每克葡萄糖超滤如何计算

1. 请问什么是活性的超氧化物歧化酶，人工是如何制造出来的

超氧化物歧化酶(SOD) 超滤法生产新工艺

前 言

SOD的中文名称是超氧化物歧化酶，其英文名为Superoxide dimutase，分子量(牛血红细胞) 约 32000 是广泛存在生物体内的金属蛋白醇 ， 别名有 ： orgotein，ormetein，ontosein； Cu.Zn-SOD；Palosein等，SOD被科学家誉为21世纪最有发展前途的药用酶。

一、本工艺是从红细胞，肝和其它哺乳动物组织分离而得的金属酶；含两个亚基，每个亚基各含一个铜原子和一个锌原子，SOD可催化O2，歧化为H2O和O2， 其性质不仅仅取决于酶蛋白，而且还取决于活性部位的金属离子，按金属离子类型不同， 可分为Cu.Zn--SOD和Fe--SOD，Mn--SOD三种.在一般条件下，SOD较稳定. 不同来源的 Cu.Zn--SOD，其紫外吸收光谱略有差异，如牛血SOD在258nm处显示最大吸收，而猪血SOD的最大吸收峰为265nm，在特定条件下，酶的活性可下降，甚至完全丧失， 如氰化物可抑制SOD活性，双氧水使SOD活性下降，氯化胍能明显抑制SOD活性等。

二、SOD用途主要是基于SOD是超氧阴离子清除剂，超氧阴离子(O2~)是人体内有毒物质，它能引起多种疾病，故能清除炎症过程中伴同产生的超氧离子， 而显示出强大的抗炎作用。

在医药工业：SOD可以治疗由于超氧离子引起的各种疾病，如糖尿病，白内障， 风湿性关节炎等，也是消炎的有效药物，而且还能抗衰老，抗肿瘤，抗辐射， 抗自身免疫疾病，现代研究表明：SOD还能治高血压，冠心病，胆囊炎，肺气肿等难治之症. 日用化学工业：由于SOD有防止细胞老化和解毒等功效， 因此在化妆品和护肤剂等工业产品中，添加SOD之后，具有防晒，祛斑，使皮肤柔嫩的作用.是目前化妆品行业中不可缺少的一种添加剂，国内及同行都已出现大量产品.食品工业：在食品添加剂加 SOD之后，增强营养，解除毒性，延长体内细胞寿命，国内已有SOD营养液产品， 并通过上海科研单位有关专家的鉴定。

三、SOD的开发前景：目前SOD在全国仅有少数科研单位及生化制药厂研究和开发本产品，而使用SOD产品厂家却日益增多，远不能满足市场需求 . 为鼓励和大力开发SOD新产品，国家已将其列入重点科技开发项目，并投放大批经费，现已获得成功， 开始向企业化生产转移，市场前景十分广阔。

四、注意事项：(1)我中心热忱欢迎社会各界朋友现场学习，由生化工程师向您授课，通过现场操作，指导，培训，使您尽快掌握该技术。(2)本工艺， 技术资料等不经我公司同意，不得擅自转让，翻印，销售给任何单位和个人，违者法律追究。

新法提炼技术

一、主要设备：(1)工业用离心机一台；(2)恒温水浴锅(10L--50L)(可自制)1台；(3)冰柜1台；(4)搅拌机1台；(5)玻璃器皿：1000ml，500ml烧杯各3只，50ml烧杯 2 只，50ml，500ml量杯各1个；(6)塑料桶若干个。

二、主要试剂：(工业纯度)柠檬酸钠，柠檬酸，葡萄糖，乙醇90%，氯仿，丙酮，氯化钠，磷酸氢二钠，磷酸二氢钠，去离子水或蒸馏水，葡萄糖凝酸胶SephadexG-- 100 和DEAE--纤维素.

三、试剂的配制：

1.抗凝剂配方：(1)柠檬酸钠30g，柠檬酸10g葡萄糖 25g加水至1升，一般此种是每7ml血液，加1ml(抗凝剂).(2)40g/升柠檬酸钠溶液：在1升水中加入0.9克的氯化钠。

2.生理盐水：(0.9%)在91克水中加入0.9克的氯化钠。

3.磷酸盐缓冲溶液的配制：PH7.6，0.2M磷酸盐缓冲溶液，一般用Na2HPO4.H2O，35. 61 克 / 升和NaH2PO4.2H2O 31.21克/升，前者加87.0ml，后者加13.0ml混合后即为PH=7.6 缓冲溶液，如果用K2HPO4.3H2O为45.644g/升，NaH2PO4.2H2O为31.21克/升，仍是前者87.0ml，后者13.0ml混合后即得。

