肾炎的病原体有细菌(葡萄球菌肺炎球菌等)病毒(流感病毒EB病毒水痘病毒柯萨基病毒腮腺炎病毒ECHO病毒巨细胞包涵体病毒及乙型肝炎病毒等)肺炎支原体及原虫等参考病史原发感染灶及其各自特点一般均可区别这些感染后肾炎患者往往C3下降不如APSGN显著

2.其他原发性肾小球疾患

(1)膜增生性肾炎：起病似急性肾炎但常有显著蛋白尿血补体C3持续低下病程呈慢性过程必要时行肾活检鉴别

(2)急进性肾炎：起病与急性肾炎相同常在3个月内病情持续进展恶化血尿高血压急性肾功能衰竭伴少尿持续不缓解病死率高

(3)IgA肾病：多于上呼吸道感染后1～2天内即以血尿起病通常不伴水肿和高血压一般无血清补体下降有时有既往多次血尿发作史鉴别困难时需行肾活体组织检查

(4)原发性肾病综合征肾炎型：肾炎急性期偶有蛋白尿严重达肾病水平者与肾炎性肾病综合征易于混淆经分析病史补体检测甚至经一阶段随访观察可以区别困难时需行肾活体组织检查

3.继发性肾脏疾病 也可以急性肾炎综合征起病如系统性红斑狼疮过敏性紫癜溶血尿毒综合征坏死性小血管炎Goodpasture综合征据各病之其他表现可以鉴别

4.急性泌尿系感染或肾盂肾炎 在小儿也可表现有血尿但多有发热尿路刺激症状尿中以白细胞为主尿细菌培养阳性可以区别

5.慢性肾炎急性发作 儿童病例较少常有既往肾脏病史发作常于感染后1～2天诱发缺乏间歇期且常有较重贫血持续高血压肾功能不全有时伴心脏眼底变化尿比重固定B超检查有时见两肾体积偏小
5、 并发症编辑本段 急性期重症病例常并发严重循环充血高血压脑病和急性肾功能衰竭常致患儿死亡极少数发展成慢性肾炎等
6、 预防保健编辑本段 根本的预防是防治链球菌感染平时应加强锻炼注意皮肤清洁卫生以减少呼吸道及皮肤感染如一旦感染则应及时彻底治疗感染后2～3周时应查尿常规以及时发现异常
7、 治疗用药编辑本段(一)治疗肾炎的免疫发病过程涉及多个环节如抗原抗体的形成免疫复合物的形成及多种介质的参与等因此肾炎的治疗应针对消除或削弱这些环节目前临床应用的治疗措施有些已取得较好疗效如肾上腺皮质激素和环磷酰胺治疗微小病变型肾病综合征有些可能有效;如抗凝治疗用于某些肾小球疾病;更多方面还需进行深入研究以找出有效的治疗方法

本病主要治疗为清除体内残余病原对症及保护肾功能,防止并发症

1.一般治疗

(1)休息：无论病情轻重早期均应卧床休息直至水肿显著消退血压正常及肉眼血尿消失通常需要2～3周血沉正常后可上学但尿Addis计数正常前应控制活动量

(2)饮食：急性期宜限制水盐及蛋白质摄入量一般采用低盐或无盐低蛋白饮食用糖提供热量盐摄入量控制在1～2g/d水平伴肾功能不全时用优质蛋白质摄入量以0.5g/(kg·d)为宜水肿重且尿少者限水

2.抗生素 主要目的为清除残余病菌可用青霉素20万～30万U/(kg·d)或红霉素30mg/(kg·d)静脉滴注治疗2周疑有其他病原时可加用其他抗生素对青霉素过敏者可用红霉素

3.对症治疗 包括利尿消肿降压等

(1)利尿：轻度水肿者可选用氢氯噻嗪(hydrochlorothiazideDHCT)2～3mg/(kg·d)口服尿量增多后加用螺旋内酯(spironolactoneantisterone)2mg/(kg·d)口服口服利尿剂效果差或重度水肿病人可静脉滴注或肌注呋塞米(furosemide速尿)每次1～2mg/kg还可采用新型利尿合剂即多巴胺和酚妥拉明各0.3～0.5mg/kg呋塞米2mg/kg一起加入10%葡萄糖100～200ml中静滴利尿效果优于单用呋塞米

(2)降压：首选硝苯地平(nifedipine心痛定)每次0.25～0.5mg/kg3～4次/d口服或舌下含服如血压仍不能控制可用尼卡地平(nieardipine佩尔地平perdipine)每次0.5～1mg/kg2次/d;卡托普利(captopril巯甲丙脯氨酸)1～2mg/(kg·d)2～3次/d;哌唑嗪(prazosin)每次0.02～0.05mg/kg3～4次/d口服

4.重症病例治疗

(1)急性肾功能不全：急性肾小球肾炎患者多于起病第1～2周尿量减少可有氮质血症以后随肾脏病变的好转而尿量增加BUNCr亦随之降至正常但有少数患儿病变严重肾小球毛细血管内血栓形成纤维素样坏死或上皮细胞增生纤维蛋白沉积很快形成大面积新月体可在短期内导致严重少尿甚至无尿肾功能衰竭亦有可能发展为急进性肾炎

①少尿期：维持水电解质及酸碱平衡加强利尿

A.严格控制水分入量：“量出为入”仅补充不显性失水按400ml/(m2·d)或[婴儿20ml/(kg·d)幼儿15ml/(kg·d)儿童10ml/(kg·d)]及前一天尿量和异常失水量

每天液量=尿量+不显性失水-食物代谢和组织分解所产生的内生水

体温升高1℃按75ml/(m2·d) 增加水补充不显性失水用不含钠液体经末梢输注可用10%～20%葡萄糖经中心静脉可用30%～50%葡萄糖内生水按100ml/(m2·d)异常丢失包括呕吐腹泻胃肠引流等用1/4～1/2张液体补充

每天应注意评估患者含水状态临床有无脱水或水肿;每天测体重如入量控制合适体重每天应减少10～20mg/kg血钠不低于130mmol/L以下血压稳定

B.热量和蛋白质入量：供给足够热量以减少蛋白质分解早期只给碳水化合物供给葡萄糖3～5mg/(kg·d)静滴可减少机体自身蛋白质分解和酮体产生情况好转能口服时应及早给予基础代谢热卡[儿童30kcal/(kg·d)婴儿50kcal/(kg·d)]饮食可给低蛋白低盐低钾和低磷食物蛋白质应限制在0.5～1.0mg/(kg·d)为宜且应以优质蛋白为主如鸡蛋肉类奶类蛋白为佳为促进蛋白质合成可用苯丙酸诺龙25mg肌注每周1～2次对有高分解状态或不能口服者可考虑用静脉高营养

C.高钾血症的治疗：血钾>6.5mmol/L为危险界限应积极处理如有明显EKG改变时可予10%葡萄糖酸钙0.5～1ml/kg静脉缓慢注射15～30min;或5%NaHCO3 3～5ml/kg静注或20%葡萄糖(0.5g/kg)加胰岛素(0.2U/g葡萄糖)2h滴注经以上治疗无效或血K >6.5mmol/L时应考虑透析治疗

a.重碳酸盐：可纠正酸中毒形成细胞外液轻度碱中毒使钾由细胞外转移至细胞内同时也扩大细胞外体积稀释血钾浓度可用5%碳酸氢钠2ml/kg在5min内静注如未恢复正常15min后可重复1次钠溶液作用迅速但持续时间短仅维持30～90min

b.葡萄糖酸钙：钙可拮抗钾对心肌的毒性10%葡萄糖酸钙10ml静点5min开始起作用可持续1～2min每天可用2～3次但用洋地黄者宜慎用

c.高渗葡萄糖和胰岛素：促进钾进入细胞内每3～4mg葡萄糖配1U胰岛素每次用1.5mg/kg糖可暂时降低血钾1～2mmol/L15min开始起作用可持续12h或更长必要时可重复

以上三种疗法在高钾急救时可单独或联合使用有一定疗效但不能持久因此在治疗同时可开始准备透析

d.阳离子交换树脂：经以上抢救EKG趋于正常但血钾仍在5.5～7mmol/L之间可给阳离子交换树脂口服或灌肠0.3～1mg/(kg·次)此药易引起便秘可和10%～20%山梨醇混合口服或灌肠山梨醇有渗透腹泻作用灌肠后30～60min开始起作用,每天重复2～4次也可放在胶囊内吞服阳离子树脂每吸收1mmol钾同时释放出1mmol其他阳离子如钠应注意钠潴留

e.透析：血透或腹透均有效前者作用较快能在1～2h内使血钾从7.5～8mmol/L降至正常范围以内而腹透需4～6h降至正常

防治高血钾要减少机体蛋白质的高分解代谢供给足够热卡限制含钾较高的饮食和药物及不输库存血等

D.低钠血症：应区分是稀释性或低钠性在少尿期前者多见严格控制水分入量利尿,多可纠正一般不用高渗盐进行纠正这会引起容量过大导致心衰低钠性者当血钠<120mmol/L且又出现低钠综合征时可适当补充3% NaCl 1.2ml/kg可提高血钠1mmol/L可先给3～6ml/kg可提高2.5～5mmol/L

E.代谢性酸中毒：轻症多不需治疗当血HCO3-<12mmol/L时应给予碳酸氢钠5%碳酸氢钠1ml/kg可提高HCO3- 1mmol/L给碱性液可使血容量扩大和诱发低钙抽搐

F.高血压心力衰竭及肺水肿：多与血容量过多水中毒有关治疗应严格限制水分入量限盐及利尿利尿可用呋塞米2～3mg/(kg·次)2～3次/d如有高血压脑病可用硝普钠静点可将硝普钠10～20mg加在5%葡萄糖100ml内根据血压调节滴数1～8µg/(kg·min)使血压稳定在一定水平扩张血管可用多巴胺及酚妥拉明各10mg加在10%葡萄糖100ml内静滴1次/d连用7天两药合用可扩张肾小动脉改善肾血流量

G.心力衰竭的治疗：由于心肌缺氧水肿及少尿对洋地黄制剂非常敏感即使少量应用也易产生中毒应慎用其主要治疗应以利尿限盐限水及扩张血管为主如出现肺水肿除利尿及扩张血管外应加压给氧可用吗啡0.1～0.2mg/kg皮下注射放血或止血带扎四肢必要时透析

