① 抗体偶联药物（ADC）分析与表征
抗体偶联药物(ADC)作为生物治疗药物的新兴领域，融合抗体、连接子和小分子细胞毒素，展现出独特的优势。ADC的复杂结构与传统抗体药物不同，其复杂性源自抗体种类、偶联方式、连接子与毒素种类等因素。因此，建立ADC分析方法具有特殊性，需针对每类ADC的自身质量属性进行差异化开发，以应对产品安全性和有效性相关的物理、化学、生物或微生物性质的检测需求。关键质量属性包括一级结构、高级结构、纯度与杂质、载药量与药物分布、含量、效价等。ADC产品的质量控制重点关注于载药量与药物分布、游离药物、分子大小变异体和电荷变异体。
DAR（Drug-to-Antibody Ratio）是衡量每个抗体上偶联的小分子药物数量的关键指标，直接影响ADC的疗效和安全性。常规定量方法如光谱（UV-Vis）、色谱（HPLC）和质谱（LCMS）在DAR分析中发挥重要作用。UV-Vis光谱适用于具有紫外可见发色团的有效载荷，其分析需满足抗体部分和载荷部分的光吸收性质差异。HPLC中的疏水色谱（HIC）和反相色谱（RP）分别通过结合和洗脱条件的不同，实现ADC分子的分离和DAR的定量。质谱方法（LC-MS）利用电喷雾电离和飞行时间或Orbitrap技术区分ADC的异质分子物种，提供足够的分辨率。
游离药物是所有ADC共有的重要质量属性，监测其数量有助于评估潜在毒性风险。开发和应用适当的方法来检测、表征和量化游离药物是关键，常规方法包括UV-Vis光谱、HPLC、LC-MS等。
分子大小变异体，如聚集体、片段等，是影响蛋白质疗法疗效和安全性的关键因素。体积排阻色谱（SEC）、光散射（SEC-MALS）等技术可用于分析ADC分子聚合体，非还原/还原毛细管电泳（non-reced/reced Capillary Electrophoresis）则适用于ADC片段的分析表征。
电荷变异体作为关键质量属性，对稳定性和生物活性具有潜在影响。ADC中观察到的与电荷相关的异质性源于多种因素，包括抗体电荷变异性、偶联工艺过程引入的修饰、小分子药物结构以及偶联位点引起的电荷变化等。离子交换色谱（IEX）和等点聚焦电泳（iCIEF）等技术可用于监测电荷变异体。
ADC的分析技术不断进步，为开发人员提供工艺和处方开发所需的信息，同时也确保了质量控制批放行和稳定性测试的稳健性。ADC作为抗癌治疗的潜力药物，通过改进分析技术，为开发更高效、安全的药物提供了关键支持。
② 从牛奶中分离出蛋白质的方法
从牛奶中分离酪蛋白和乳糖
一、引言
牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/l。酪蛋白在乳中是以酪蛋白酸钙-磷酸钙复合体胶粒存在，
胶粒直径约为20～800纳米，平均为100纳米。在酸或凝乳酶的作用下酪蛋白会沉淀，加工后可制得干酪或干酪素。本实验利用加酸，当达到酪蛋白等电点PH=4.7时，酪蛋白沉淀。脱脂乳中除去酪蛋白后剩下的液体为乳清，在乳清中含有乳白蛋白和乳球蛋白，还有溶解状态的乳糖，乳中糖类的99.8%以上是乳糖，可通过浓缩、结晶制取乳糖。
二、实验材料和试剂
脱脂乳或脱脂奶粉。
醋酸-醋酸钠缓冲溶液（PH=4.7），95%乙醇，乙醚，碳酸钙粉末，苯肼试剂。
三、实验步骤
1. 从牛奶中分离酪蛋白
在烧杯中加入2g脱脂奶粉，再加入40ml40℃，PH=4.7的醋酸-醋酸钠缓冲溶液40ml，
用PH精密试纸检验液体的PH值。静置冷却至室温，倾去上层清液（留作分离乳糖用），剩下的悬浮液分别装入两支离心试管中，用转速为2000转/分离心分离3～5分钟，倾出上层清液，（合并于上一清液中），得酪蛋白粗品。于离心管中加入5ml蒸馏水，用玻棒充分搅拌，洗涤除去其中的水溶性杂质（如乳清蛋白，乳糖以及残留的缓冲溶液），离心后弃去上层液，再用蒸馏水洗一次。于试管中加入5ml95%乙醇，充分搅拌，离心后弃去乙醇溶液，用乙醇洗涤主要是除去磷脂类物质。最后再用5ml乙醚以同样方法洗涤，以除去脂肪类物质。将酪蛋白沉淀物凉干，称重、并计算得率。
2. 从牛奶中分离乳糖
在除去酪蛋白的乳清中，加入1.5g CaCO3粉末，搅拌均匀后加热至沸。加CaCO3的目的一方面是中和溶液的酸性，防止加热时乳糖水解，另方面又能使乳白蛋白沉淀。过滤除去沉淀，在滤液中加入1～2粒沸石，加热浓缩至3～5ml，加入10ml 95%乙醇（注意离开火焰）和少量活性炭，搅拌均匀后在水浴上加热至沸腾，趁热过滤，滤液必须澄清。加塞放置过夜，乳糖结晶析出，抽滤，用95%乙醇洗涤产品。
3. 乳糖成脎试验
取自制乳糖溶于少量水中，浓度约为5%，在试管中加入1ml乳糖溶液，1ml苯肼试剂①，摇匀，试管口用棉花塞住，在沸水浴中加热，并不时振摇，加热10～15分钟后，取出放置冷却，乳糖脎成结晶析出。取少量乳糖脎在显微镜下观察其结晶形态，可证实为乳糖。
①苯阱试剂有毒，小心使用，勿触及皮肤，如触及皮肤先用稀醋酸洗，再用水洗。
另外附上：
蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：
（一）材料的预处理及细胞破碎
分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：
1. 机械破碎法
这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。
2. 渗透破碎法
这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。
3. 反复冻融法
生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。
4. 超声波法
使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。
5. 酶法
如用溶菌酶破坏微生物细胞等。
(二) 蛋白质的抽提
通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。
（三）蛋白质粗制品的获得
选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法：
1. 等电点沉淀法
不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。
2. 盐析法
不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。
3. 有机溶剂沉淀法
中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。
（四）样品的进一步分离纯化
用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。