4.冷却剂：在本工艺中有使用-15度低温，一般用如下配方：用33克食盐加入100克雪或碎冰，以此比例配成混合体可达-21.3度。

四、工艺流程

(一)除血红蛋白

1.血液抗凝处理，在新鲜牛、马、猪血中迅速加入ACD1号抗凝剂，并缓慢搅匀，每7毫升血液中加入抗凝剂1毫升或2号抗凝剂。

2.把抗凝处理的血液放入离心机，以3000r/min离心约15--20分钟， 用吸管把上清液(黄色血清)小心吸去抛掉，下层的红血球用2--3倍生理盐水洗2--3次，在每一次洗涤中，用离心机以3000r/min离心，7--8分钟，反复操作后，得到洗涤血红细胞，洗涤后的血红细胞在-15度下冷冻可保存半年并不影响产率和比活，在血液量大， 处理不完时必须这样做。

3.在洗净的红血球中加入等体积去离子水，剧烈搅拌30分钟，使红血球细胞壁砍碎，以使其内的SOD浸出.最好在0--4度静止过夜后，把溶血进行有机提取。

4.接着向溶血中缓缓加入0.2--0.25倍体积的预冷(-15度)95%乙醇和0.1--0.15倍预冷氯仿，搅拌10--15分钟后，原溶血呈浆糊状，静止1--2小时，用滤布除去凝固的血红蛋白，然后将滤液2500r/min离心约1--5分钟留上清液抛去沉淀， 此时如果上清液略为微黄色时，可用快速过滤纸过滤，可得到微带蓝色的清澈透明的粗酶液。

(二)粗酶液的初步提纯：

1.丙酮提醇：向酶液中加0.8倍量预冷(-15度 ) 丙酮 ， 生成大量白色沉淀 ， 以3000r/min离心2分钟收集沉淀，上清液可不必吸取，直接倾倒。

2.热变性：(除杂蛋白)准备好衡温浴锅，在本工艺中，提前30分钟， 注满水接通电源后，使之加热到55--60度以省时间，将沉淀量约50倍量体积比加入0.2MPH=7.6磷酸钠缓冲溶液，水浴加热至60度，15分钟后迅速冷却到室温.3000r/min离心2 分钟得上清液，在上清液中，缓缓滴加0.6倍体积的预冷(-15度)丙酮，生成白色沉淀。

3.初纯SOD：在上述沉淀中加去离子水，制成20--30%SOD溶液，分装入样品瓶中，放入冷冻干燥机中，于开机后以0.2--0.1Torr真空度，约1.5--2小时， 得到化妆或食品用SOD，该产品比活大于3000u/mg，外观呈微带蓝色的白色冻干品。

(三)SOD进一步提纯：

SOD精品一般是把SOD产品经过柱层析，柱层析后的SOD没有小分子等杂质， 层析后为高活性的SOD大分子.SOD精品价格更高，它主要作为生物化学试剂， 化验室标准试剂试用.目前SOD柱层析有两种，二者可单独使用，也可结合使用，一般是DEAE-- 纤维素层析和SephadcxG--100葡聚糖凝胶层析，将(二)2，热变性后SOD丙酮沉淀用PH7.6，0.2MNaH2PO4-NaHPO4缓冲溶液溶解，有不溶的杂蛋白时.离心抛去沉淀，上清液上DEAE--纤维素或SephadsxG--100层析柱(1*20cm或2.5*30cm)，梯度洗脱 ， 洗脱液为PH7.6，0.2M，NaH2PO4--NaHPO4缓冲液，下流速度控制在0.2--0.5ml/min，在分光光度计上用紫外谱325nm处测流出液，合并活力峰，再用蒸馏水反复透析，透析彻底后， 放入样品皿置于冷冻干燥机中干燥后即得SOD精品。

五、注意事项：

1.掌握适当的温度和时间：虽然SOD对热较稳定， 但在分离纯化过程中最好还是采用较低温度，一般以0--10度为宜，时间长不要超过3天。

2.注意提取，提纯方法：使用有机溶剂或者加热均能有效沉淀蛋白质， 但掌握适当溶剂和加热结合的办法可以达到最佳效果。

六、SOD的检测方法：活性检验，比较方便的办法是用连笨三酚自氧化法， 先测得连笨三酚的自氧化速率，然后加入SOD再测得加入SOD之后的氧化速率，按照酶活性单位定义，即在最佳条件下，每分钟抑制连笨三酚自氧化分解速率达50% 的酶量定义为一个酶单位.依次求出活力总值 ，同时也可以用聚丙烯酰胺凝胶电泳来测定其纯度，看其分子量32000左右的一条带是否与有关文献指导一致.