H.低钙抽搐：可静脉给10%葡萄糖酸钙10ml1～2次/d可适当加镇静剂如安定

②多尿期治疗：

A.低钾血症的矫治：尿量增多钾从尿中排出易致低钾可给2～3mmol/(kg·d)口服如低钾明显可静脉补充其浓度一般不超过0.3%用10% KCl 3ml加在100ml液体中随时检测血钾浓度或心电图改变防止血钾过高

B.水和钠的补充：由于利尿水分大量丢失应注意补充但如尿量过多应适当限制水分入量以尿量1/2～2/3为宜补液过多会延长多尿期

C.控制感染：约1/3病人死于感染应积极控制可选择敏感抗生素但应注意保护肾功能

D.透析治疗：早期透析可降低死亡率根据具体情况可选用血透或腹透透析指征：

a.血生化指标：BUN>28.56mmol/L(80mg/dl);Cr>530.4µmol/L;血钾>6.5mmol/L或心电图有高钾表现;CO2CP<12mmol/L

b.临床有明显尿毒症症状少尿2～3天频繁呕吐有周围神经或精神症状者

c.明显水钠潴留表现

d.化学毒物或药物中毒

(2)严重循环充血：以利尿剂为主伴明显高血压时也可试用血管扩张剂如硝普钠1～2µg/(kg·min)一般不用洋地黄心力衰竭明显时可小剂量应用毛花苷C(西地兰)0.01mg/(kg·次)一般1～2次即可不必维持用药上述治疗无效时可用血液滤过血液透析或腹膜透析治疗

严重循环充血心力衰竭：应卧床休息严格限制水钠摄入尽快利尿降压

强力利尿剂：呋塞米(速尿)2mg/kg静注4～6h后可重复如仍无尿可加大剂量至3～4mg/kg患者多于病程第7～10天开始利尿但若继续无尿BUN 24h内上升7.2～18mmoL/L(20～50mg/dl)或Cr 24h内上升176.8～265.2µmol/L(2～3mg/dl)或有心脏负荷过重或高钾血症酸中毒不能纠正者应采用透析疗法

明显肺水肿者可予扩血管药硝普钠(用法同高血压脑病)或酚妥拉明0.1～0.2mg/kg加入5%～10%葡萄糖液10～20ml中静脉缓慢注射以减轻心脏负荷烦躁不安时予镇静剂如哌替啶(度冷丁)(1mg/kg)或吗啡(0.1～0.2mg/kg)皮下注射经观察此类患者心排血量不低动静脉血氧差减少射血分数不低故一般不主张用洋地黄制剂经上述治疗仍难控制的循环充血可用腹膜透析或血液滤过治疗

(3)高血压脑病：首选硝普钠(sodium nitroprusside)静脉滴注剂量为1～5µg/(kg·min)最大量<8µg/(kg·min)需新鲜配制>4h后不宜使用输液中需避光主要不良反应有恶心呕吐头痛肌痉挛血压过低等也可用二氮嗪(diazoxide)3～5mg/(kg·次)或尼卡地平(佩尔地平)0.5～6µg/(kg·min)静脉注射对惊厥者可用地西泮(diazepam;安定valium)0.3mg/(kg·次)静注或苯巴比妥(phenobarbital)5～8mg/(kg·次)肌注治疗

5.肾上腺皮质激素治疗 一般病人禁用肾上腺皮质激素以免加重水钠潴留及高血压对于持续大量蛋白尿者或临床病理有慢性化趋势的患儿可口服泼尼松(prednisone)治疗剂量1～2mg/(kg·d)并逐步减量疗程以1～2月为宜对于肾活组织检查有大量新月体的病人可先以甲泼尼龙(甲基泼尼松龙)20～30mg/(kg·次)冲击治疗然后改为泼尼松口服治疗

6.恢复期治疗 在肉眼血尿水肿高血压消失后可用中药如六味地黄丸(6g/次3次/d)或白茅根(20g/次煎服)等治疗直至镜下血尿消失

(二)预后

小儿急性肾小球肾炎预后良好大多数可完全恢复急性期死亡主要与严重并发症有关绝大多数患儿2～4周内肉眼血尿消失尿量增多水肿消退血压逐渐恢复残余少量蛋白尿及镜下血尿多于6个月内消失少数重症病人可迁延1～3年甚至发展成慢性肾炎或慢性肾功能不全
以上是给你介绍一些医学知识，希望你对疾病有一定的了解，我是学医的，医生在医院里可能给你解释不了那么多，看完上面的介绍后，或许你会懂一些医学知识。

2. 蛋白质的分离纯化技术有哪些

蛋白质的分离纯化方法很多，主要有：
（一）根据蛋白质溶解度不同的分离方法
1、蛋白质的盐析
中性盐对蛋白质的溶解度有显著影响，一般在低盐浓度下随着盐浓度升高，蛋白质的溶解度增加，此称盐溶；当盐浓度继续升高时，蛋白质的溶解度不同程度下降并先后析出，这种现象称盐析，将大量盐加到蛋白质溶液中，高浓度的盐离子（如硫酸铵的 SO4 和 NH4)有很强的水化力，可夺取蛋白质分子的水化层，使之“失水”，于是蛋白质胶粒凝结并沉淀析出。盐析时若溶液 pH 在蛋白质等电点则效果更好。由于各种蛋白质分子颗粒大小、亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样，因此调节混合蛋白质溶液中的中性盐浓度可使各种蛋白质分段沉淀。
影响盐析的因素有：（1）温度：除对温度敏感的蛋白质在低温（4 度）操作外，一般可在室温中进行。一般温度低蛋白质溶介度降低。但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25 度）比 0 度时溶解度低，更容易盐析。（2）pH 值：大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶介度最低。（3）蛋白质浓度：蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在 2.5-3.0%。蛋白质盐析常用的中性盐，主要有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中应用最多的硫酸铵，它的优点是温度系数小而溶解度大（25 度时饱和溶液为 4.1M，即 767 克/升；0 度时饱和溶解度为 3.9M，即 676 克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。硫酸铵溶液的 pH 常在 4.5-5.5 之间，当用其他 pH 值进行盐析时，需用硫酸或氨水调节。蛋白质在用盐析沉淀分离后，需要将蛋白质中的盐除去，常用的办法是透析，即把蛋白质溶液装入秀析袋内（常
用的是玻璃纸），用缓冲液进行透析，并不断的更换缓冲液，因透析所需时间较长，所以最好在低温中进行。此外也可用葡萄糖凝胶 G-25 或 G-50 过柱的办法除盐，所用的时间就比较短。
2、等电点沉淀法
蛋白质在静电状态时颗粒之间的静电斥力最小，因而溶解度也最小，各种蛋白质的等电点有差别，可利用调节溶液的 pH 达到某一蛋白质的等电点使之沉淀，但此法很少单独使用，可与盐析法结合用。
3、低温有机溶剂沉淀法
用与水可混溶的有机溶剂，甲醇，乙醇或丙酮，可使多数蛋白质溶解度降低并析出，此法分辨力比盐析高，但蛋白质较易变性，应在低温下进行。
（二）根据蛋白质分子大小的差别的分离方法
1、透析与超滤
透析法是利用半透膜将分子大小不同的蛋白质分开。超滤法是利用高压力或离心力，强使水和其他小的溶质分子通过半透膜，而蛋白质留在膜上，可选择不同孔径的泸膜截留不同分子量的蛋白质。
2、凝胶过滤法
也称分子排阻层析或分子筛层析，这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一。柱中最常用的填充材料是葡萄糖凝胶（Sephadex ged）和琼脂糖凝胶（agarose gel）。
（三）根据蛋白质带电性质进行分离
蛋白质在不同 pH 环境中带电性质和电荷数量不同，可将其分开。
1、电泳法
各种蛋白质在同一 pH 条件下，因分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而得以分开。值得重视的是等电聚焦电泳，这是利用一种两性电解质作为载体，电泳时两性电解质形成一个由正极到负极逐渐增加的 pH 梯度，当带一定电荷的蛋白质在其中泳动时，到达各自等电点的 pH 位置就停止，此法可用于分析和制备各种蛋白质。
2、离子交换层析法
离子交换剂有阳离子交换剂（如：羧甲基纤维素；CM-纤维素）和阴离子交换剂（二乙氨基乙基纤维素；DEAE?FONT FACE="宋体" LANG="ZH-CN">纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改变 pH 或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来。
（四）根据配体特异性的分离方法－亲和色谱法
亲和层析法（aflinity chromatography）是分离蛋白质的一种极为有效的方法，它经常只需经过一步处理即可使某种待提纯的蛋白质从很复杂的蛋白质混合物中分离出来，而且纯度很高。这种方法是根据某些蛋白质与另一种称为配体(Ligand）的分子能特异而非共价地结合。其基本原理：蛋白质在组织或细胞中是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质，因此蛋白质的分离（Separation），提纯（Purification）和鉴定（Characterization）是生物化学中的重要的一部分，至今还没的单独或一套现成的方法能移把任何一种蛋白质
从复杂的混合蛋白质中提取出来，因此往往采取几种方法联合使用。

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3. 蛋白质分离方法有哪些，它们的特点各是什么

1.根据分子大小不同进行分离纯化
蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白
质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果
离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。
2.根据溶解度不同进行分离纯化

