发酵液中链霉菌过滤

A. 在制霉菌素化学效价测定中，为什么要加磷酸，而且还要沸水浴啊

制霉菌素发酵、提取与效价测定

1.1.1 目的与要求

(1) 了解抗生素发酵的一般过程及发酵过程中一些重要理化指标检测方法；

(2) 学习抗生素（制霉菌素）的提取纯化工艺；

(3) 了解制霉菌素化学效价测定的原理；

(4) 掌握抗生素生物效价测定的常规方法——管碟法的原理与操作。

1.1.2 基本原理

1.1.2.1制霉菌素

制霉菌素(nystatin)是由诺尔斯链霉菌(Streptomyces noursei)产生的一种多烯大环内酯类(polyene macrolides) 抗真菌抗生素。此类抗生素的结构特点是在分子中既有经内酯化作用而闭合的大碳环，又有一系列的共轭双键。

制霉菌素存在于菌丝体中，其纯品为淡黄色微细晶体；不溶于水、氯仿和丙酮等；稍溶于低级醇等；溶于吡啶、冰醋酸和NaOH溶液，但均能使其破坏而失效；对较高和较低的pH以及光和热均不稳定。临床上使用的制霉菌素，其主要成分为制霉菌素A1，化学结构式如下图所示：

图1-1 制霉菌素化学结构图

它的氨基糖部分是氨基海藻糖，即3-氨基-3,6-二脱氧-D-吡喃甘露糖，非糖部分为38元的多烯大环内酯。
制霉菌素对各种真菌如白色念珠菌、隐球菌、荚膜组织胞浆菌及球孢子菌等有抑制作用。主要用于白色念珠菌感染，如消化道念珠菌病、鹅口疮、念珠菌性阴道炎及外阴炎等。但口服治疗全身性真菌感染或深部真菌感染则无效。制霉菌素的作用机理是与真菌细胞膜上的特异甾醇相结合，导致原生质膜破坏，通透性改变，以致重要的细胞内容物外漏而死亡，从而杀灭真菌。由于细菌原生质膜上不含甾醇，故本品对细菌无效；对肠道正常菌丛也无作用。

1.1.2.2 抗生素发酵生产工艺简介

抗生素液体发酵共分为三大工序：菌种、发酵和提取。配合三个工序进行分析化验和有关产物测定。具体而言，其过程为菌种→孢子制备→种子制备→发酵→发酵液预处理→提取与精制→成品包装。

菌种一般采用液氮超低温保藏或沙土管保藏。一般生产用菌种经多次转接往往会发生变异而退化，故必须经常进行菌种选育和纯化，以提高其生产能力。

生产用的菌株须经纯化和生产能力的检验，若符合规定，才能用来制备种子。制备孢子时，将保藏的处于休眠状态的孢子，经过严格的无菌程续，将其接种到经灭菌过的固体斜面培养基上，在一定条件下培养至孢子量符合生产需要，必要时可用大茄子瓶在固体培养基上扩大培养。

种子制备的目的是使孢子发芽、繁殖，以获得足够数量的菌丝，并接种到发酵罐中。种子制备可用摇瓶培养后再接入种子罐进行逐级扩大培养；或直接将孢子接入种子罐后就、逐级放大培养。种子扩大培养级数的多少，决定于菌种的性质、生产规模的大小和生产工艺的特点。扩大培养级数通常为二级。

发酵过程的目的是使微生物大量分泌抗生素。发酵接种量一般为10%或10%以上，发酵周期视抗生素品种和发酵工艺而定。发酵期间，每隔一定时间应取样进行生化分析、镜检和无菌检验。分析或控制的参数有菌丝形态和浓度、残糖量、氨基氮、抗生素含量、溶解氧、pH、通气量、搅拌转速和液面控制等。

发酵液的过滤和预处理的目的不仅在于分离菌丝，还需将一些杂质除去。尽管对多数抗生素品种在生产过程中，当发酵结束时，抗生素存在于发酵液中，但也有个别品种当发酵结束时抗生素大量存在于菌丝之中，在此情况下，发酵液预处理目的包括使抗生素从菌丝中析出转入发酵液或使菌丝体与发酵液分离。
抗生素成品。在发酵液中抗生素浓度很低，而杂质的浓度相对较高。杂质中含有无机盐、残糖、脂肪、各种蛋白质及其降解物、色素、热源质或有毒性物质等。此外还可能有一些杂质，其性质和抗生素很相似，这就增加了提取和精制的困难。

由于多数抗生素不很稳定，且发酵液易被污染，故整个提取过程要求：时间短、温度低、pH宜选择对抗生素较稳定的范围、勤清洗消毒。

目前常用的抗生素提取方法有溶媒萃取法、离子交换法和沉淀法等。

精制是抗生素生产的最后步骤，对产品精制、烘干和包装的阶段要符合“药品生产管理规范”（即GMP）的规定。抗生素精制可选用的步骤有：脱色和去热源质、结晶和重结晶、共沸蒸馏法、柱层析法、盐析法、中间盐转移法和分子筛等。