超氧化物岐化酶(superoxide dimutase 简称SOD)是一种重要的氧自由基清除剂，作为一种药用酶，引起国内外生化届和医药届的极大关注。SOD应用于医学临床上可以治疗多种疾病，类风湿性关节炎、心肌梗塞等，在防辐射，抗衰老，抗肿瘤等方面也有积极的作用，而且广泛用于化妆品和食品添加剂的行列。

自1969年Mccord和Fridovich 首次发现从牛血细胞中发现超氧化物岐化以来，到目前为止，国内已有几十家科研单位对SOD作了大量的研究和试产工作，而且有些已批量生产。SOD引起了国内生化界的重视，1988年在浙江宁波如开了《全国首届SOD学术会议》。1989年4月在河南开封《第三届药用酶学术会议》上，SOD被列为重点开发项目，90年7月在大连《全国第二届SOD学术会议》，SOD已作为一种药用酶发展较快，将成为一种很有前途的生化产物。

SOD是一种广泛存于动物、植物和微生物的生物酶，国外药用SOD系从血中提取，国内SOD已开发的品种已超过20种，证明我国对SOD的研究和应用已进入新时期。

我国从牛、马、猪、鸡、狗等动物血中提取SOD来源丰富，成本低，提取和纯化较方便，药细胞膜易破，用常规分离纯化法可获得高纯度的SOD。

本技术采用热变性，超滤新技术，不仅大大简化了工艺过程，而且产品质量和收率都比老工艺有较大的提高，其提取的SOD均为CuZu-SOD。

一、药品与仪器：

(1)柠檬酸三钠：Na3C6H6O7 (2)工业丙酮CaH6O

(3)邻苯本酚 (4)酸磷钾K3Poe4

(5)弱碱性阴离子交换剂DEAE Sephadsxa-50外观40-120ubrd或者DEAE-cell-ujose(DE-32)二乙基纤维素。 (6)冷冻干燥器(自己组配)

(7)层折柱(7.5＊30cm) (8)离心机

以上试剂及其它药剂、仪器可在各省市化学试剂商店、医疗器械商店购买。

二、Cu、Zu-SOD的提取及纯化(牛、马血为例)

1、工业流程：

加抗凝剂 盐洗

鲜牛血--------------------->红血球------------------------>

离心除黄色血浆 加NaCL

热变性1 热变性2

压积红细胞-------------->淡黄色混合液--------------------->

68度30分钟 60-65度20分钟

加丙酮 加丙酮 层析

浅蓝色清液----------->絮状沉淀-------------->沉淀------------>

冻干

透析除盐

洗脱----------------->透析液--------->SOD(冻干品)

2、提取方法

(1)收集红细胞：鲜牛血100升，加入3. 8％柠檬酸三钠抗凝剂搅拌均匀，静置，使红细胞自然沉降，除去上层大部分血浆，下层液再离心除尽其余血浆，再加入3倍量0.9％氯化钠(精制食盐)洗涤两次， 离心可收集到压积红细胞(40升)。

(2)热变性1：收集的红细胞再加入4公斤氯化钠，40克氯化铜，蒸馏水100升搅匀，水浴加热到68度恒温30分钟，迅速冷却加至室温，过滤除沉淀，收集滤液。

(3)热变性2：滤液在65度恒温水浴下，向滤液中慢慢中入40克氯化铜，至滤液清澈变为淡蓝色为止，保温20分钟，迅速冷却至室温，离心去沉淀得上清液。

(4)SOD粗品：超滤心清液加入0.75倍全积的丙酮沉淀， 离心收集沉淀于离于水，离心除去不溶物得清液，清液加入0.75倍体积的丙酮沉淀， 离心收集沉淀，沉淀经无水丙酮洗涤脱水两次，真空干燥得淡蓝色粉末状SOD粗品

(5)SOD粗品提纯：SOD粗品溶于2.5mmol/L，PH值7.6磷酸钾缓冲液，将该混合液上在7.5＊30cm的层柱上，离子换剂为DEAE-SphadexA-50(该柱事先用缓冲平衡)，以100～200ml/小时速度上样，完毕后用同一缓冲A280mm值，低于0.02然后用25～200mmol/L，PH值7.6磷酸钾缓冲液进行直线梯度分段洗脱，流速为100ml/小时。用部分收集器收集， 洗脱液经透析除盐后，得浓缩的透析液，经冷冻干燥，得SOD成品，(呈浅绿色)。

三、SOD活性测定：

SOD的测定方法很多，常见的有化学法，免疫法等电点聚焦法等，化学法测定的原理主要是利用有些化合物如邻苯三酚，在自氧化过程中会产生有色中间物降超氧游离基(O2)这样就可以利用SOD分例(O2)。阻止中间物的积累而测定其酶活性。