影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。

等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最
低;相反,有些蛋白质在一定pH值时很容易溶解。因而可以通过调节溶液的pH值来分离纯化蛋白质。王洪新等[8]研究茶叶蛋白质提取过程发现,pH值为时茶叶蛋白提取效果最好,提取率达到36·8%,初步纯化得率为91·0%。李殿宝[9]在从葵花脱脂粕中提取蛋白质时将蛋白溶液的pH值调到3~4,使目标蛋白于等电点沉淀出来。等电点沉淀法还应用于葡萄籽中蛋白质的提取。李凤英等[10]测得葡萄籽蛋白质的等电点为3·8。他们利用碱溶法提取葡萄籽蛋白质,得到了最佳的提取工艺为:以1×10-5mol·L-1的NaOH溶液,按1∶5的料液比,在40℃搅拌40 min,葡萄籽蛋白质提取率达73·78%。另外还可以利用碱法提取大米蛋白,其持水性、吸油性和起泡性等均优于酶法提取[11]。利用酸法提取得到的鲢鱼鱼肉蛋白质无腥味、色泽洁白,蛋白质产率高达90%[12]。
蛋白质的盐溶和盐析是中性盐显著影响球状蛋白质溶解度的现象,其中,增加蛋白质溶解度的现象称盐溶,反之为盐析。应当指出,同样浓度的二价离子中性盐,如MgCl2、(NH4)2SO4对蛋白质溶解度影响的效果,要比一价离子中性盐如NaCl、NH4Cl大得多。在葡萄籽蛋白提取工艺中除了可以利用碱溶法还可以利用盐溶法来提取蛋白质,其最佳提取工艺是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃搅拌提取30min,蛋白质提取率为57·25%[10]。盐析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸钠絮凝法、硫酸铵盐析法,其中硫酸铵盐析法广泛应用于生产。由于硫酸铵在水中呈酸性,为防止其对蛋白质的破坏,应用氨水调pH值至中性。为防止不同分子之间产生共沉淀现象,蛋白质样品的含量一般控制在0·2% ~2·0%。利用盐溶和盐析对蛋白质进行提纯后,通常要使用透析或者凝胶过滤的方法除去中性盐[13]。

有机溶剂提取法的原理是:与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白质在水中的溶解度显著降低;而且在一定温度、pH值和离子强度下,引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同,因此,控制有机溶剂的浓度可以分离纯化蛋白质。例如,在冰浴中磁力搅拌下,在4℃预冷的培养液中缓慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,从而纯化冰核蛋白[14]。由于在室温下,有机溶剂不仅能引起蛋白质的沉淀,而且伴随着变性。因此,通常要将有机溶剂冷却,然后在不断搅拌下加入有机溶剂防止局部浓度过高,蛋白质变性问题就可以很大程度上得到解决。对于一些和脂质结合比较牢固或分子中极性侧链较多、不溶于水的蛋白质,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取,它们有一定的亲水性和较强的亲脂性,是理想的提取液。冷乙醇分离法提取免疫球蛋白最早由Cohn于1949年提出,用于制备丙种球蛋白。冷乙醇法也是目前WHO规程和中国生物制品规程推荐的方法,不仅分辨率高、提纯效果好、可同时分离多种血浆成分,而且有抑菌、清除和灭病毒的作用[15]。

萃取是分离和提纯有机化合物常用的一种方法,而双水相萃取和反胶团萃取可以用来分离蛋白质。双水相萃取技术(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下形成双水相,由于被分离物在两相中分配的不同,便可实现分离,被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。此方法可以在室温环境下进行,双水相中的聚合物还可以提高蛋白质的稳定性,收率较高。对于细胞内的蛋白质,需要先对细胞进行有效破碎。目的蛋白常分布在上相并得到浓缩,细胞碎片等固体物分布在下相中。采用双水相系统浓缩目的蛋白,受聚合物分子量及浓度、溶液pH值、离子强度、盐类型及浓度的影响[16]。

反胶团萃取法是利用反胶团将蛋白质包裹其中而达到提取蛋白质的目的。反胶团是当表面活性剂
在非极性有机溶剂溶解时自发聚集而形成的一种纳米尺寸的聚集体。这种方法的优点是萃取过程中蛋
白质因位于反胶团的内部而受到反胶团的保护。程世贤等[17]就利用反胶团萃取法提取了大豆中的蛋白质。

3.根据电荷不同进行分离纯化
根据蛋白质的电荷即酸碱性质不同分离蛋白质的方法有电泳和离子交换层析两类。
在外电场的作用下,带电颗粒(如不处于等电点状态的蛋白质分子)将向着与其电性相反的电极移动,这
种现象称为电泳。聚丙烯酰胺电泳是一种以聚丙烯酰胺为介质的区带电泳,常用于分离蛋白质。它的优点是设备简单、操作方便、样品用量少。等电聚焦是一种高分辨率的蛋白质分离技术,也可以用于蛋白质的等电点测定。利用等电聚焦技术分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质中进行的。在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦在等于其等电点的pH值梯度处形成一个窄条带。孙臣忠等[18]研究了聚丙烯酰胺电泳、等电聚焦电泳和等速提纯电泳在分离纯化蛋白质中的应用。结果发现,聚丙烯酰胺电泳的条带分辨率低,加样量不高;等电聚焦电泳分辨率最高,可以分离同种蛋白的亚成分,加样量最小;等速提纯电泳区带分辨率较高,可将样品分成单一成分,加样量最大。

离子交换层析(Ion exchange chromatography,IEC)是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中,基质由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的为阴离子交换树脂;反之为阳离子交换树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。当蛋白质处于不同的pH值条件下,其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,被留在层析柱上,通过提高洗脱液中的盐浓度,将吸附在层析柱上的蛋白质洗脱下来,其中结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。李全宏等[19]将离子交换层析应用于浓缩苹果汁中蛋白质的提纯。另外,离子交换层析还用于抗凝血蛋白的提取[7]。

4. 利用对配体的特异亲和力进行分离纯化
亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力(即生物学亲和力)建立起来的一种有效的纯化方法。它通常只需一步处理即可将目的蛋白质从复杂的混合物中分离出来,并且纯度相当高。应用亲和层析须了解纯化物质的结构和生物学特性,以便设计出最好的分离条件。近年来,亲和层析技术被广泛应用于靶标蛋白尤其是疫苗的分离纯化,特别是在融合蛋白的分离纯化上,亲和层析更是起到了举足轻重的作用,因为融合蛋白具有特异性结合能力[20]。亲和层析在基因工程亚单位疫苗的分离纯化中应用也相当广泛[21]。范继业等[22]利用壳聚糖亲和层析提取的抑肽酶比活达到71 428 BAEE·mg-1,纯化回收率达到62·5%。该方法成本较低,吸附剂价格低廉、机械强度高、抗污染能力较强、非特异性吸附较小、可反复使用、适用性广,产品质量稳定。

4. 做蛋白纯化的人主要去哪工作

蛋白质的分离纯化方法
2.1根据分子大小不同进行分离纯化
蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白
质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果
离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。
2.2 根据溶解度不同进行分离纯化

影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。

等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最
低;相反,有些蛋白质在一定pH值时很容易溶解。因而可以通过调节溶液的pH值来分离纯化蛋白质。王洪新等[8]研究茶叶蛋白质提取过程发现,pH值为时茶叶蛋白提取效果最好,提取率达到36·8%,初步纯化得率为91·0%。李殿宝[9]在从葵花脱脂粕中提取蛋白质时将蛋白溶液的pH值调到3~4,使目标蛋白于等电点沉淀出来。等电点沉淀法还应用于葡萄籽中蛋白质的提取。李凤英等[10]测得葡萄籽蛋白质的等电点为3·8。他们利用碱溶法提取葡萄籽蛋白质,得到了最佳的提取工艺为:以1×10-5mol·L-1的NaOH溶液,按1∶5的料液比,在40℃搅拌40 min,葡萄籽蛋白质提取率达73·78%。另外还可以利用碱法提取大米蛋白,其持水性、吸油性和起泡性等均优于酶法提取[11]。利用酸法提取得到的鲢鱼鱼肉蛋白质无腥味、色泽洁白,蛋白质产率高达90%[12]。
蛋白质的盐溶和盐析是中性盐显著影响球状蛋白质溶解度的现象,其中,增加蛋白质溶解度的现象称盐溶,反之为盐析。应当指出,同样浓度的二价离子中性盐,如MgCl2、(NH4)2SO4对蛋白质溶解度影响的效果,要比一价离子中性盐如NaCl、NH4Cl大得多。在葡萄籽蛋白提取工艺中除了可以利用碱溶法还可以利用盐溶法来提取蛋白质,其最佳提取工艺是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃搅拌提取30min,蛋白质提取率为57·25%[10]。盐析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸钠絮凝法、硫酸铵盐析法,其中硫酸铵盐析法广泛应用于生产。由于硫酸铵在水中呈酸性,为防止其对蛋白质的破坏,应用氨水调pH值至中性。为防止不同分子之间产生共沉淀现象,蛋白质样品的含量一般控制在0·2% ~2·0%。利用盐溶和盐析对蛋白质进行提纯后,通常要使用透析或者凝胶过滤的方法除去中性盐[13]。

有机溶剂提取法的原理是:与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白质在水中的溶解度显著降低;而且在一定温度、pH值和离子强度下,引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同,因此,控制有机溶剂的浓度可以分离纯化蛋白质。例如,在冰浴中磁力搅拌下,在4℃预冷的培养液中缓慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,从而纯化冰核蛋白[14]。由于在室温下,有机溶剂不仅能引起蛋白质的沉淀,而且伴随着变性。因此,通常要将有机溶剂冷却,然后在不断搅拌下加入有机溶剂防止局部浓度过高,蛋白质变性问题就可以很大程度上得到解决。对于一些和脂质结合比较牢固或分子中极性侧链较多、不溶于水的蛋白质,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取,它们有一定的亲水性和较强的亲脂性,是理想的提取液。冷乙醇分离法提取免疫球蛋白最早由Cohn于1949年提出,用于制备丙种球蛋白。冷乙醇法也是目前WHO规程和中国生物制品规程推荐的方法,不仅分辨率高、提纯效果好、可同时分离多种血浆成分,而且有抑菌、清除和灭病毒的作用[15]。

萃取是分离和提纯有机化合物常用的一种方法,而双水相萃取和反胶团萃取可以用来分离蛋白质。双水相萃取技术(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下形成双水相,由于被分离物在两相中分配的不同,便可实现分离,被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。此方法可以在室温环境下进行,双水相中的聚合物还可以提高蛋白质的稳定性,收率较高。对于细胞内的蛋白质,需要先对细胞进行有效破碎。目的蛋白常分布在上相并得到浓缩,细胞碎片等固体物分布在下相中。采用双水相系统浓缩目的蛋白,受聚合物分子量及浓度、溶液pH值、离子强度、盐类型及浓度的影响[16]。

