『壹』 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量的原理是什么
在酸性条件下，考马斯亮兰G-250染料与蛋白质疏水区结合，导致最大吸收峰由465 nm 变为595 nm，同时颜色也由棕色变为蓝色,该蓝色化合物颜色的深浅与蛋白质浓度的高低成正比关系。将蛋白质样品或稀释的BSA 与Bradford试剂混合，测量在595 nm处的吸收值，在建立由一系列稀释的BSA建立的标准曲线的情况下，蛋白质的浓度可以根据标准曲线而确定。
考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。
该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry法还高4倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg/mL，最小可测2.5μg/mL蛋白质，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
考马斯亮蓝有G250和R250两种。其中考马斯亮蓝G250由于与蛋白质的结合反应十分迅速，常用来作为蛋白质含量的测定。考马斯亮蓝R250与蛋白质反应虽然比较缓慢，但是可以被洗脱下去，所以可以用来对电泳条带染色。
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量流程：
该方法用于大多数蛋白质的定量是比较精确的，但不适用于小分子碱性多肽的定量。如核糖核酸酶或溶菌酶。去污剂的浓度超过0．2%影响测定结果。如TritonX-100、SDS、NP-40等。
1．Bradford浓染液的配制：将100mg考马斯亮蓝G-250溶于50ml 95%乙醇，加入100ml85%的磷酸，然后，用蒸馏水补充至1000ml，此染液放4℃至少6个月保持稳定。
2．标准曲线蛋白质样本的准备：尽量使用与待测样本性质相近的蛋白质作为标准品，例如测定抗体，可用纯化的抗体作为标准。如果待测样本是未知的，也可用抗体作为标准蛋白。通常在20ug—150ug/100ul之间绘制标准曲线。
3．将待测样本溶于缓冲溶液中，该缓冲溶液应与制作标准曲线的缓冲溶液相同(最好用PBS)。
4．按1：5用蒸馏水稀释浓染料结合溶液，如出现沉淀，过滤除去。
5．每个样本加5ml稀释的染料结合溶液，作用5～30min。染液与蛋白质结合后，将由红色变为蓝色，在595nm波长下测定其吸光度。注意，显色反应不得超过30min．
6．根据标准曲线计算待测样本的浓度。
『贰』 考马斯亮蓝g250配制，溶解时间
一般搅拌20分钟吧，完全溶解不太可能，搅拌后加上水会容的更多一些，最后要过滤的
『叁』 有人有western blot的Tris-乙酸胶的配方吗还有相关电泳液的配方急！急！急！非常感谢！
一、SDS-PAGE电泳所用溶液：
1）30 %聚丙烯酰胺溶液 (100 mL)
丙烯酰胺 (Arc) 29 g
N,N’-亚甲双丙烯酰胺 (Bis) 1 g
用双蒸水定容至100mL，过滤备用，4℃存放
丙稀酰胺29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g，加入去离子水定容至100mL，pH值不能超过7.0，过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。
2）5×Tris-甘氨酸缓冲液 (1 L)
Tris碱 15.1 g
甘氨酸(电泳级) 94 g
10 %SDS 50 mL
使用时稀释5倍使用
3）2×SDS凝胶加样缓冲液(10mL)
0.5 mol/L Tris-Cl (pH 6.8) 2 mL
10％(W/V)SDS 4 mL
甘油 2 mL
β-巯基乙醇 1.0 mL
(DTT（二硫苏糖醇） 0.31g)
溴酚兰 0.02g
双蒸水 0.5 mL
室温存放备用
4）考马斯亮蓝染色液
考马斯亮蓝R-250 （G-250） 1.0 g
甲醇 450 mL
冰醋酸 100 mL
ddH2O 450 mL
0.2g考马斯亮蓝R250+84mL 95％乙醇+20mL冰醋酸，定容至200mL，过滤备用
5）考马斯亮蓝脱色液（甲醇脱色液效果好，但有毒性）
甲醇 100 mL
冰醋酸 100 mL
ddH2O 800 mL
医用酒精：冰醋酸：水=4.5：0.5：5(V：V：V)
二、SDS-PAGE所需溶液:
A液——30％丙稀酰胺（W/V）：丙稀酰胺29.2g，N-N-甲叉双丙稀酰胺0.8g，加入去离子水定容至100mL，pH值不能超过7.0，过滤于棕色玻璃瓶中4℃贮存。B液——1.5mol/L Tris·HCl，pH8.8：18.17g（9.09g）Tirs碱，溶于80mL（40mL）去离子水中，加入约3mL(1.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至8.8，定容至100mL（50mL）。C液——1.5mol/L Tris·HCl，pH6.8：12.1g（6.05g）Tirs碱，溶于80mL（40mL）去离子水中，加入约7mL(3.5mL)以上的浓盐酸调节pH值至6.8，定容至100mL（50mL）。D液——10％SDS：10g (2g)SDS溶于去离子水中，定容至100mL(20mL)，加热至68℃助溶。E液——10％过硫酸铵：5g(0.5g)过硫酸铵，溶于50mL(5mL)去离子水中；现配现用或分装至0.5mL离心管中冷冻备用。
F液——TEMED(N-N-N`-N`－四甲基乙二胺)原液，室温保存。
三、配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液
表1.配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离胶所用溶液成分 | 配制不同体积和浓度凝胶所需各成分的体积/mL | |||||||
5 | 10 | 15 | 20 | 25 | 30 | 40 | 50 | |
10 %胶 | ||||||||
水 | 1.9 | 4.0 | 5.9 | 7.9 | 9.9 | 11.9 | 15.9 | 19.8 |
30 %丙烯酰胺混合液 | 1.7 | 3.3 | 5.0 | 6.7 | 8.3 | 10.0 | 13.3 | 16.7 |
1.5 mol/L Tris(pH8.8) | 1.3 | 2.5 | 3.8 | 5.0 | 6.3 | 7.5 | 10.0 | 12.5 |
10 % SDS | 0.05 | 0.1 | 0.15 | 0.2 | 0.25 | 0.3 | 0.4 | 0.5 |
10 % 过硫酸铵 | 0.05 | 0.1 | 0.15 | 0.2 | 0.25 | 0.3 | 0.4 | 0.5 |
TEMED | 0.002 | 0.004 | 0.006 | 0.008 | 0.01 | 0.012 | 0.016 | 0.02 |
12 %胶 | ||||||||
水 | 1.6 | 3.3 | 4.9 | 6.6 | 8.2 | 9.9 | 13.2 | 16.5 |
30 %丙烯酰胺混合液 | 2.0 | 4.0 | 6.0 | 8.0 | 10.0 | 12.0 | 16.0 | 20.0 |
1.5 mol/L Tris(pH8.8) | 1.3 | 2.5 | 3.8 | 5.0 | 6.3 | 7.5 | 10.0 | 12.5 |
10 % SDS | 0.05 | 0.1 | 0.15 | 0.2 | 0.25 | 0.3 | 0.4 | 0.5 |
10 % 过硫酸铵 | 0.05 | 0.1 | 0.15 | 0.2 | 0.25 | 0.3 | 0.4 | 0.5 |
TEMED | 0.002 | 0.004 | 0.006 | 0.008 | 0.01 | 0.012 | 0.016 | 0.02 |
表2. 配制Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶所用溶液 | ||||||||
成分 | 配制不同体积和浓度凝胶所需各成分的体积/ml | |||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 8 | 10 | |
水 | 0.68 | 1.4 | 2.1 | 2.7 | 3.4 | 4.1 | 5.5 | 6.8 |
30 %丙烯酰胺混合液 | 0.17 | 0.33 | 0.5 | 0.67 | 0.83 | 1.0 | 1.3 | 1.7 |
1.5 mol/L Tris(pH6.8) | 0.13 | 0.25 | 0.38 | 0.50 | 0.63 | 0.75 | 1.0 | 1.25 |
10 % SDS | 0.01 | 0.02 | 0.03 | 0.04 | 0.05 | 0.06 | 0.08 | 0.1 |
10 % 过硫酸铵 | 0.01 | 0.02 | 0.03 | 0.04 | 0.05 | 0.06 | 0.08 | 0.1 |
TEMED | 0.001 | 0.002 | 0.003 | 0.004 | 0.005 | 0.006 | 0.008 | 0.01 |
『肆』 测蛋白用的考马斯亮蓝怎么配的
测蛋白用的考马斯亮蓝配方
称取考马氏亮蓝G250（注意不是R250）50mg，
加95%乙醇25ml溶解，
加85%磷酸50ml，
H2O定容到500ml，
过滤去除少量未溶解物。
4度保存备用。