离子交换柱填料注意事项

❶ 原核表达常见问题（三）蛋白纯化后续的问题分析

1.目的蛋白纯化浓缩之后，目的蛋白条带周围出现杂带，据推测可能是插入目的基因后，外源基因的表达刺激大肠杆菌产生了宿主蛋白酶，对异源蛋白进行降解的产物。

样品缓冲液有相同的 pH 和离子强度。

离子交换纯化是利用离子交换剂上的可解离基团(活性基团)对各种离子的亲和力不一样达到分离目的的一种蛋白纯化分离技术,离子强度越大，洗脱越好。具体的离子浓度范围可以很大，0.01mol/l 到 1mol/l，甚至 3.0mol/l，PH值的范围液很广。主要根据你的蛋白质的等电点。

1. 蛋白与离子柱得结合太强，换弱阳的琼脂糖凝胶介质，比如由 sp 的换成 CM

2. 减少离子柱与样品的结合时间，防止蛋白沉在柱上。

3. 若洗不下来的是杂蛋白直接用 0.1M 氢氧化钠洗。

1. 离子交换每个梯度都洗下来目标蛋白，最大可能性是上样量过大，流速太大，建议增加清洗的体积数，减

少上样量，降低上样速度。

2. 上样完洗脱前，清洗的不彻底。

3. 标签没有表达出来：1. 可能是因为折叠构象不正确导致标签在重折叠时没有位于蛋白质分子的表面上无法与离子柱结合。2. 标签在折叠时没有位于蛋白质分子的表面上。

4. 填料有问题，换填料。

5. PH、离子强度是否合适，平衡缓冲液是否应与样品缓冲液 pH、离子强度相同。

1. 蛋白质的折叠形态发生了改变隐藏了标签，而使得蛋白质无法挂柱 。

1. 因临近的空间的一个或多个氨基酸的空间位阻阻碍了标签与离子柱形成共价键。

2. 环境影响：pH，离子强度，其他蛋白质分子，缓冲溶液类型，有关影响蛋白质分子表面的试剂等。增加所提的蛋白质样品的溶解度或还可以加大离子型、非离子型或两性离子表面活性剂的浓度或类型。

2. 柱子没平衡好，平衡缓冲液没加咪唑，平衡液 PH 不适合，缓冲液 pH 要与蛋白质 pI +/-1-2。

3. 有比邻的组氨酸的污染蛋白质与离子柱结合，通过降低洗脱液 pH 值使得标签质子化而使得污染蛋白质从

层析住上被洗脱。

4. 一些蛋白质或 DNA 与带有标签的目的蛋白发生了非特异性相互作用， 可以用低浓度的去污剂 （2%的 Triton

X-100 或浓度不大于 0.5%SDS)洗涤样品 （上样洗脱时） 或增加洗脱液的盐浓度 （氯化钠溶液低于 2mol/L） 。

5. 填料有问题，换填料。

6. 最后可以考虑一下试剂的问题。

1. 更换缓冲液，可能 pH 与蛋白质 pI 较接近。

2. 填料选择不对，与蛋白结合力太弱，更换适合改纯化蛋白质的填料。

3. 直接收取目的蛋白，再用其他纯化方法进一步纯化。

1. pH 发生变化，导致蛋白质沉淀。找准蛋白质的一个等电点，溶液环境的ph值不能在蛋白质等电点的附近，如果在等电点的附近的时候，这个时候蛋白非常容易沉淀。可根据软件计算入VECTOR NTI计算其理论等电点，尽量纯化的溶剂在远离等电点。

2. 离子溶度过高，缓冲液的离子溶度降低。人为配制的溶液环境，不一定真正符合蛋白本身的“生存”的环境要求，所以要从离子浓度和pH去考虑，特别是盐离子浓度；所谓的盐浓度，就是盐析效应。高浓度的盐破坏蛋白的水化层，使得蛋白质聚集沉淀。常用的就是硫酸铵沉淀。盐析沉淀通常对蛋白质的高级结构没有破坏，再溶时活性可以完全恢复。常见的例子就是硫酸铵沉淀纯化IgG。同样，硫酸铵沉淀也常碰到不可逆的情况。例如大肠杆菌(Escherichia coli)表达的重组蛋白往往在硫酸铵沉淀后再溶困难。

3.在Ni纯化的过程中，有一部分镍离子会脱落，脱落的镍离子属于重金属，会对蛋白的凝集和沉积起到一定的作用。

4.蛋白反复冻溶，过程中生成的一些小冰晶会对这个蛋白的结构造成一定的伤害，离子和缓冲液状态发生较大变化；

5.如果长时间放在4度的情况之下蛋白质，容易滋生微生物，微生物的生长的可能造成蛋白的性质变化或者降解也容易产生一些聚集沉淀；

9.若发生不可逆沉淀，可以选择离心，过滤等方式去除。

1. 倒入速度不要太快，以防产生泡沫和气泡。

2. 装柱的注意事项:

1. 装柱时应注意液面不能低于树脂表面。

2. 树脂悬浮液的温度要相对恒定或与室温接近，否则柱床体内易产生气泡而影响分离效果。

3. 装好的柱体应该没有“纹路”、节痕和气泡，并且柱床体表面平整而均匀。否则需要重新装柱。

4. 在装柱的同时应该将其他仪器设备（如：恒流泵等）电源接通，并按实验要求进行预热和调试。需

将恒流泵流速调至 0.4ml/min。

3. 应将洗脱液放至液面与树脂相切时再上样，且样品一旦加入就应该立即开始收集流出液。 （第一管，应在

4ml 处做一标记）。 

4. 加样时要沿柱内壁缓慢地加入柱中，以免冲坏树脂表面，以及在柱内形成气泡，影响分离效果。

❷ 以离子交换色谱法为例，简述湿法装柱的操作过程和注意事项

先装部分液体吗，然后倒入色谱填料（色谱调料配置成悬浮液），倒的时候注意液面在填料上面，防止产生气泡。色谱柱可以适当放液，增加填料的沉积速度。

❸ 氨基酸分析仪的色谱柱是什么填料的寿命大概能有多久能自己装填吗

您好来，我是德国曼默博尔公司自的工程师。
氨基酸分析的色谱柱填料主要是苯乙烯-二乙烯苯聚合后磺化成的磺酸型强酸性阳离子交换树脂。
其实，色谱柱寿命主要看自己使用时候保护的怎么样：包括样品前处理是否规范，维护保养是否充分等。一般注意点使用的话，保证柱效的情况下，寿命能保证在1万-2万针左右，多的话也有可能，看你怎么用了。有的厂家会吹嘘能到6万针，简单计算下氨基酸分析一个样大概得1小时左右，除去维护时间，一天最多跑个20针，一年也就6000针左右，10年才能跑完6万针，到时候仪器报废没报废都不知道，别说色谱柱了。
色谱柱的装填是非常需要经验和技巧的活儿，而且装色谱柱得需要非常专业的色谱柱装柱机。比如装色谱柱的时候得用恒压泵装，一般实验室仪器都配置的是恒流泵，恒流泵装出来的柱子填料很容易就塌了。而且前期的填料清洗、匀浆等都非常需要经验，要是自己装估计很难，一般得找专业的色谱柱工程师装填最好。
希望对您有帮助，记得给分

❹ 离子色谱柱淋洗液应该用碳酸钠用了氢氧化钠柱子会坏吗

离子色谱柱淋洗液应该用碳酸钠用了氢氧化钠柱子不会坏。
离子色谱柱的填料是离子交换树脂，离子交换树脂不怕稀酸稀碱。一般活化离子交换树脂都是采用酸碱交替进行活化，提高离子吸附量。但氢氧化钠毕竟是强碱性的，用完后，柱子要冲洗干净。

❺ 离子交换和凝胶层析装柱时,出现气泡,结节怎么处理

可以用适量的有机溶剂润洗一下层析柱，柱子体积较小的话就用玻璃棒搅匀排除一内下气泡。

不管是干柱和容湿柱，都要加层析液，不能要求一开始就没有气泡的。要用洗脱剂不停的洗脱，就是用配置好的试剂一边一边对柱子进行洗脱，这样不但可以消除气泡，还可以使硅胶充分沉降，让层析效果更好。等柱子没有气泡后在上样用洗脱液进行层析。

若柱中留有气泡或各部分松紧不匀（更不能有断层）时，会影响渗透速度和显色的均匀。去除就是用玻璃棒搅拌，赶走气泡。

(5)离子交换柱填料注意事项扩展阅读：

水溶液中的一些阳离子进入反离子层，而原来在反离子层中的阳离子进入水溶液，这种发生在反离子层与正常浓度处水溶液之间的同性离子交换被称为离子交换作用。

离子交换主要发生在扩散层与正常水溶液之间，由于黏土颗粒表面通常带的是负电荷，故离子交换以阳离子交换为主，故又称为阳离子交换。离子交换严格服从当量定律，即进入反离子层的阳离子与被置换出反离子层的阳离子的当量相等。

❻ 离子交换和凝胶层析湿法装柱时，如出现气泡、结节、表面凹凸不平，该如何处理

把填料倒出来 重新装柱