反胶团萃取法是利用反胶团将蛋白质包裹其中而达到提取蛋白质的目的。反胶团是当表面活性剂
在非极性有机溶剂溶解时自发聚集而形成的一种纳米尺寸的聚集体。这种方法的优点是萃取过程中蛋
白质因位于反胶团的内部而受到反胶团的保护。程世贤等[17]就利用反胶团萃取法提取了大豆中的蛋白质。

2.3 根据电荷不同进行分离纯化
根据蛋白质的电荷即酸碱性质不同分离蛋白质的方法有电泳和离子交换层析两类。
在外电场的作用下,带电颗粒(如不处于等电点状态的蛋白质分子)将向着与其电性相反的电极移动,这
种现象称为电泳。聚丙烯酰胺电泳是一种以聚丙烯酰胺为介质的区带电泳,常用于分离蛋白质。它的优点是设备简单、操作方便、样品用量少。等电聚焦是一种高分辨率的蛋白质分离技术,也可以用于蛋白质的等电点测定。利用等电聚焦技术分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质中进行的。在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦在等于其等电点的pH值梯度处形成一个窄条带。孙臣忠等[18]研究了聚丙烯酰胺电泳、等电聚焦电泳和等速提纯电泳在分离纯化蛋白质中的应用。结果发现,聚丙烯酰胺电泳的条带分辨率低,加样量不高;等电聚焦电泳分辨率最高,可以分离同种蛋白的亚成分,加样量最小;等速提纯电泳区带分辨率较高,可将样品分成单一成分,加样量最大。

离子交换层析(Ion exchange chromatography,IEC)是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中,基质由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的为阴离子交换树脂;反之为阳离子交换树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。当蛋白质处于不同的pH值条件下,其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,被留在层析柱上,通过提高洗脱液中的盐浓度,将吸附在层析柱上的蛋白质洗脱下来,其中结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。李全宏等[19]将离子交换层析应用于浓缩苹果汁中蛋白质的提纯。另外,离子交换层析还用于抗凝血蛋白的提取[7]。

2.4 利用对配体的特异亲和力进行分离纯化
亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力(即生物学亲和力)建立起来的一种有效的纯化方法。它通常只需一步处理即可将目的蛋白质从复杂的混合物中分离出来,并且纯度相当高。应用亲和层析须了解纯化物质的结构和生物学特性,以便设计出最好的分离条件。近年来,亲和层析技术被广泛应用于靶标蛋白尤其是疫苗的分离纯化,特别是在融合蛋白的分离纯化上,亲和层析更是起到了举足轻重的作用,因为融合蛋白具有特异性结合能力[20]。亲和层析在基因工程亚单位疫苗的分离纯化中应用也相当广泛[21]。范继业等[22]利用壳聚糖亲和层析提取的抑肽酶比活达到71 428 BAEE·mg-1,纯化回收率达到62·5%。该方法成本较低,吸附剂价格低廉、机械强度高、抗污染能力较强、非特异性吸附较小、可反复使用、适用性广,产品质量稳定。
3 展望
在实际工作中,很难用单一方法实现蛋白质的分离纯化,往往要综合几种方法才能提纯出一种蛋白质。
理想的蛋白质分离提纯方法,要求产品纯度和总回收率越高越好,但实际上两者难以兼顾,因此,考虑分离
提纯的条件和方法时,不得不在两者之间作适当的选择;一般情况下,科研上更多地选择前者,工业生产上
更多地选择后者。因此,每当需要提纯某种蛋白质时,首先要明确分离纯化的目的和蛋白质的性质,以便选择最佳的分离纯化方法,从而得到理想的效果。今后,蛋白质提纯技术的发展将不断促进对蛋白质性质的研究,同时对蛋白质性质的研究也将反过来提高蛋白质分离纯化技术,两者的互相促进终将会对生命科学的进步作出重大贡献。

