Ⅰ 某蛋白质等电点为8.14,如采用离子交换色谱法来纯化,如何选择填料和缓冲体系
我的话，第一步会选择pH7.0-7.4左右过阴离子交换，让大多数杂蛋白（大多数杂蛋白pI在6左右）、核酸、色素等杂质结合，收集流穿液，此时蛋白溶液的纯度和澄清度会大大提高，再校pH7.0或更低pH过阳离子交换进行纯化。讲究一点的话，在缓冲选择上可以区分一下阴阳离子缓冲，多数情况影响不大，不必纠结。
Ⅱ 在使用离子交换色谱时,应该选择什么样的离子交换剂选择什么样的骨架
离子交换技术：
Sober 和 Peterson于1956年首次将离子交换基团结合到纤维素上，制成了离子交换纤维素，成功地应用于蛋白质的分离。从此使生物大分子的分级分离方法取得了迅速的发展。离子交换基团不但可结合到纤维上， 还可结合到交联葡聚糖（S-ephadex）和琼脂糖凝胶（Sepharose）上。 近年来离子交换色谱技术已经广泛应用于蛋白质、酶、核酸、肽、寡核苷酸、病毒、噬菌体和多糖的分离和纯化。它们的优点是:⑴具有开放性支持骨架，大分子可以自由进入和迅速扩散，故吸附容量大。⑵具有亲水性，对大分子的吸附不大牢固，用温和条件使可以洗脱，不致引起蛋白质变性或酶的失活。⑶多孔性，表面积大、交换容量大，回收率高，可用于分离和制备。
一、基本理论
离子交换剂通常是一种不溶性高分子化合物，如树脂，纤维素，葡聚糖，醇脂糖等，它的分子中含有可解离的基团，这些基因在水溶液中能与溶液中的其它阳离子或阴离子起交换作用。虽然交换反应都是平衡反应，但在层析柱上进行时，由于连续添加新的交换溶液，平衡不断按正方向进行，直至完全。因此可以把离子交换剂上的原子离子全部洗脱下来，同理，当一定量的溶液通过交换柱时，由于溶液中的离子不断被交换而波度逐减少，因此也可以全部被交换并吸附在树脂上。如果有两种以上的成分被交换吸着在离子交换剂上，用洗脱液洗脱时，在被洗脱的能力则决定于各自洗反应的平衡常数。蛋白质的离子交换过程有两个阶段——吸附和解吸附。吸附在离子交换剂上的蛋白质可以通过改变pH使吸附的蛋白质失去电荷而达到解离但更多的是通过增加离子强度，使加入的离子与蛋白质竞争离子交换剂上的电荷位置，使吸附的蛋白质与离子交换剂解开。不同蛋白质与离子交换剂之间形成电键数目不同，即亲和力大小有差异 ，因此只要选择适当的洗脱条件便可将混合物中的组分逐个洗脱下来，达到分离纯化的目的。
Ⅲ 鍏ㄦ槸骞茶揣涓ㄧ诲瓙浜ゆ崲鑹茶氨锛圛EC锛夊師鐞嗐佹搷浣滆佺偣鍙婂簲鐢
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Ⅳ 离子交换层析蛋白纯化
离子交换层析是一种基于不同蛋白质与离子交换树脂上电荷基团可逆结合力的差异进行分离的技术。离子交换树脂是带有电荷基团的高分子聚合物凝胶颗粒，通过这一技术，依据流动相中蛋白质的电荷性质，实现对目标蛋白的分离与纯化。
离子交换树脂主要分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂。阳离子交换树脂带负电，能与阳离子物质结合，通常分为强酸型、中等酸型和弱酸型；阴离子交换树脂带正电，能与阴离子物质结合，分为强碱型、中等碱型和弱碱型。这些树脂的离子交换特性取决于电荷基团的解离度，强酸型树脂对H＊的结合力比Na＋小，弱酸型树脂对H＇的结合力比Na＊大；强碱型树脂对OH 的结合力比CI小，而弱酸型树脂对OH 的结合力比CT大。
