Ⅰ 离子交换层析中，为什么用氯离子洗脱阴离子为什么改变氯离子浓度就可以分离出带电荷不同的阴离子
阴离子交来换柱的填料自是正电填料，在低盐条件下可以通过电荷相互作用吸附样品中的阴离子和负电荷物质（如DNA）。这些带负电的物质由于其带电量不同，分子大小不同，因而与正电填料之间的结合力也就不同。用梯度的氯离子（一般用氯化钠梯度，例如从100mM氯化钠线性梯度升高到1M氯化钠）洗脱挂柱样品时，氯离子会和结合上的物质竞争结合正电填料，伴随着氯离子浓度的不断升高，氯离子的竞争作用越来越强，与填料结合的物质会按照亲和力从弱到强依次洗脱下来，形成独立的洗脱峰，从而将这些物质分开。
阳离子交换柱与之正好相反，柱子填料为负电荷，用钠离子洗脱结合的正电物质。
Ⅱ DEAE纤维素阴离子交换柱，看到很多地方讲到流穿模式，什么叫做流穿模式呢
流穿模式指的是样品没挂柱，都留下来了。
Ⅲ 用离子交换法纯化蛋白如何选定缓冲液
也可以用AEC，主要以流穿模式做。sspxiaoji(站内联系TA)用阳离子交换柱，可以考虑pH6.0-7.0的缓冲液，因内为容大部分蛋白质的等电点在这附近，带电荷少，这样容易穿透除去其他杂蛋白。而你的目的蛋白PI在11，挂柱应该比较牢固。但是有个问题需要注意，PH离你的目标蛋白PI太远，有可能导致挂柱后难以洗脱。
Ⅳ 原核表达常见问题（三）蛋白纯化后续的问题分析
1.目的蛋白纯化浓缩之后，目的蛋白条带周围出现杂带，据推测可能是插入目的基因后，外源基因的表达刺激大肠杆菌产生了宿主蛋白酶，对异源蛋白进行降解的产物。
样品缓冲液有相同的 pH 和离子强度。
离子交换纯化是利用离子交换剂上的可解离基团(活性基团)对各种离子的亲和力不一样达到分离目的的一种蛋白纯化分离技术,离子强度越大，洗脱越好。具体的离子浓度范围可以很大，0.01mol/l 到 1mol/l，甚至 3.0mol/l，PH值的范围液很广。主要根据你的蛋白质的等电点。
1. 蛋白与离子柱得结合太强，换弱阳的琼脂糖凝胶介质，比如由 sp 的换成 CM
2. 减少离子柱与样品的结合时间，防止蛋白沉在柱上。
3. 若洗不下来的是杂蛋白直接用 0.1M 氢氧化钠洗。
1. 离子交换每个梯度都洗下来目标蛋白，最大可能性是上样量过大，流速太大，建议增加清洗的体积数，减
少上样量，降低上样速度。
2. 上样完洗脱前，清洗的不彻底。
3. 标签没有表达出来：1. 可能是因为折叠构象不正确导致标签在重折叠时没有位于蛋白质分子的表面上无法与离子柱结合。2. 标签在折叠时没有位于蛋白质分子的表面上。
4. 填料有问题，换填料。
5. PH、离子强度是否合适，平衡缓冲液是否应与样品缓冲液 pH、离子强度相同。
1. 蛋白质的折叠形态发生了改变隐藏了标签，而使得蛋白质无法挂柱 。
1. 因临近的空间的一个或多个氨基酸的空间位阻阻碍了标签与离子柱形成共价键。
2. 环境影响：pH，离子强度，其他蛋白质分子，缓冲溶液类型，有关影响蛋白质分子表面的试剂等。增加所提的蛋白质样品的溶解度或还可以加大离子型、非离子型或两性离子表面活性剂的浓度或类型。
2. 柱子没平衡好，平衡缓冲液没加咪唑，平衡液 PH 不适合，缓冲液 pH 要与蛋白质 pI +/-1-2。
3. 有比邻的组氨酸的污染蛋白质与离子柱结合，通过降低洗脱液 pH 值使得标签质子化而使得污染蛋白质从
层析住上被洗脱。
4. 一些蛋白质或 DNA 与带有标签的目的蛋白发生了非特异性相互作用， 可以用低浓度的去污剂 （2%的 Triton
X-100 或浓度不大于 0.5%SDS)洗涤样品 （上样洗脱时） 或增加洗脱液的盐浓度 （氯化钠溶液低于 2mol/L） 。
5. 填料有问题，换填料。
6. 最后可以考虑一下试剂的问题。
1. 更换缓冲液，可能 pH 与蛋白质 pI 较接近。
2. 填料选择不对，与蛋白结合力太弱，更换适合改纯化蛋白质的填料。
3. 直接收取目的蛋白，再用其他纯化方法进一步纯化。
1. pH 发生变化，导致蛋白质沉淀。找准蛋白质的一个等电点，溶液环境的ph值不能在蛋白质等电点的附近，如果在等电点的附近的时候，这个时候蛋白非常容易沉淀。可根据软件计算入VECTOR NTI计算其理论等电点，尽量纯化的溶剂在远离等电点。
2. 离子溶度过高，缓冲液的离子溶度降低。人为配制的溶液环境，不一定真正符合蛋白本身的“生存”的环境要求，所以要从离子浓度和pH去考虑，特别是盐离子浓度；所谓的盐浓度，就是盐析效应。高浓度的盐破坏蛋白的水化层，使得蛋白质聚集沉淀。常用的就是硫酸铵沉淀。盐析沉淀通常对蛋白质的高级结构没有破坏，再溶时活性可以完全恢复。常见的例子就是硫酸铵沉淀纯化IgG。同样，硫酸铵沉淀也常碰到不可逆的情况。例如大肠杆菌(Escherichia coli)表达的重组蛋白往往在硫酸铵沉淀后再溶困难。