5. 必慧龙的主要产品系列

bifilong必慧龙营养品系列
产品覆盖人体消化系统、免疫系统、五大元素三大类别，是目前国内其它同类型品牌所无法比拟的。原料渠道坚持采用国际一线供应商配合，营养概念时刻与国际同步，让Bifilong必慧龙持续保持领先位置。严格监控产品渠道，狠抓产品品质，并定期向国际认可的检验机构提交产品检验。 木瓜酵素粉（开胃消食），天然儿童酵素粉（便秘专用 2-4小时处理便秘），活性乳酸菌营养粉（双包活埋技术，使有益菌顺利的通过强酸，强咸，维护肠道健康）木寡糖粉（用养菌的观念来替代食用外来菌）海藻钙粉（吸收率最高的天然植物钙源）黄金乳浆粉牛奶提取精华快速提升免疫力）乳铁蛋白营养粉（改善免疫系统），藻青蛋白粉（增强免疫系统）海藻DHA粉（提升脑力与眼力）天然综合营养粉（36种矿物质 补充均衡营养的）
bifilong必慧龙营养软糖系列
必慧龙软糖系列，含有多种人体所需的维生素与矿物质，均衡补充儿童所需的各种营养，不用再担心儿童挑食，营养不良，安心的做个轻松的妈妈。
多位学者、名师慎选材料精心调配，更配合先进科技制造，确保营养素组织不流失的绝佳方法。领先国际技术,利用果胶软糖糖心，外表覆上薄薄的脆皮糖衣，光滑的表面包裹膏单位营养素，让脆皮软糖同时拥有皮脆心软的特殊口感，，以及果胶软糖的柔软滑润。全程12天18道手续，能将多种营养素包覆在脆皮糖衣中，不仅可以高单位膏比例添加营养素，更可以保持营养素在生产过程中，不会因高温高热的生产过程而被破坏。 酵素也叫做酶，是催化剂，一种特殊的蛋白质，具有催化作用。代谢的合成、分解需籍由酵素的参与才能完成。本产品可催化分解食物，有利于人体对食物进行消化和吸收，补充营养，增强机体的抗病能力。
木瓜酵素功效：
其含特殊木瓜酵素,帮助代谢分解肠内蛋白质,促进排便. 酵素与细胞代谢极为密切，它有神奇的催化活力，可以把糖转变为酒精。生命体借着酵素的催化作用与调节，有效地完成生理活动，若人体细胞内缺少酵素，则生命体则出现异状。 木瓜酵素可分解蛋白质、糖类、及脂肪，其分解脂肪的能力可以说是木瓜最大的特色。细菌或霉菌等原始生命也都无法分解脂肪。 木瓜酵素不论是在酸性、碱性、甚至是中性的环境中发挥作用，不像其他的酵素仅能在单一环境中发生作用与活性。 木瓜酵素能强力分解食物或体内衰败的细胞组织或老废物，就象是感应器一样，有强力的选择性来分辨出老旧、坏死、受伤、异常的细胞蛋白质加以分解，但不会对体内正常细胞产生任何作用。换而言之，它对癌症有效。 木瓜酵素可以帮助消化，可消化比本身重 35 倍的蛋白质。现代食物因过度烹煮、化学农药、油炸食物和微波所造成较难消化的情况，而木瓜中其他的成分都有助于改善此缺失。 木瓜酵素具有解毒，根据法国研究，它可化解白喉或破伤风的毒，甚至可以将化脓症的脓液溶解，再逐渐排出体外。对烧烫伤、褥疮及顽固的异位性皮肤炎均可发挥疗效。 日本医学博士中川菜一指出木瓜酵素可改善平衡失调的机能，抑制过剩、补充不足、改善体质。它有分解脂肪的作用亦可分解血管内的中性脂肪和胆固醇。此外，分解糖的作用能够提高糖的代谢，它可重建血管、健康血液，使全身血液循环顺畅，恢复青春。 乳酸菌之王就是比菲德氏菌，可以平衡肠道内菌种生态，促进食欲与维持消化道机能，并可以排便顺畅。源自美国活性菌种：稳定性佳，高度保存乳酸菌活性。
益生菌的作用
1、维持肠道菌群的平衡
益生菌中的双歧杆菌特有的F6PPK酶（果糖-6-磷酸解酮酶）,在代谢途径中可把葡萄糖分解为醋酸和乳酸，降低肠道中的PH，抑制一些腐败菌和致病菌的生长，从而维持肠道菌群的平衡。
2、提高免疫力
它通过免疫刺激和免疫调节作用促进巨噬细胞活力;通过增强T、B淋巴细胞对抗原刺激的反应性,发挥特异性免疫作用;活化肠黏膜内的相关淋巴组织,使sIgA (分泌性免疫球蛋白)生物合成增加,提高消化道黏膜免疫功能;诱导淋巴细胞和巨噬细胞产生细胞因子,发挥免疫调节作用,从而增强机体免疫功能。
3、抗肿瘤作用
干酪乳杆菌、乳酸乳杆菌、奶油链球菌及各种双歧杆菌的菌体或酸奶上清液均具有相当强的抗肿瘤活性。研究人员在给处理组大鼠同时皮下注射氧化偶氮基甲烷(AOM)及喂饲双歧杆菌的冻干培养物后发现，与仅注射AOM 不喂饲双歧杆菌的对照组相比，处理组大鼠结肠癌的发生率、肿瘤生长时结肠肿瘤的体积以及癌组织的多形性明显减少。
4、延缓机体衰老
嗜酸乳杆菌、乳酸菌等益生菌代谢产生的乳酸可抑制肠内有害细菌产生的腐败物，使机体衰老的过程变得缓慢。益生菌可调节宿主免疫系统而起到一定的抗衰老作用,包括肠道黏膜免疫系统、体液免疫系统及细胞免疫系统。此外，在衰老过程中机体的氧化应激明显增强,氧化应激不仅会造成大分子物质如蛋白质、核酸等氧化损伤,还会对免疫系统产生有害的影响。而益生菌的抗氧化作用可能有利于维持机体免疫系统的平衡,提高免疫调控能力从而延长寿命。
5、预防心血管疾病
胆固醇含量的增加是诱发冠状动脉硬化,冠心病的重要原因。益生菌能有效减低血清中胆固醇的含量,从而预防和减少了心血管疾病的发生。益生菌主要是通过同化作用来降低胆固醇的含量,乳酸菌还有抑制胆固醇合成酶的活性,从而减少体内胆固醇的合成的作用,双歧杆菌则可减少胆固醇的体内再吸收。此外肥胖也会增加心血管疾病发生的风险，美国的肥胖率在持续增长，从1980年的15%增长到2006年的68.6%，肥胖严重威胁到了人类的健康。益生菌能通过改变肠道细菌的组成来影响减肥，增加重量的减少。以此来有效预防心血管疾病的发生。 木寡糖主要由木二糖、木三糖组成，具有低热、稳定、安全无毒的理化性能，不能被动物本身的消化酶所消化，但到达肠道后可作为有益微生物双歧杆菌的食 物，但却不能被病原微生物利用，从而促进有益微生物的繁殖和抑制有害微生物的生长。
木寡糖的作用
1、减少有毒发酵产物及有害细菌酶的产生
人体体内和活体外粪便培养试验表明，摄入3周内，机体内即可减少44.6%有毒发酵产物和40.9%的有害细菌酶的产生。
2、抑制病原菌和腹泻
低聚木糖对病原菌有较强的吸附力，如大肠杆菌、肠炎门氏菌、肺炎克雷伯氏菌、嗜水气单胞菌等都能吸附到低聚木糖上，由于低聚木糖不被肠道中的消化酶所降解，可携带附着的病原菌通过肠道排出体外，从而防止疾病在肠道中集群，达到防止腹泻的目的。
3、防止便秘
双歧杆菌利用低聚木糖，产生大量的短链脂肪酸；能刺激肠道蠕动，增加粪便湿润度，并保持一定的渗透压，从而防止便秘发生。
4、保护肝脏功能
摄入低聚木糖，可减少有毒代谢产物形成，大大减少了肝脏分解毒素的负担。
5、降低血清胆固醇
摄入低聚木糖，持续2周至3个月，总血清胆固醇可降低20—50dl。还可提高女性血清中多密度脂蛋白胆固醇占总胆固醇的比率。
6、降低血压
研究表明，46个高血脂患者摄入低聚木糖持续5周后，其心脏舒张压平均下降了799.8Pa（6mmHg）。结果显示，人的心脏舒张压的高低与其粪便中双歧杆菌占总菌数的比率呈明显的负相关关系。
7、能增强机体免疫力，抗癌。
经大量试验结果表明，双歧杆菌在肠道内大量繁殖能够起到抗癌作用。这种抗癌作用归功于双歧杆菌的细胞、细胞壁成分和胞外分泌物，使机体免疫力提高。
8、具有良好的配伍性
研究表明，日常饮食中摄取少量的低聚木糖，便能体现出保健效果，当低聚木糖与钙同时摄入时，它不但不会影响机体对钙的吸收，反而能起促进作用，试验结果表明，任意摄取2%低聚木糖水溶液，7日后机体对Ca的保留率提高了21%。
9、能促使机体生成多种营养物质，包括维生素B1、B2、B6、B12、烟酸和叶酸。
10、预防和保护牙齿龋变，抑制口腔病菌的滋生。
龋齿是由于口腔微生物特别是链球菌侵蚀而引起的，低聚木糖不是这些口腔微生物的合适作用底物，因此不会引起牙齿龋变，从而抑制口腔病菌的生长。 纯植物提取膳食纤维，是一种不能被人体消化的碳水化合物，具有吸水、粘滞、结合有机化合物、阳离子交换、细菌发酵等多种作用。促进肠道蠕动，减少胀气 改善便秘。
儿童天然酵素的主要成份膳食纤维，是一种不易被消化的食物营养素，主要来自于植物的细胞壁，包含纤维素、半纤维素、树脂、果胶及木质素等。
膳食纤维的主要特性：1.吸水作用。膳食纤维有很强的吸水能力或与水结合的能力。此作用可使肠道中粪便的体积增大，加快其转运速度，减少其中有害物质接触肠壁的时间。 2.粘滞作用。一些膳食纤维具有很强的黏滞性，能形成粘液型溶液，包括果胶、树胶、海藻多糖等。 结合有机化合物作用。膳食纤维具有结合胆酸和胆固醇的作用。 阳离子交换作用。其作用与糖醛酸的羧基有关，可在胃肠内结合无机盐，如钾、钠、铁等阳离子形成膳食纤维复合物，影响其吸收。 细菌发酵作用。膳食纤维在肠道易被细菌酵解，其中可溶性纤维可完全被细菌酵解，而不溶性膳食纤维则不易被酵解。而酵解后产生的短链脂肪酸如乙酯酸、丙酯酸和丁酯酸均可作为肠道细胞和细菌的能量来源。 膳食纤维的主要功效： 防治便秘：膳食纤维体积大，可促进肠蠕动、减少食物在肠道中停留时间，其中的水份不容易被吸收。另一方面，膳食纤维在大肠内经细菌发酵，直接吸收纤维中的水份，使大便变软，产生通便作用。 利于减肥：一般肥胖人大都与食物中热能摄入增加或体力活动减少有关。而提高膳食纤维含量，可使摄入的热能减少，在肠道内营养的消化吸收也下降，最终使体内脂肪消耗而起减肥作用。橘寒天中的膳食纤维遇水膨胀200-250倍既可以使人产生轻微的饱腹感，减少过多热量的吸收。又可以包覆多余糖分和油脂随同肠道内的老旧沉积废物一同排出体外。可以说是目前较有效的最安全的减肥方法。蔬菜中含大量膳食纤维。 预防结肠和直肠癌：这两种癌的发生主要与致癌物质在肠道内停留时间长，和肠壁长期接触有关。增加膳食中纤维含量，使致癌物质浓度相对降低，加上膳食纤维有刺激肠蠕动作用，致癌物质与肠壁接触时间大大缩短。四、防治痔疮：痔疮的发生是因为大便秘结而使血液长期阻滞与瘀积所引 起的。由于膳食纤维的通便作用，可降低肛门周围的压力，使血流通畅，从而起防治痔疮的作用。 降低血脂，预防冠心病：由于膳食纤维中有些成分如果胶可结合胆固醇，木质素可结合胆酸，使其直接从粪便中排出，从而消耗体内的胆固醇来补充胆汁中被消耗的胆固醇，由此降低了胆固醇，从而有预防冠心病的作用。 改善糖尿病症状：膳食纤维中的果胶可延长食物在肠内的停留时间、降低葡萄糖的吸收速度，使进餐后血糖不会急剧上升，有利于糖尿病病情的改善。 改善口腔及牙齿功能：现代人由于食物越来越精，越柔软，使用口腔肌肉牙齿的机会越来越少，因此，牙齿脱落，龋齿出现的情况越来越多。而增加膳食纤维素，自然增加了使用口腔肌肉牙齿咀嚼的机会，长期下去则会使口腔得到保健，功能得以改善。 防治胆结石：胆结石的形成与胆汁胆固醇含量过高有关，由于膳食纤维可结合胆固醇，促进胆汁的分泌、循环。因而可预防胆结石的形成。有人每天给病人增加20－30克的谷皮纤维，一月后即可发现胆结石缩小，这与胆汁流动通畅有关。 预防妇女乳腺癌：据流行病学发现，乳腺癌的发生与膳食中高脂肪、高糖、高肉类及低膳食纤维摄入有关。因为体内过多的脂肪促进某些激素的合成，形成激素之间的不平衡，使乳房内激素水平上升所造成。所以酵素纤维可以预防和改善妇女乳泉癌。 从5,000毫升的新鲜生牛乳萃取出最接近母乳成分的乳浆蛋白10克。萃取出富含多种活性免疫因子，以确保在人体内的高吸收率以及功效，在短期内可重启免疫系统。有效预防及保护婴幼儿，减少生病机会，提高婴幼儿抵抗疾病的能力。有效改善过敏，体质虚弱。
黄金乳浆蛋白与母乳有九成相同萃取自天然无污染的新鲜乳浆，以专利技术去除酪蛋白、乳糖、脂肪、灰质、水分后，从5,000毫升的新鲜生牛乳萃取出最接近母乳成分的乳浆蛋白10克。萃取出来的是具有生物活性(bio-active)的蛋白质，以确保在人体内的高吸收率以及功效。这些特殊挑选的蛋白质是人体内重要物质GSH榖胱甘肽(榖胱甘肽/乳铁蛋白/乳球蛋白/乳白蛋白/免疫球蛋白)的最佳来源，能快速补充每日流失的GSH，维持理想浓度。 根据研究结果显示，黄金乳浆一个月，可增加体内GSH浓度高达35.5%，对于免疫机能差的人，如：婴幼儿、老年人、身体虚弱的人，效果尤其明显。
黄金乳浆的重要物质：榖胱甘肽/乳铁蛋白/乳白蛋白/血清白蛋白/免疫球蛋白
榖胱甘肽：存在于几乎身体的每一个细胞。谷胱甘肽能帮助保持正常的免疫系统的功能，并具有抗氧化作用和整合解毒作用。不仅能消除人体自由基，还可以提高人体免疫力。谷胱甘肽维护健康，抗衰老，在老人迟缓化的细胞上所发挥的功效比年轻人大。还可以保护血红蛋白不受过氧化氢氧化、自由基等氧化从而使它持续正常发挥运输氧的能力。红细胞中部分血红蛋白在过氧化氢等氧化剂的作用下，其中二价铁氧化为三价铁，使血红蛋白转变为高铁血红蛋白，从而失去了带氧能力。
乳铁蛋白：母乳中极重要的成份，可调节铁的吸收，抑制细菌的生长，促进有益菌如双歧杆菌的生长，帮助婴幼儿建立良好的消化道微生物环境，以及治疗婴幼儿腹泻等的问题，此外对于抵抗发炎、抵抗病毒，对数种癌症有治疗作用。
乳白蛋白：乳浆蛋白中含量第二高的蛋白质。含有许多的必须胺基酸，能结合钙质，并能帮助睡眠。其很强的抗病毒能力，已经被广泛用于预防手足口病中。
血清白蛋白：亦含有大量的必须胺基酸，能够保护细胞预防氧化，减少自体免疫疾病的发生，减少突变的机率，约占乳浆蛋白的5-10%。
免疫球蛋白：对初生儿提供免疫促进效果，经过公认对新生儿有防病作用，约占乳浆蛋白的10-15%。
乳浆蛋白是GSH(榖胱甘肽)的重要来源
乳浆蛋白除了含有以上诸种优质蛋白，让婴幼儿在生长过程中得到丰富的营养以及保护外，更重要的，乳浆蛋白也是细胞内GSH的主要来源。GSH这个分子是所有的孩子出生时细胞内就有的免疫物质，后来因为环境的污染、药物的残留、或细菌的感染，而造成GSH的消耗。母乳中的乳浆蛋白是GSH最佳的来源，帮助孩童在生长过程中得到应有的补充，不至于缺乏而造成疾病。
在经过特殊技术浓缩后，使婴幼儿容易吸收，得到像喝母乳一般的益处！乳浆蛋白浓缩物与一般婴幼儿乳品不同在于第一，两者所含的蛋白质种类、蛋白质含量，皆与实际的母乳类似；其次，它的蛋白质有着最原始的型态。因为母乳是未经加工的天然食物，有着人体容易吸收的特性，这样的特性往往会在乳制品的加工中被破坏，造成不易吸收的缺点。但是乳浆蛋白浓缩物是以特殊的专利技术制造，保留了最原始的蛋白质型态，容易被肠胃吸收，就像母乳一样具有肠胃吸收的特性。 吸收率最高的天然植物钙粉
海藻钙产于爱尔兰西南沿海的大西洋，为纯净无污染的海域海藻，富含钙质及人体必需74种矿物质与微量元素，利用欧洲先进的技术提取，粉沫细度达3000目以上，溶解度高易吸收。
① 由于海藻钙的蜂窝型多孔状结构，缓冲效果极佳。并提高人体消化吸收能力而且中和胃酸的效果显著。
② 海藻钙的蜂窝型多孔状结构，容易在肠胃中迅速溶解和离子化，因此消化吸收率与生体利用率较高。钙在胃中溶解离子化后，主要在小肠中被吸收，因此胃部pH环境中的离子化机率越高，钙的吸收率也就越高。(空腹状态下，胃的pH值为1.5-2，吸收食物后达到2.5左右)。
③ 胃部的pH值在1.5的情况下，海藻钙离子化率最高可达到96%此时，消化吸收率与生体利用率亦最高。
④ 富含天然镁(Mg)：可提高钙的体内吸收率。维他命D3： 提高在小肠内钙的吸收率。酪蛋白磷酸肽(CPP)：使小肠下部的钙维持可溶性状态进而促进吸收。
脑黄金 聪明的脂肪酸－DHA / ARA海藻DHA是属于植物性脂肪酸，天然无污染、腥味比较淡，口感较好；EPA含量无或极低。海藻油也是唯一获得美国食品与药品管理局认可的儿童DHA补充剂来源。所以在婴幼儿、孕妇选择海藻DHA产品为好。
增进大脑细胞之发育在大脑皮质中，DHA是神经传导细胞的主要成份，亦是细胞膜形成的主要成份。
DHA与胎儿发育
胎儿在母体中即开始累积DHA于大脑中，其中以产前三个月及出生后三个月中累积速度最快，而胎儿之DHA是来自母体所供给的营养，而出生后，婴儿则需由饮食中摄取，新生儿若喂予母乳则会比喂予婴儿奶粉者得到更多的DHA，使得宝宝更聪明。充分地提高记忆及学习能力。
消炎抗过敏
由于DHA抑制发炎前驱物质的形成，所以有消炎及抗过敏作用。降低血脂肪、预防心脏血管疾病。
玉米黄素
玉米黄素是维生素A的前躯物，同样对人体眼睛的水晶体、视网膜及黄斑部有重要功能，它一样能过滤紫外线的蓝光谱，避免自由基的伤害。我们常听人说多吃枸杞有明目的功效，正因枸杞子中含有大量的玉米黄素，可集中在黄斑部，达成护眼效果。达到预防假性近视跟维持眼部的视力效果。
蓝莓
提炼出丰富的花青素，研究上发现这些花青素可以减缓视力的丧失，预防或是延缓眼睛相关的疾病，像是视网膜黄斑变性疾病、白内障、近视、远视、眼睛乾燥和感染，特别是和视网膜相关的疾病。蓝莓含有特别的抗氧化剂，称类胡萝卜素(黄体素、玉米黄素等)，黄酮类化合物(像是芦丁、槲皮素等等)，也含有像是维他命C、维他命E和维他命A、硒、锌、磷，这些都是有益于眼睛视力的健康。