1、试剂及仪器

(1)邻苯本酚分析纯，用10mmol/LECL配成50mmol/L溶液。

(2)UV－754紫外分光光度计。

2、测定方法：

(1)邻苯三酚自氧化速度的测定。

在25度、45ml`50mmol/L、PH值8.3、K2HPO4－KH2PO4缓冲液中加入10mmol/L的邻苯三酚，迅速摇匀，倒入光径1cm的比色杯内，在325mm波长下每隔30秒测A值一次，要求自氧化速度控制在0.0700d/mm 左右。

(2)SOD或粗酶抽提液活性测定：

测定方法同测邻苯三酚自氧化速度，在加入邻苯三酚前加入待测SOD样液，测得数据按以下公式计算酶活性。

0.0700－A325mm/min

----------------------------------------＊100％度

0.70

样液稀释倍数 样液稀释倍数

酶活性(u/m1)＝------------＊反应液总体积＊----------------

50％ 样液体积

3、蛋白浓度(mg/ml)和蛋白的计算：

SOD或粗酶抽提液，经280mm紫外比色测定后，查牛轿清白蛋的标准曲线，由此算出每ml含ug蛋白的量。

蛋白浓度＝ug蛋白/ml＊样液稀释倍数＊10负3次方＝mg蛋白/ml总蛋白＝mg蛋白/ml＊原液总体积＝mg蛋白。

4、比活(u/mg蛋白)的计算：

单位活力(u/ml) 总活力

比活＝-----------------------＝-----------------＝u/mg蛋白

蛋白的浓度(mg蛋白/ml) 总蛋白

四、Cu、Zn－SOD性质：

1、Cu、Z n－SOD呈蓝绿色，分子量在3200左右，由两个中一个Cu和一个Zn。

2、对热稳定，天然牛血SOD，75度下加热数分钟其酶活丧失很小。

3、PH值对SOD的影响，SOD在PH5.3～10.5范围内，其催化速度不受影响，PH3.6时SODZn脱落95％，PH12SOD构象发生不可递的构象，导致酶活性丧失。