3.在Ni纯化的过程中，有一部分镍离子会脱落，脱落的镍离子属于重金属，会对蛋白的凝集和沉积起到一定的作用。
4.蛋白反复冻溶，过程中生成的一些小冰晶会对这个蛋白的结构造成一定的伤害，离子和缓冲液状态发生较大变化；
5.如果长时间放在4度的情况之下蛋白质，容易滋生微生物，微生物的生长的可能造成蛋白的性质变化或者降解也容易产生一些聚集沉淀；
9.若发生不可逆沉淀，可以选择离心，过滤等方式去除。
1. 倒入速度不要太快，以防产生泡沫和气泡。
2. 装柱的注意事项:
1. 装柱时应注意液面不能低于树脂表面。
2. 树脂悬浮液的温度要相对恒定或与室温接近，否则柱床体内易产生气泡而影响分离效果。
3. 装好的柱体应该没有“纹路”、节痕和气泡，并且柱床体表面平整而均匀。否则需要重新装柱。
4. 在装柱的同时应该将其他仪器设备（如：恒流泵等）电源接通，并按实验要求进行预热和调试。需
将恒流泵流速调至 0.4ml/min。
3. 应将洗脱液放至液面与树脂相切时再上样，且样品一旦加入就应该立即开始收集流出液。 （第一管，应在
4ml 处做一标记）。
4. 加样时要沿柱内壁缓慢地加入柱中，以免冲坏树脂表面，以及在柱内形成气泡，影响分离效果。
Ⅳ His标签蛋白纯化那些事儿，你知道吗
His标签蛋白纯化是一门技术活，需要细致的步骤和方法。是否熟悉His标签纯化的基本知识，决定着蛋白纯化的效果。以下是一些常见的His标签纯化问题和解决策略，希望能帮助你提升纯化效率。
在进行His标签纯化时，推荐的缓冲液条件是：Binding buffer为20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 20–40 mM imidazole, pH 7.4；而Elution buffer则为20 mM sodium phosphate, 0.5 M NaCl, 500 mM imidazole, pH 7.4。His标签在中性或碱性条件下与Ni2+结合力更强，所以推荐使用磷酸缓冲液。
镍柱的蛋白结合载量为至少40mg (His) 6重组蛋白，可以根据填料的结合载量选择预装柱和填料的规格。如果目标蛋白中的咪唑需要去除，可以选择适合的上机脱盐柱或手动脱盐柱。
HisTrap柱子应储存在20%乙醇中，于4℃-30℃条件下，以确保其长期稳定。使用柱子后，正常用缓冲液冲洗即可再次使用。如果柱子出现堵塞、变色等问题，需进行脱镍和挂镍操作，推荐使用20 mM sodium phosphate， 0.5 M NaCl， 50 mM EDTA， pH 7.4的stripping buffer清洗柱子，然后用binding buffer和蒸馏水清洗。
如果裂解液粘性过高，可以使用连续超声或加入5 μg/ml的DNase I、1 mM的Mg离子在冰上孵育来降低粘性。如果目的蛋白不挂柱，可能是His标签没有充分暴露或丢失，可通过加入尿素或盐酸胍等变性剂检查，或者调整His标签的位置。缓冲液条件不合适、洗脱时间过短、样品量过大等情况也可能导致此问题。在纯化过程中，若蛋白挂柱后洗脱不下来，可能是洗脱条件太温和或蛋白在柱子中沉淀，此时可调整咪唑浓度或pH值，使用添加剂或改变NaCl浓度，或尝试在变性条件下洗脱。对于洗脱不纯的蛋白，需要检查是否被蛋白酶降解，是否存在高度亲和镍离子的污染物，或有相互作用的污染物，这时可以通过增加添加剂浓度或使用离子交换层析、分子筛进一步纯化。
优化金属离子和宿主蛋白中His标签的结合能力，可以提高蛋白纯度。若遇到纯度问题，尝试更换成结合能力较弱的Co2+，以减少宿主蛋白的杂质。
以上是一些His标签纯化过程中的常见问题及解决策略，希望能帮助你提升蛋白纯化的成功率。如果你有任何疑问或需要进一步的帮助，欢迎咨询优宁维代理的Ni Sepharose FF 填料。
Ⅵ 怎样利用离子交换柱层析法分离不同的蛋白质
离子交换内的介质一般是树脂，阳离子交换型的，使用前树脂先用碱处理成钠型，将氨基酸混合液（pH=2-3)上柱，pH=2-3时，氨基酸主要以阳离子形式存在，与树脂上的钠离子发生交换而被“挂”在树脂上，再用洗脱剂洗脱。不同的氨基酸（带的电荷不同）与树脂的亲和力不同，要将其分离洗脱下来，需要降低它们之间的亲和力，方法是逐步提高洗脱剂的pH和盐浓度，这样各种氨基酸将以不同的速度被洗脱下来。