6. 对生物制药工艺这门课的评价。100字左右。谢谢各位！

名词解释：
1， 错流过滤与亲和错流过滤
2， 多级错流萃取与多级逆流萃取
3， 萃取与反萃取
4， 萃取因素与分离因素
5， 盐析
6， 全排阻，全渗入
7， 类分离与分级分离
8， 吸附分离
9， 亲和纯化
10， 凝聚与絮凝
11， 重结晶
问答题：
为什么要进行生物材料预处理
萃取溶剂的原则
阴离子交换树脂的平衡与再生方法
单级，多级萃取过程（课本P136~137）

一、 蛋白质分离方法
1.根据分子大小不同进行分离纯化
蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果
离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。
2.根据溶解度不同进行分离纯化
影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。

等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最低;相反,有些蛋白质在一定pH值时很容易溶解。因而可以通过调节溶液的pH值来分离纯化蛋白质。王洪新等[8]研究茶叶蛋白质提取过程发现,pH值为时茶叶蛋白提取效果最好,提取率达到36•8%,初步纯化得率为91•0%。李殿宝[9]在从葵花脱脂粕中提取蛋白质时将蛋白溶液的pH值调到3~4,使目标蛋白于等电点沉淀出来。等电点沉淀法还应用于葡萄籽中蛋白质的提取。李凤英等[10]测得葡萄籽蛋白质的等电点为3•8。他们利用碱溶法提取葡萄籽蛋白质,得到了最佳的提取工艺为:以1×10-5mol•L-1的NaOH溶液,按1∶5的料液比,在40℃搅拌40 min,葡萄籽蛋白质提取率达73•78%。另外还可以利用碱法提取大米蛋白,其持水性、吸油性和起泡性等均优于酶法提取[11]。利用酸法提取得到的鲢鱼鱼肉蛋白质无腥味、色泽洁白,蛋白质产率高达90%[12]。
蛋白质的盐溶和盐析是中性盐显著影响球状蛋白质溶解度的现象,其中,增加蛋白质溶解度的现象称盐溶,反之为盐析。应当指出,同样浓度的二价离子中性盐,如MgCl2、(NH4)2SO4对蛋白质溶解度影响的效果,要比一价离子中性盐如NaCl、NH4Cl大得多。在葡萄籽蛋白提取工艺中除了可以利用碱溶法还可以利用盐溶法来提取蛋白质,其最佳提取工艺是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃搅拌提取30min,蛋白质提取率为57•25%[10]。盐析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸钠絮凝法、硫酸铵盐析法,其中硫酸铵盐析法广泛应用于生产。由于硫酸铵在水中呈酸性,为防止其对蛋白质的破坏,应用氨水调pH值至中性。为防止不同分子之间产生共沉淀现象,蛋白质样品的含量一般控制在0•2% ~2•0%。利用盐溶和盐析对蛋白质进行提纯后,通常要使用透析或者凝胶过滤的方法除去中性盐[13]。

有机溶剂提取法的原理是:与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白质在水中的溶解度显著降低;而且在一定温度、pH值和离子强度下,引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同,因此,控制有机溶剂的浓度可以分离纯化蛋白质。例如,在冰浴中磁力搅拌下,在4℃预冷的培养液中缓慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,从而纯化冰核蛋白[14]。由于在室温下,有机溶剂不仅能引起蛋白质的沉淀,而且伴随着变性。因此,通常要将有机溶剂冷却,然后在不断搅拌下加入有机溶剂防止局部浓度过高,蛋白质变性问题就可以很大程度上得到解决。对于一些和脂质结合比较牢固或分子中极性侧链较多、不溶于水的蛋白质,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取,它们有一定的亲水性和较强的亲脂性,是理想的提取液。冷乙醇分离法提取免疫球蛋白最早由Cohn于1949年提出,用于制备丙种球蛋白。冷乙醇法也是目前WHO规程和中国生物制品规程推荐的方法,不仅分辨率高、提纯效果好、可同时分离多种血浆成分,而且有抑菌、清除和灭病毒的作用[15]。

萃取是分离和提纯有机化合物常用的一种方法,而双水相萃取和反胶团萃取可以用来分离蛋白质。双水相萃取技术(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下形成双水相,由于被分离物在两相中分配的不同,便可实现分离,被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。此方法可以在室温环境下进行,双水相中的聚合物还可以提高蛋白质的稳定性,收率较高。对于细胞内的蛋白质,需要先对细胞进行有效破碎。目的蛋白常分布在上相并得到浓缩,细胞碎片等固体物分布在下相中。采用双水相系统浓缩目的蛋白,受聚合物分子量及浓度、溶液pH值、离子强度、盐类型及浓度的影响[16]。

反胶团萃取法是利用反胶团将蛋白质包裹其中而达到提取蛋白质的目的。反胶团是当表面活性剂在非极性有机溶剂溶解时自发聚集而形成的一种纳米尺寸的聚集体。这种方法的优点是萃取过程中蛋白质因位于反胶团的内部而受到反胶团的保护。程世贤等[17]就利用反胶团萃取法提取了大豆中的蛋白质。

3.根据电荷不同进行分离纯化
根据蛋白质的电荷即酸碱性质不同分离蛋白质的方法有电泳和离子交换层析两类。
在外电场的作用下,带电颗粒(如不处于等电点状态的蛋白质分子)将向着与其电性相反的电极移动,这种现象称为电泳。聚丙烯酰胺电泳是一种以聚丙烯酰胺为介质的区带电泳,常用于分离蛋白质。它的优点是设备简单、操作方便、样品用量少。等电聚焦是一种高分辨率的蛋白质分离技术,也可以用于蛋白质的等电点测定。利用等电聚焦技术分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质中进行的。在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦在等于其等电点的pH值梯度处形成一个窄条带。孙臣忠等[18]研究了聚丙烯酰胺电泳、等电聚焦电泳和等速提纯电泳在分离纯化蛋白质中的应用。结果发现,聚丙烯酰胺电泳的条带分辨率低,加样量不高;等电聚焦电泳分辨率最高,可以分离同种蛋白的亚成分,加样量最小;等速提纯电泳区带分辨率较高,可将样品分成单一成分,加样量最大。