4、SOD的紫外线吸收特征：SOD在280mm处没有吸收高峰。

5、金属辅其与酶活性。SOD属金属酶Zn仅于分子结构有关，而Cu与催化活性有关。

6、SOD是其具有还有和失活作用的。

五、药品与仪器：

柠檬三钠，分析纯：江苏花桥北工四厂；

工业丙酮：上海溶剂厂；

邻苯三酚，分析纯：贵州遵义化工厂；

六、SOD的包销单位：

(1)河南郑州国营圣科研究所郑州南阳路14号 邮编：450053《河南科技报》91年10月3日

(2)四川省金堂县工艺制品技校生化科接待室：金堂准口执行的院内，政府办公大楼1楼 邮编：610404 联系人：邓勇 彭丽 《四川农村报》 91年3月1日

(3)广东省深圳市上步区石夏东二苍14号科技所 邮编：518031联系人：黄秋林 《科技消息报》92年7月10日

说明：1、资料后附的产品销售地址信息均为我们从近两年的报刊上摘录的各单位广告，并注明有出处。

2、你先看完资料后，行根据自己的实际情况，先小量试验， 并事先联系好产品的收购单位，待取得经验后再批量生产。

3、读者在联系收购单位时，请一定事先去联系，并附上邮资， 待得到明确答复后再根据情况去人办理，千万不要冒然前往，以免造成不必要的经济负担。

4、原料及仪器各地经营原料店供应，广州市人民南路，上九路等地均有供应。

附：详细SOD收购信息

1、广西南宁市生物化学制药厂

地址：鲁班路1号

2、上海生物化学制药厂

地址：海主路513号

3、江苏徐州市生物化学药厂

地址：海沛路86号

4、山东兖州市生物化学制药厂

地址：肉联厂内

5、湖南常德生物化学制药厂

地址：肉联厂内

6、佛山市生物化学制药厂

地址：佛山市

7、广州市明兴制药厂

地址：广州市河南路工业大道北48号

8、广州市白云制药厂

地址：从广州越绣公园坐21路车到三元里北展下车沿着矿泉别墅侧入200米

9、哈尔滨生化药厂哈肉联厂

地址：哈尔滨道外南极街12号院；电话：88423转制药厂

10、沈阳市生物化学制药厂

地址：哈尔滨皇姑区明廉路2号；

11、江苏省南京生物制药厂

地址：江苏省南京市下关区宝塔桥附近；

12、浙江省金华生物化学制药厂

地址：浙江省金华市河盘桥路51号

13、广东生物制药厂

地址：广州市三元里

14、广东汕头市生物化学制药厂

地址：湖山路西巷3号2号；电话：666124

11、江苏省南京生物制药厂

地址：江苏省南京市下关区宝塔桥附近

12、浙江省金华生物化学制药厂

地址：浙江省金华市河盘桥路51号

13、广东生物制药厂

地址：广州市三元里

14、广东汕头市生物化学制药厂

地址：湖山路西巷3号15.上海霞飞日用化工厂

16.北京丽源日用化工厂

17.南京化妆品厂

18.上海日用化学品二厂

19广州美容化妆品厂

20南京第二药物化学制药厂

上海永芳日用化学品厂

广州化妆品厂

杭州市凤喜化妆品厂

上海日用化学品四厂

天津市津乐制药厂

杭州第一生物化学制药厂

上海药物研究所实验药厂

天津市南开区美容化妆品厂

苏州市昊县生物化学厂

上海生物化学制药厂

天津生物医学技术开发中心

上海香海美容品厂

北京日用化学品四厂

武汉市辛安渡制药总厂

湖北沙市生化制药厂

北京市三露厂

注各大制药厂化妆品厂美容院均为销售对象

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2. 如何建立新药的细菌内毒素检查方法

[摘要] 目的：建立新药的细菌内毒素检查方法。方法：采用鲎试验检查法对新药中的细菌内毒素进行检查。结果：介绍了如何建立新药的细菌内毒素检查方法，重点是细菌内毒素检查限值的确认以及如何进行干扰试验。结论：细菌内毒素检查法为新药的质量控制以及应急检验提供了有益的基础。

[关键词] 新药；细菌内毒素检查法；干扰试验
[中图分类号] R927.12 [文献标识码] B [文章编号] 1673-7210（2011）11（b）-159-03

How to establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs
XIAO Guinan, SUN Qingping, SHENG Yingmei
Guangdong Institute for Drug Control in Guangdong Province, Guangzhou 510180, China
[Abstract] Objective: To establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs. Methods: Tachepleus amebocyte lysate test was applied to detect bacterial endotoxins in new drugs. Results: How to establish the method of bacterial endotoxin test for new drugs was introced, and especially focused on how to define the limit of bacterial endotoxins and carry out the interference test. Conclusion: Bacterial endotoxin test provides useful bases in quality control and emergency test for new drugs.
[Key words] New drugs; Bacterial endotoxin test; Interference test

新药以细菌内毒素检查方法代替既往的家兔热原检查法是一个趋势，在药害事件的应急处理中有一定的应用价值，这也符合国际上对动物实验的“3R”原则（优化、减少、替代）的要求。现行细菌内毒素检查方法是1968年美国科学家Levin和Bang所建立的鲎试验法[1]。从开展内毒素检查的现状来看，部分单位未能参照《中国药典》2010年版二部的要求进行实验和设计，本文着重介绍在建立新药细菌内毒素检查法中容易出现问题的细菌内毒素限值的确定及干扰试验这两个环节，力图为新药的质量控制以及应急检验提供有益的参考依据。
1 新药细菌内毒素检查限值的确认
1.1 细菌内毒素检查限值的计算公式
新药细菌内毒素检查限值（L）的确定是整个方法学建立的前提和基础，现在一般按照《中国药典》2010版二部附录XI E进行确定[2]。计算公式为L=K/M，K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg・h）表示，非放射性注射剂K=5 EU/（kg・h），放射性注射剂K=2.5 EU/（kg・h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg・h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，成人体重按60 kg计算，体表面积为1.62 m2。部分抗肿瘤药物及抗生素的使用剂量以体表面积描述时，可将每平方米体表面积剂量乘以0.027，即可转换为每千克体重剂量。
1.2 细菌内毒素检查限值的确认程序
首先根据所研究的新药品种说明书，通过查阅最新版《临床用药须知》等相关权威资料，得到人用每千克体重每小时的最大供试品剂量（M值）并求出L值，将所求得的L值与相关的质量标准（《美国药典》、《英国药典》、《日本药局方》、《欧洲药典》）以及国家食品药品监督管理局颁布的转正标准或注册标准散件中关于该品种的细菌内毒素限值进行参考对比。
还有一种方法是参考该品种的热原检查剂量（可视为M值），因为热原剂量的设置一般为成人临床用量的1～3倍，与常用的安全系数3～10倍较为接近，这种参考热原检查剂量的做法在以前颇为盛行，现在已逐渐少用。
1.3 细菌内毒素限值计算的常见误区
1.3.1 将成人日均用量误作最大用量 大多数情况下，说明书或资料往往只提供了某药的单次或每日用量，实践中不少人往往将单次用量误作最大用量进行限值计算，所得限值明显偏宽。众所周知，除极少数情况（急性、重症患者用药）下的单次用量可作为最大用量外，多数情况的日常用量换算成最大用量，还需考虑一定的安全系数（一般取3～10倍）。
1.3.2 误将每日总用量当成每次最大用量 只根据说明书或资料提供的某药的每日总用量，未考虑该药品总量的静脉滴注时间已经远不止1 h，这样求得的限值难于真实反映实际限值，因为M值是反映人用每千克体重每小时能接受的最大供试品剂量，而非全日的总用量。
1.3.3 对于大输液的细菌内毒素限值确定过于按部就班 没有考虑大输液的特殊要求，大输液的主药成分只占其中很少的一部分，实际多为葡萄糖注射液或生理盐水注射液，如果按主药成分计算细菌内毒素限值的话，容易偏宽，因而如无特殊情况一般将热原检查剂量10 ml/kg视为最大临床用量，将大输液细菌内毒素限值定为0.5 EU/ml。
1.3.4 忽视滴注时带入的外源性细菌内毒素 某些新药在临床使用时是溶于大输液进行滴注的。假设某抗生素药品的规格是1 g/支，其使用方法是溶于5%葡萄糖注射液250 ml，在1 h内滴注完毕。可参照下述方法计算该抗生素细菌内毒素限值，此时K=5 EU/（kg・h），因而60 kg的成人每小时体内可以接受细菌内毒素的最大量为300 EU，而在1 h内250 ml的5%葡萄糖注射液最大可带来125 EU的细菌内毒素，1 g的该药最多只能带入175 EU（125～300 EU）的细菌内毒素，因而该抗生素其细菌内毒素限值可定为0.175 EU/mg。如果按常规计算的话，求得限值为0.300 EU/mg。
1.3.5 没有考虑到主药外的其他成分 在细菌内毒素限值的确定过程中，特别是原料，要注意扣除主药外的其他成分（如金属离子：头孢噻肟钠中的钠，西司他丁钠中的钠），因为标准一般规定为每毫克中头孢噻肟或西司他丁所含的细菌内毒素量不得过多少EU，而制成的原料往往是含钠等其他成分的。
2 鲎试剂灵敏度复核试验
2.1 前期准备工作
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。若使用塑料器械，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。耐热器皿常用干热灭菌法（250℃，30 min以上）去除，部分物品也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法（如强酸强碱浸泡法），但需经过确证不干扰鲎试验检查。
2.2 灵敏度复核试验