B. 链霉素的生产过程

分为两大步骤：①菌种发酵，将冷干管或沙土管保存的链霉菌孢子接种到斜面培养基上，于27℃下培养7天。待斜面长满孢子后，制成悬浮液接入装有培养基的摇瓶中，于27℃下培养45～48小时待菌丝生长旺盛后，取若干个摇瓶，合并其中的培养液将其接种于种子罐内已灭菌的培养基中，通入无菌空气搅拌，在罐温27℃下培养62～63小时，然后接入发酵罐内已灭菌的培养基中，通入无菌空气，搅拌培养，在罐温为27℃下，发酵约7～8天。②提取精制，发酵液经酸化、过滤，除去菌丝及固体物，然后中和，通过弱酸型阳离子交换树脂进行离子交换，再用稀硫酸洗脱，收集高浓度洗脱液──链霉素硫酸盐溶液。洗脱液再经磺酸型离子交换树脂脱盐，此时溶液呈酸性，用阴离子树脂中和后，再经活性炭脱色得到精制液（见彩图）。精制液经薄膜浓缩成浓缩液，再经喷雾干燥得到无菌粉状产品，或者将浓缩液直接做成水针剂。

C. 求链霉素详细生产工艺流程

链霉素（Streptomycin）是1944年从灰色链霉菌（Streptomyces,griseus）培养液中分离出来的一种碱性抗生素，我国于1958年以来大量生产，目前已形成了相当大的生产规模与能力。

传统工艺

链霉素早期的提取方法采用活性炭吸附法、带溶法、沉淀法、离子交换法。目前国内外多采用离子交换法提取链霉素，其工艺流程如Fig.1.7.

Fig.1.7链霉素传统工艺流程

然而链霉素发酵液中绝大部分是菌丝体和未用完的培养基，以及各种各样的代谢产物，如：蛋白质、多肽、色素和Ca2＋、Mg2＋离子等等，链霉素浓度远较各种杂质的低，仅为5000单位/毫升左右。大量蛋白、多肽和高价离子(Ca2＋、Mg2＋)的存在对离子交换吸附影响很大。在离子交换处理前，一般采用蒸汽加热（70～75℃）方法使蛋白质凝固变性。添加磷酸或一些络合剂如三聚磷酸等使高价离子草酸、磷酸生成不溶性沉淀物，然后通过板框过滤或离心分离将这些沉淀物除去。这一预处理将导致10％以上的链霉素所添加的草酸、磷酸或络合剂，既增加了链霉素提炼成本，又会降低产品纯度、污染环境。同时所得的发酵滤液中仍存在许多蛋白、多肽和其它各种杂质，将会减少树脂的吸附容量或污染树脂，造成树脂的沉降和堵塞，进而缩短树脂的寿命，增加 抗生素提炼的成本。

此外采用离子交换法提炼链霉素，总收率不高，只达72％。同时需大量解吸液。解吸液中链霉素浓度低，各种杂质如色素、金属离子等含量较高，造成下游工艺处理困难 ，产品纯度不高。

三达新工艺

膜法工艺取代链霉素生产中的薄膜蒸发工艺，使这一问题得到了很好的解决。膜分离是一种无相变的纯物理手段，能在任何膜能承受的温度下对料液进行分子水平的分离。清洁，环保，占地少，另外它的一大优势是运行成本低，去除一吨水的成本比普通的三效蒸发器低，有效地控制产品，提高了产品的质量。

Ultra－flo 超滤技术替代传统的板框压滤/鼓式真空过滤方法。其最大的特点是在不需要加入助滤剂、絮凝沉淀剂及其他任何化学试剂的情况下，不仅可把菌丝体及其他固体杂质完全分离，而且可以把99％以上的蛋白(包括溶解性的蛋白) 与菌丝体一起剔除。

Ultra－flo 超滤技术实质是把传统工艺中剔除蛋白(絮凝沉淀)、菌丝分离（板框压滤/鼓式真空过滤），去除乳化(破乳剂的使用)等多种传统的提炼与纯化工艺用Ultra－flo 超滤技术加以替代，既减少了设备的投资，及原辅材料(如助滤剂、絮凝剂、破乳剂等) 的消耗，还大大提高了链霉素预处理的收率，使得传统意义上板框压滤/鼓式真空过滤工艺中10～15％的链霉素损失下降到1％的水平。
Ultra－flo 超滤组件适于处理高粘度的流体并达到较高的浓缩倍数，使含菌丝/蛋白及其他大分子物质的浓缩液呈浆糊状，其固体充填密度可达到95％以上。且几乎不含任何链霉素组分，从而使链霉素预处理的收率达到99％的水平。而且浓缩液中的菌丝/蛋白由于未受助滤及絮凝剂的污染而可直接用作动物饲料，既增加了收入，又减少了污物处置的费用，因此，受到环保当局的特别推崇。
经Ultra－flo 超滤技术处理的发酵滤液，清辙透明，不含蛋白，可用专利性的Nano －flo 纳滤技术进一步浓缩到所需的浓度。Nano－flo 纳滤技术与传统意义上的反渗透 技术亦有很大区别。它既可以使链霉素完全截流，又允许无机盐透析，减少渗透压，从而有利于浓缩过程的进行，并使链霉素浓度达到相当高的水平，进而减少了后续工艺中有机溶媒的用量，在节省成本、增加收率的同时，减少了产品在母液及其他废液中的损失，有利环境保护。

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