离子交换层析(Ion exchange chromatography,IEC)是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中,基质由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的为阴离子交换树脂;反之为阳离子交换树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。当蛋白质处于不同的pH值条件下,其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,被留在层析柱上,通过提高洗脱液中的盐浓度,将吸附在层析柱上的蛋白质洗脱下来,其中结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。李全宏等[19]将离子交换层析应用于浓缩苹果汁中蛋白质的提纯。另外,离子交换层析还用于抗凝血蛋白的提取[7]。

4. 利用对配体的特异亲和力进行分离纯化
亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力(即生物学亲和力)建立起来的一种有效的纯化方法。它通常只需一步处理即可将目的蛋白质从复杂的混合物中分离出来,并且纯度相当高。应用亲和层析须了解纯化物质的结构和生物学特性,以便设计出最好的分离条件。近年来,亲和层析技术被广泛应用于靶标蛋白尤其是疫苗的分离纯化,特别是在融合蛋白的分离纯化上,亲和层析更是起到了举足轻重的作用,因为融合蛋白具有特异性结合能力[20]。亲和层析在基因工程亚单位疫苗的分离纯化中应用也相当广泛[21]。范继业等[22]利用壳聚糖亲和层析提取的抑肽酶比活达到71 428 BAEE•mg-1,纯化回收率达到62•5%。该方法成本较低,吸附剂价格低廉、机械强度高、抗污染能力较强、非特异性吸附较小、可反复使用、适用性广,产品质量稳定。

7. 蛋白质的分离方法

1.根据分子大小不同进行分离纯化
蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离。根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等。透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法。透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离。超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程。这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开。它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐。由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小。所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果
离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法。当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开。例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3]。使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心。常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度。可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度。密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低。蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白。凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一。凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外。目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等。在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1]。凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]。

2.根据溶解度不同进行分离纯化
影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等。但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的。常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等。

等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法。每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最低;相反,有些蛋白质在一定pH值时很容易溶解。因而可以通过调节溶液的pH值来分离纯化蛋白质。王洪新等[8]研究茶叶蛋白质提取过程发现,pH值为时茶叶蛋白提取效果最好,提取率达到36·8%,初步纯化得率为91·0%。李殿宝[9]在从葵花脱脂粕中提取蛋白质时将蛋白溶液的pH值调到3~4,使目标蛋白于等电点沉淀出来。等电点沉淀法还应用于葡萄籽中蛋白质的提取。李凤英等[10]测得葡萄籽蛋白质的等电点为3·8。他们利用碱溶法提取葡萄籽蛋白质,得到了最佳的提取工艺为:以1×10-5mol·L-1的NaOH溶液,按1∶5的料液比,在40℃搅拌40 min,葡萄籽蛋白质提取率达73·78%。另外还可以利用碱法提取大米蛋白,其持水性、吸油性和起泡性等均优于酶法提取[11]。利用酸法提取得到的鲢鱼鱼肉蛋白质无腥味、色泽洁白,蛋白质产率高达90%[12]。
蛋白质的盐溶和盐析是中性盐显著影响球状蛋白质溶解度的现象,其中,增加蛋白质溶解度的现象称盐溶,反之为盐析。应当指出,同样浓度的二价离子中性盐,如MgCl2、(NH4)2SO4对蛋白质溶解度影响的效果,要比一价离子中性盐如NaCl、NH4Cl大得多。在葡萄籽蛋白提取工艺中除了可以利用碱溶法还可以利用盐溶法来提取蛋白质,其最佳提取工艺是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃搅拌提取30min,蛋白质提取率为57·25%[10]。盐析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸钠絮凝法、硫酸铵盐析法,其中硫酸铵盐析法广泛应用于生产。由于硫酸铵在水中呈酸性,为防止其对蛋白质的破坏,应用氨水调pH值至中性。为防止不同分子之间产生共沉淀现象,蛋白质样品的含量一般控制在0·2% ~2·0%。利用盐溶和盐析对蛋白质进行提纯后,通常要使用透析或者凝胶过滤的方法除去中性盐[13]。

有机溶剂提取法的原理是:与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白质在水中的溶解度显著降低;而且在一定温度、pH值和离子强度下,引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同,因此,控制有机溶剂的浓度可以分离纯化蛋白质。例如,在冰浴中磁力搅拌下,在4℃预冷的培养液中缓慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,从而纯化冰核蛋白[14]。由于在室温下,有机溶剂不仅能引起蛋白质的沉淀,而且伴随着变性。因此,通常要将有机溶剂冷却,然后在不断搅拌下加入有机溶剂防止局部浓度过高,蛋白质变性问题就可以很大程度上得到解决。对于一些和脂质结合比较牢固或分子中极性侧链较多、不溶于水的蛋白质,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取,它们有一定的亲水性和较强的亲脂性,是理想的提取液。冷乙醇分离法提取免疫球蛋白最早由Cohn于1949年提出,用于制备丙种球蛋白。冷乙醇法也是目前WHO规程和中国生物制品规程推荐的方法,不仅分辨率高、提纯效果好、可同时分离多种血浆成分,而且有抑菌、清除和灭病毒的作用[15]。

萃取是分离和提纯有机化合物常用的一种方法,而双水相萃取和反胶团萃取可以用来分离蛋白质。双水相萃取技术(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下形成双水相,由于被分离物在两相中分配的不同,便可实现分离,被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取。此方法可以在室温环境下进行,双水相中的聚合物还可以提高蛋白质的稳定性,收率较高。对于细胞内的蛋白质,需要先对细胞进行有效破碎。目的蛋白常分布在上相并得到浓缩,细胞碎片等固体物分布在下相中。采用双水相系统浓缩目的蛋白,受聚合物分子量及浓度、溶液pH值、离子强度、盐类型及浓度的影响[16]。

反胶团萃取法是利用反胶团将蛋白质包裹其中而达到提取蛋白质的目的。反胶团是当表面活性剂在非极性有机溶剂溶解时自发聚集而形成的一种纳米尺寸的聚集体。这种方法的优点是萃取过程中蛋白质因位于反胶团的内部而受到反胶团的保护。程世贤等[17]就利用反胶团萃取法提取了大豆中的蛋白质。

3.根据电荷不同进行分离纯化
根据蛋白质的电荷即酸碱性质不同分离蛋白质的方法有电泳和离子交换层析两类。
在外电场的作用下,带电颗粒(如不处于等电点状态的蛋白质分子)将向着与其电性相反的电极移动,这种现象称为电泳。聚丙烯酰胺电泳是一种以聚丙烯酰胺为介质的区带电泳,常用于分离蛋白质。它的优点是设备简单、操作方便、样品用量少。等电聚焦是一种高分辨率的蛋白质分离技术,也可以用于蛋白质的等电点测定。利用等电聚焦技术分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质中进行的。在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦在等于其等电点的pH值梯度处形成一个窄条带。孙臣忠等[18]研究了聚丙烯酰胺电泳、等电聚焦电泳和等速提纯电泳在分离纯化蛋白质中的应用。结果发现,聚丙烯酰胺电泳的条带分辨率低,加样量不高;等电聚焦电泳分辨率最高,可以分离同种蛋白的亚成分,加样量最小;等速提纯电泳区带分辨率较高,可将样品分成单一成分,加样量最大。

离子交换层析(Ion exchange chromatography,IEC)是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法。离子交换层析中,基质由带有电荷的树脂或纤维素组成。带有正电荷的为阴离子交换树脂;反之为阳离子交换树脂。离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化。当蛋白质处于不同的pH值条件下,其带电状况也不同。阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,被留在层析柱上,通过提高洗脱液中的盐浓度,将吸附在层析柱上的蛋白质洗脱下来,其中结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来。反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来。李全宏等[19]将离子交换层析应用于浓缩苹果汁中蛋白质的提纯。另外,离子交换层析还用于抗凝血蛋白的提取[7]。

4. 利用对配体的特异亲和力进行分离纯化
亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力(即生物学亲和力)建立起来的一种有效的纯化方法。它通常只需一步处理即可将目的蛋白质从复杂的混合物中分离出来,并且纯度相当高。应用亲和层析须了解纯化物质的结构和生物学特性,以便设计出最好的分离条件。近年来,亲和层析技术被广泛应用于靶标蛋白尤其是疫苗的分离纯化,特别是在融合蛋白的分离纯化上,亲和层析更是起到了举足轻重的作用,因为融合蛋白具有特异性结合能力[20]。亲和层析在基因工程亚单位疫苗的分离纯化中应用也相当广泛[21]。范继业等[22]利用壳聚糖亲和层析提取的抑肽酶比活达到71 428 BAEE·mg-1,纯化回收率达到62·5%。该方法成本较低,吸附剂价格低廉、机械强度高、抗污染能力较强、非特异性吸附较小、可反复使用、适用性广,产品质量稳定。