当使用新批号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。需要注意的是，当实测灵敏度λc在0.5λ～2.0λ（包括0.5λ～2.0λ，λ为鲎试剂灵敏度的标示值）时，方可用于细菌内毒素检查，并以标示灵敏度λ为该批鲎试剂的灵敏度，日常检验中部分检验者误将实测的灵敏度作为批鲎试剂的灵敏度来进行常规检查或干扰试验。
3 鲎试验检查的干扰试验
3.1 最大有效稀释倍数（MVD）的确认
MVD是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数，计算公式为MVD=C・L/λ，式中L为供试品的内毒素限值，λ为鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml），或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度；C为供试品液的浓度，当L以EU/ml表示时，则C等于1.0；如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C=λ/L。
此处往往根据市售主要的鲎试剂灵敏度范围（0.03～1.00 EU/ml）来计算干扰试验中的有效浓度稀释范围。
3.2 干扰预试验
取本品1支（原料精密称取不低于10 mg的量），按照拟定内毒素限值，原料或注射用粉针加内毒素检查用水溶解并稀释至不超过MVD规定的系列浓度，注射液直接稀释至不超过最小有效稀释浓度的系列浓度，预试验时一般可取一个厂家灵敏度为0.125 EU/ml或0.250 EU/ml的鲎试剂，对供试品原液及其系列稀释液（供试品阴性对照，NPC）进行干扰检验，另外设立阳性对照（PC）、阴性对照（NC）、供试品阳性对照（PPC），每个浓度平行做两管，最终得出供试品（批号：20100802）在某浓度及以下浓度对鲎试验检查不产生干扰作用（PPC首次出现“++”的浓度）的结论。供试液的干扰预试验结果，见表1。
由表1可以看出，供试品在不高于20 mg/ml的浓度下不干扰鲎试验的检查。
3.3 正式干扰试验
按表2制备各系列溶液，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且不超过MVD的溶液，参照鲎试剂灵敏度复核试验项下操作，记录供试液的干扰情况。