离子交换树脂的交换容量反映了其与溶液中蛋白质进行交换的能力，它不仅与树脂本身有关，还与实验条件密切相关。离子交换树脂的总交换容量用每毫克或每毫升交换剂含有可解离基团的毫克当量数来表示，对分离蛋白质的离子交换树脂而言，通常用每毫克或每毫升交换剂能够吸附某种蛋白质的量来表示。
在离子交换层析实验中，选择合适的离子交换树脂对于分离效果至关重要。阳离子交换树脂在等电点pl＜pH条件下与蛋白结合，等电点pl＞pH的蛋白与之结合。强型离子交换树脂使用的pH范围广，适合制备去离子水和分离在极端pH溶液中解离且较稳定的物质。树脂基质的疏水性影响蛋白质的稳定性和分离效果，分离生物大分子时，应选择亲水性基质的交换剂，以温和的方式吸附和洗脱蛋白质，避免破坏生物大分子的活性。
离子交换层析的基本步骤包括离子交换树脂的选择、离子交换层析柱的制备、缓冲液的制备、加样、洗脱以及离子交换柱的再生。在加样过程中，需注意样品液的离子强度和pH，上样量应由交换容量决定。洗脱过程中，采用线性梯度洗脱，通过逐步增大离子强度，使结合在离子交换树脂上的蛋白质组分依次被洗脱下来。洗脱液的选择需保证在整个洗脱液梯度范围内，所有待分离蛋白质组分稳定，并能够被洗脱下来。洗脱速度需保持恒定，以获得较好的分辨率，但需考虑分辨率与洗脱速度之间的关系，以优化分离效果。
在离子交换层析实验中，影响交换容量的因素主要有树脂颗粒大小、颗粒内孔隙大小、离子强度和pH。颗粒大小和孔隙大小影响离子交换树脂与样品组分作用的有效表面积，pH对弱酸和弱碱型离子交换树脂影响较大，而离子强度增大通常导致交换容量下降。通过优化实验条件和参数，可以实现对目标蛋白质的高效纯化。
Ⅳ 离子交换层析速问速答
离子交换层析是一种基于样品的带电性质进行分离的技术，主要用于蛋白纯化。以下为离子交换层析的问答，旨在深入理解该技术。
01、离子交换层析分为哪几种？
离子交换层析根据配基的不同，主要分为阳离子交换层析和阴离子交换层析。阳离子交换柱可以吸附带正电荷的蛋白，而阴离子交换柱则吸附带负电荷的蛋白。
02、如何选择阳离子还是阴离子？
蛋白是两性分子，具有等电点（PI）。当缓冲液的PH值低于蛋白的等电点（PI），蛋白带正电荷时，应选择阳离子交换柱；反之，当PH值高于等电点（PI），蛋白带负电荷时，选择阴离子交换柱。
03、强和弱离子交换剂的区别？
强离子交换剂在PH范围内载量恒定，弱离子交换剂载量随PH变化。优先使用强离子交换剂，若选择性不足，尝试使用弱离子交换剂。
04、如何选择缓冲液的PH值？
建议使用PH 6-8的中性缓冲液。通常，选择与等电点相差1个PH值的缓冲液作为初始尝试。为了达到最佳分离效果，通常需要进行PH条件的摸索。
05、若不知道蛋白的等电点？
大多数蛋白的等电点低于PH 7，可以使用Q柱进行尝试，缓冲液使用PH 7。也可以选择离子交换试剂盒进行摸索。
06、缓冲液的配置？
请参照说明书，注意在添加氯化钠后调整PH。
07、初次实验的标准条件？
开始使用缓冲液A：20-50 mM，洗脱缓冲液B：20-50 mM + 1M NaCl。
08、样品未结合？
可能原因包括：样品盐浓度太高、PH优化不足、缓冲液含有带电物质（如去垢剂）、柱效下降。解决方法包括CIP清洗。
09、结合后无法洗下？
尝试增加洗脱液盐浓度、评估蛋白稳定性、优化PH值。
10、纯度不足？
解决方法包括：采用线性梯度洗脱、优化缓冲液条件、使用更高分辨率产品、增加分子筛、疏水等多步纯化。