8. 蛋白质分离方法有哪些，它们的特点各是什么

1.根据分子大小不同进行分离纯化 蛋白质是一种大分子物质,并且不同蛋白质的分子大小不同,因此可以利用一些较简单的方法使蛋白 质和小分子物质分开,并使蛋白质混合物也得到分离.根据蛋白质分子大小不同进行分离的方法主要有透析、超滤、离心和凝胶过滤等.透析和超滤是分离蛋白质时常用的方法.透析是将待分离的混合物放入半透膜制成的透析袋中,再浸入透析液进行分离.超滤是利用离心力或压力强行使水和其它小分子通过半透膜,而蛋白质被截留在半透膜上的过程.这两种方法都可以将蛋白质大分子与以无机盐为主的小分子分开.它们经常和盐析、盐溶方法联合使用,在进行盐析或盐溶后可以利用这两种方法除去引入的无机盐.由于超滤过程中,滤膜表面容易被吸附的蛋白质堵塞,以致超滤速度减慢,截流物质的分子量也越来越小.所以在使用超滤方法时要选择合适的滤膜,也可以选择切向流过滤得到更理想的效果 离心也是经常和其它方法联合使用的一种分离蛋白质的方法.当蛋白质和杂质的溶解度不同时可以利用离心的方法将它们分开.例如,在从大米渣中提取蛋白质的实验中,加入纤维素酶和α-淀粉酶进行预处理后,再用离心的方法将有用物质与分解掉的杂质进行初步分离[3].使蛋白质在具有密度梯度的介质中离心的方法称为密度梯度(区带)离心.常用的密度梯度有蔗糖梯度、聚蔗糖梯度和其它合成材料的密度梯度.可以根据所需密度和渗透压的范围选择合适的密度梯度.密度梯度离心曾用于纯化苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白,得到的产品纯度高但产量偏低.蒋辰等[6]通过比较不同密度梯度介质的分离效果,利用溴化钠密度梯度得到了高纯度的苏云金芽孢杆菌伴孢晶体蛋白.凝胶过滤也称凝胶渗透层析,是根据蛋白质分子大小不同分离蛋白质最有效的方法之一.凝胶过滤的原理是当不同蛋白质流经凝胶层析柱时,比凝胶珠孔径大的分子不能进入珠内网状结构,而被排阻在凝胶珠之外,随着溶剂在凝胶珠之间的空隙向下运动并最先流出柱外;反之,比凝胶珠孔径小的分子后流出柱外.目前常用的凝胶有交联葡聚糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶等.在甘露糖蛋白提纯的过程中使用凝胶过滤方法可以得到很好的效果,纯度鉴定证明产品为分子量约为32 kDa、成分是多糖∶蛋白质(88∶12)、多糖为甘露糖的单一均匀糖蛋白[1].凝胶过滤在抗凝血蛋白的提取过程中也被用来除去大多数杂蛋白及小分子的杂质[7]. 2.根据溶解度不同进行分离纯化 影响蛋白质溶解度的外部条件有很多,比如溶液的pH值、离子强度、介电常数和温度等.但在同一条件下,不同的蛋白质因其分子结构的不同而有不同的溶解度,根据蛋白质分子结构的特点,适当地改变外部条件,就可以选择性地控制蛋白质混合物中某一成分的溶解度,达到分离纯化蛋白质的目的.常用的方法有等电点沉淀和pH值调节、蛋白质的盐溶和盐析、有机溶剂法、双水相萃取法、反胶团萃取法等. 等电点沉淀和pH值调节是最常用的方法.每种蛋白质都有自己的等电点,而且在等电点时溶解度最 低;相反,有些蛋白质在一定pH值时很容易溶解.因而可以通过调节溶液的pH值来分离纯化蛋白质.王洪新等[8]研究茶叶蛋白质提取过程发现,pH值为时茶叶蛋白提取效果最好,提取率达到36·8%,初步纯化得率为91·0%.李殿宝[9]在从葵花脱脂粕中提取蛋白质时将蛋白溶液的pH值调到3~4,使目标蛋白于等电点沉淀出来.等电点沉淀法还应用于葡萄籽中蛋白质的提取.李凤英等[10]测得葡萄籽蛋白质的等电点为3·8.他们利用碱溶法提取葡萄籽蛋白质,得到了最佳的提取工艺为:以1×10-5mol·L-1的NaOH溶液,按1∶5的料液比,在40℃搅拌40 min,葡萄籽蛋白质提取率达73·78%.另外还可以利用碱法提取大米蛋白,其持水性、吸油性和起泡性等均优于酶法提取[11].利用酸法提取得到的鲢鱼鱼肉蛋白质无腥味、色泽洁白,蛋白质产率高达90%[12]. 蛋白质的盐溶和盐析是中性盐显著影响球状蛋白质溶解度的现象,其中,增加蛋白质溶解度的现象称盐溶,反之为盐析.应当指出,同样浓度的二价离子中性盐,如MgCl2、(NH4)2SO4对蛋白质溶解度影响的效果,要比一价离子中性盐如NaCl、NH4Cl大得多.在葡萄籽蛋白提取工艺中除了可以利用碱溶法还可以利用盐溶法来提取蛋白质,其最佳提取工艺是:以10%NaCl溶液,按1∶25的料液比,在30℃搅拌提取30min,蛋白质提取率为57·25%[10].盐析是提取血液中免疫球蛋白的常用方法,如多聚磷酸钠絮凝法、硫酸铵盐析法,其中硫酸铵盐析法广泛应用于生产.由于硫酸铵在水中呈酸性,为防止其对蛋白质的破坏,应用氨水调pH值至中性.为防止不同分子之间产生共沉淀现象,蛋白质样品的含量一般控制在0·2% ~2·0%.利用盐溶和盐析对蛋白质进行提纯后,通常要使用透析或者凝胶过滤的方法除去中性盐[13]. 有机溶剂提取法的原理是:与水互溶的有机溶剂(如甲醇、乙醇)能使一些蛋白质在水中的溶解度显著降低;而且在一定温度、pH值和离子强度下,引起蛋白质沉淀的有机溶剂的浓度不同,因此,控制有机溶剂的浓度可以分离纯化蛋白质.例如,在冰浴中磁力搅拌下,在4℃预冷的培养液中缓慢加入乙醇(-25℃),可以使冰核蛋白析出,从而纯化冰核蛋白[14].由于在室温下,有机溶剂不仅能引起蛋白质的沉淀,而且伴随着变性.因此,通常要将有机溶剂冷却,然后在不断搅拌下加入有机溶剂防止局部浓度过高,蛋白质变性问题就可以很大程度上得到解决.对于一些和脂质结合比较牢固或分子中极性侧链较多、不溶于水的蛋白质,可以用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂提取,它们有一定的亲水性和较强的亲脂性,是理想的提取液.冷乙醇分离法提取免疫球蛋白最早由Cohn于1949年提出,用于制备丙种球蛋白.冷乙醇法也是目前WHO规程和中国生物制品规程推荐的方法,不仅分辨率高、提纯效果好、可同时分离多种血浆成分,而且有抑菌、清除和灭病毒的作用[15]. 萃取是分离和提纯有机化合物常用的一种方法,而双水相萃取和反胶团萃取可以用来分离蛋白质.双水相萃取技术(Aqueous two phase extraction,ATPE)是指亲水性聚合物水溶液在一定条件下形成双水相,由于被分离物在两相中分配的不同,便可实现分离,被广泛用于生物化学、细胞生物学和生物化工等领域的产品分离和提取.此方法可以在室温环境下进行,双水相中的聚合物还可以提高蛋白质的稳定性,收率较高.对于细胞内的蛋白质,需要先对细胞进行有效破碎.目的蛋白常分布在上相并得到浓缩,细胞碎片等固体物分布在下相中.采用双水相系统浓缩目的蛋白,受聚合物分子量及浓度、溶液pH值、离子强度、盐类型及浓度的影响[16]. 反胶团萃取法是利用反胶团将蛋白质包裹其中而达到提取蛋白质的目的.反胶团是当表面活性剂 在非极性有机溶剂溶解时自发聚集而形成的一种纳米尺寸的聚集体.这种方法的优点是萃取过程中蛋 白质因位于反胶团的内部而受到反胶团的保护.程世贤等[17]就利用反胶团萃取法提取了大豆中的蛋白质. 3.根据电荷不同进行分离纯化 根据蛋白质的电荷即酸碱性质不同分离蛋白质的方法有电泳和离子交换层析两类. 在外电场的作用下,带电颗粒(如不处于等电点状态的蛋白质分子)将向着与其电性相反的电极移动,这 种现象称为电泳.聚丙烯酰胺电泳是一种以聚丙烯酰胺为介质的区带电泳,常用于分离蛋白质.它的优点是设备简单、操作方便、样品用量少.等电聚焦是一种高分辨率的蛋白质分离技术,也可以用于蛋白质的等电点测定.利用等电聚焦技术分离蛋白质混合物是在具有pH梯度的介质中进行的.在外电场作用下各种蛋白质将移向并聚焦在等于其等电点的pH值梯度处形成一个窄条带.孙臣忠等[18]研究了聚丙烯酰胺电泳、等电聚焦电泳和等速提纯电泳在分离纯化蛋白质中的应用.结果发现,聚丙烯酰胺电泳的条带分辨率低,加样量不高;等电聚焦电泳分辨率最高,可以分离同种蛋白的亚成分,加样量最小;等速提纯电泳区带分辨率较高,可将样品分成单一成分,加样量最大. 离子交换层析(Ion exchange chromatography,IEC)是以离子交换剂为固定相,依据流动相中的组分离子与交换剂上的平衡离子进行可逆交换时结合力大小的差别而进行分离的一种层析方法.离子交换层析中,基质由带有电荷的树脂或纤维素组成.带有正电荷的为阴离子交换树脂;反之为阳离子交换树脂.离子交换层析同样可以用于蛋白质的分离纯化.当蛋白质处于不同的pH值条件下,其带电状况也不同.阴离子交换基质结合带有负电荷的蛋白质,被留在层析柱上,通过提高洗脱液中的盐浓度,将吸附在层析柱上的蛋白质洗脱下来,其中结合较弱的蛋白质首先被洗脱下来.反之阳离子交换基质结合带有正电荷的蛋白质,结合的蛋白可以通过逐步增加洗脱液中的盐浓度或是提高洗脱液的pH值洗脱下来.李全宏等[19]将离子交换层析应用于浓缩苹果汁中蛋白质的提纯.另外,离子交换层析还用于抗凝血蛋白的提取[7]. 4. 利用对配体的特异亲和力进行分离纯化 亲和层析是利用蛋白质分子对其配体分子特有的识别能力(即生物学亲和力)建立起来的一种有效的纯化方法.它通常只需一步处理即可将目的蛋白质从复杂的混合物中分离出来,并且纯度相当高.应用亲和层析须了解纯化物质的结构和生物学特性,以便设计出最好的分离条件.近年来,亲和层析技术被广泛应用于靶标蛋白尤其是疫苗的分离纯化,特别是在融合蛋白的分离纯化上,亲和层析更是起到了举足轻重的作用,因为融合蛋白具有特异性结合能力[20].亲和层析在基因工程亚单位疫苗的分离纯化中应用也相当广泛[21].范继业等[22]利用壳聚糖亲和层析提取的抑肽酶比活达到71 428 BAEE·mg-1,纯化回收率达到62·5%.该方法成本较低,吸附剂价格低廉、机械强度高、抗污染能力较强、非特异性吸附较小、可反复使用、适用性广,产品质量稳定.