只有当供试品溶液和阴性对照溶液的平行管都为阴性，且鲎试剂标示灵敏度的对照系列溶液的结果在鲎试剂灵敏度范围内时，试验方为有效，计算系列鲎试剂标示灵敏度的对照系列溶液和干扰试剂系列溶液的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。当Es在0.5λ～2.0λ及Et在0.5Es～2.0Es时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步稀释，再重复干扰试验。
当进行新药的内毒素检查试验前或无内毒素检查项的品种建立内毒素检查法时，须进行干扰试验；当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发生了任何有可能影响试验结果的变化时，须重新进行干扰试验。
4 排除供试液干扰的方法[3]
4.1 样品稀释法
选用较高灵敏度的鲎试剂，将供试品进一步稀释（低于最大有效稀释倍数）后进行干扰试验，一般情况下大部分的干扰作用均能得到有效控制。
4.2 调节pH法
测定供试液的pH值，若不在鲎试剂的有效缓冲pH范围（6.0～8.0），可选用一定浓度的HCl或NaOH将pH值调节至6.0～8.0，但要注意应进行方法学验证（干扰试验），确保不干扰鲎试验检查，且对内毒素检查结果无影响。
4.3 超滤法
通过专用超滤系统，将影响内毒素检查的药物小分子杂质滤除，内毒素则留存于滤器内，滤器内加入相应的内毒素检查用水进行检查，可在几乎不影响内毒素浓度的前提下尽量避免小分子药物的干扰作用。
4.4 其他方法
微温保持加热法；使用去G因子鲎试剂或厂家提供的专用抗增液对样品进行稀释（此时须进行干扰试验）。
5 常规检查
使用最大有效稀释倍数（MVD） 并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液供试品溶液和供试品阳性对照溶液，进行细菌内毒素的常规检测。
6 讨论
建立新药品种的细菌内毒素检查法，首先要结合临床最大用量确定其细菌内毒素限值，应用两个厂家的鲎试剂对3批样品进行鲎试验检查（普通凝胶法或动态浊度法定量试验），如结果能证实样品在不低于最大有效稀释浓度时对细菌内毒素检查无干扰作用，且样品的细菌内毒素常规检查结果为阴性，此时方可建立该品种的细菌内毒素检查法[4-7]。
根据临床最大用量规定及实验结果，将所研究的新药细菌内毒素限值定为每毫克主药（或每毫升）中含内毒素的量应小于若干EU。经干扰实验确证，该新药在某个浓度或低于该浓度时（但不低于最大有效稀释浓度MVC）对细菌内毒素检查无干扰作用。取本品3批，按拟定的标准检验，其内毒素检查结果均符合规定。

3. 果酒鉴别的基本方法是什么

由于梨皮较厚，肉质坚硬，石细胞含量多，因而破碎工序是提高出汁率的重要工序，破碎果块的大小要适宜，一般为3～4毫米。为防止果实与空气接触发生氧化褐变，破碎工序要采取护色措施，可加入50～70 mg/ L SO2 + 10 mg/ L Vc 。
榨汁：由于果实中果胶含量较高，破碎后直接取汁时出汁率低，且汁液混浊，可加入0.2％的果胶酶使果胶分解，酶解温度35～45℃，处理2小时。杀菌：为达到果酒的生物稳定, 果实榨汁后要马上添加SO2以抑菌, 或榨汁后进行巴氏杀菌, 巴氏杀菌同时还可起到抑制酶活性的作用成分调整：（1）浓缩原汁：原梨汁本身的总糖含量低, 直接发酵酒精度偏低, 为了提高酒精度, 在原梨汁中加入原汁量5%的果胶酶,酶解后，调整总糖含量。调糖可采用加入白砂糖和浓缩梨汁的方法，用18g转化为1°酒，计算制作12°酒需要加的白砂糖，充分摇晃使分布均匀。（2）调酸加入一定量亚硫酸钠, 当果汁中含有0.1%的二氧化硫时，即可抑制杂菌活动。甜酒0.8%-1%，一般PH>3.6或可滴定酸<0.65%时加入柠檬酸调整酸度，以利正常发酵。
活化酵母：添加0.3%-0.5%活性干酵母，使用前应放入3%-5%的葡萄糖溶液，37℃水浴0.5-1h后添加到果汁中，30℃的发酵温度，充分发酵5天。在发酵过程中, 每天定时对梨酒中的还原糖和酒精度进行测定, 直至还原糖和酒精度变化很小, 结束发酵。发酵中每天要轻轻摇瓶一、二次，将泡帽摇入发酵酒液中
陈酿、倒灌：主发酵结束，及时进行酒渣分离，防止酒、渣接触时间过长而产生较大的苦杂味。分离后，进入后发酵即陈酿阶段，继续完成残糖发酵、产生香味和老熟。其温度的掌握是低于主发酵温度。此阶段（约10天）形成的沉渣即酒脚，因其中的酵母菌体开始死亡自溶，会影响酒的风味和导致蛋白质浑浊，也要及时倒桶除去。在此后，一般要再倒一次桶，间隔时间可以延长。倒桶后要装满酒液，并用酒精或酒渣（脚）蒸馏的白酒封口，防止杂菌污染和空气氧化增强了酒的营养和保健功能。或用硅藻土澄清法：用量不超过420克／1000升；明胶—单宁法：0.5％的明胶液和1％的单宁液的最适用量分别为7.5％和7％
过滤：澄清后的梨汁还需除去沉淀及不稳定的悬浮颗粒，可用硅藻土过滤机过滤，硅藻土用量0.01％左右，采用0.3～0.35兆帕的过滤压力。板框式过滤机、超滤设备、薄板过滤、微孔薄膜过滤。

4. 白酒有什么营养为什么那么多人喝

白酒对身而言没有营养可言，但适量地喝些白酒对身体会有下列好处：
1.使循环系统发生兴奋效能。
2.有失眠症者睡前饮少量白酒，有利于睡眠。
3.能刺激胃液分泌与唾液分泌，起到健胃作用。
4.有通风、散寒、舒筋、活血作用
5.适量饮用可延缓衰老、预防心脑血管病、预防癌症。

5. 得尿毒症国家有什么补助政策吗

尿毒症不是什么神秘的疾病，它是所有慢性肾脏病进入晚期的统称，医学专业术语称之为“慢性肾功能衰竭”。晚期肾脏病可以涉及到多个方面的功能紊乱，如水、电解质平衡与酸-碱平衡的紊乱、心与肺功能的下降、造血功能的下降、矿物质与骨代谢功能异常带来的骨质疏松、内分泌、免疫功能紊乱引起的月经异常和全身抵抗力下降等。那么尿毒症该如何治疗呢？

一、饮食治疗

尽量避免摄入含植物蛋白较高的食物，尽可能进食高生物价值的优质蛋白。其摄入量应根据肾小球滤过率（GFR）作适当调整：GFR为10～20 ml/min时，予以低蛋白饮食(LPP)，蛋白量0.6g/㎏/d)，可基本满足生理需要，并能减轻尿毒症症状，延缓肾功能不全的进展；GFR＜5ml/min者，蛋白量应控制在20g/d左右。尿毒症的饮食治疗具体概括为以下几点：1.合理的低蛋白饮食；2.充分的热量摄入；3.必需氨基酸、a-酮酸的合理摄入；4.各种营养素摄入的综合平衡和某些特殊营养素（如铁、锌等微量元素，L-肉碱等）的额外补充；5.改善食欲，以保证营养素的足量摄入；6.改善机体内环境，纠正各种营养素的代谢至基本正常，或恢复正常。

二、多休息，避免体力劳动和时间过长的锻炼

尿毒症患者合理锻炼是必须的，但运动强度及频率应依据肾功能状态因人而异，最好在专业医护人员指导下进行。

三、药物治疗

1.纠正代谢性酸中毒主要为口服碳酸氢钠(NaHCO3)，必要时静脉输入。2.高钾血症的防治首先应积极预防高钾血症的发生。在限制钾摄入的同时，还必须注意及时纠正酸中毒，以防止细胞内钾向细胞外转移；部分病人可适当应用利尿药，增加尿钾排出，口服降钾树酯增加肠道钾排出，以更有效的防治高钾血症发生。3.低钾血症的防治由于摄入不足、胃肠道丢失（呕吐、腹泻）、补碱过多、利尿过度等原因，患者发生低钾血症并不少见。部分透析患者因透析液中失钾过多，且未能及时补充者，也易发生低钾血症。可给予口服补钾，或根据需要考虑并予以静脉滴入葡萄糖氯化钾溶液。4.纠正肾性贫血临床上提倡使用促红细胞生长素（EPO）小剂量每周每千克体重150u皮下注射，使血红蛋白逐渐上升，并维持在100～120g/L水平。使用过程中80%～90%患者需补充铁剂、叶酸等造血原料。

四、肾脏替代治疗

1.血液透析利用半透膜原理，将患者血液与透析液同时引进透析器，在透析膜两侧作反方向流动，借助膜两侧的溶质梯度，渗透梯度和水压梯度，通过扩散、对流、吸附以清除溶质中的毒素；通过超滤和渗透清除体内潴留过多的水分；同时补充身体需要的物质，纠正电解质和酸碱平衡的紊乱。血液透析一般每周做2～3次，每次4～5小时，每次透析时间的长短视透析膜性能及临床病情综合决定。2.腹膜透析利用腹膜作为半透膜，通过腹膜透析导管向腹腔内注入透析液，借助腹膜两侧的毛细血管内血浆和腹腔内的透析液中的溶质浓度和渗透梯度，通过弥散和渗透原理以清除机体代谢废物、毒物和过多的水分（随废旧透析液排除体外），纠正电解质紊乱。3.肾移植成功的肾移植会恢复正常的肾功能(包括内分泌和代谢功能)，肾可由捐献者或亲属供肾（由兄弟姐妹或父母供肾），亲属肾移植的效果较好。肾移植需长期使用免疫抑制药，以抗排斥反应。